丙泊酚對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖/凋亡的影響及其分子機制

王 鵬，郝 偉，張 穎，任立潔，張艷莉，單世民

實驗研究

丙泊酚對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖/凋亡的影響及其分子機制

王 鵬，郝 偉，張 穎，任立潔，張艷莉，單世民

目的：研究丙泊酚對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖和凋亡的影響及其相關分子機制。方法：將原代大鼠肺動脈平滑肌細胞接種在培養(yǎng)孔板，并隨機分為對照組（C組）、丙泊酚2 μg/mL組（F1組）、丙泊酚5 μg/mL組（F2組），處理時間為24、48、72 h，收集對應細胞進行細胞增殖、周期和凋亡的檢測，并收集對應的RNA和蛋白，利用熒光定量PCR和免疫印跡Western Blot檢測細胞增殖/凋亡標志物PCNA、Bax的表達。結果：丙泊酚對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的抑制率及凋亡的促進率具有時間和濃度依賴性；MTT實驗證明，5 μg/mL組的丙泊酚可顯著抑制大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖，同時抑制PCNA的mRNA和蛋白表達（二者下降比率為40%）；流式細胞術證實，5 μg/mL丙泊酚可誘導大鼠肺動脈平滑肌細胞的周期抑制和凋亡，并上調促凋亡蛋白BAX表達（上調比率為3.6倍）。結論：5 μg/mL濃度的丙泊酚在體外可有效抑制大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖并誘導細胞凋亡。

丙泊酚；肺動脈平滑肌細胞；增殖；凋亡

丙泊酚具有抑制多種腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡的作用[1-2]。以丙泊酚處理結腸癌細胞和乳腺癌細胞，可明顯抑制其侵襲能力[3-4]。丙泊酚對腫瘤細胞生物學行為的影響及分子機制尚不明確，其對正常細胞特別是對肺動脈平滑肌細胞的影響鮮有報道。作為常用的靜脈鎮(zhèn)靜催眠劑之一，長期、高劑量使用丙泊酚是否也會對正常肺動脈平滑肌細胞造成損害，目前研究尚不清楚。本研究探討不同劑量丙泊酚對平滑肌細胞增殖和凋亡的影響，以期為臨床用藥提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 大鼠肺動脈平滑肌細胞制備 大鼠肺動脈平滑肌細胞（primary rat pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）采用胰蛋白酶消化后經聯合組織貼塊培養(yǎng)，最終使用免疫細胞化學和免疫熒光染色對細胞進行鑒定。具體操作按照文獻方法[5]。

1.2 試劑 丙泊酚購自Sigma-Aldrich公司，產品編號D126608。MTT購自Sigma-Aldrich公司，產品編號M2128。Bax、PCNA和actin抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.3 MTT細胞增殖檢測 大鼠肺動脈平滑肌細胞以每孔2000個細胞鋪種在96孔板中，待細胞貼壁后分3組處理：對照組（C組），丙泊酚2 μg/mL組（F1組）和丙泊酚5 μg/mL組（F2組）。分別在24 h、48 h和72 h在每孔加入濃度為0.5λ的MTT各10 μL。將細胞置于37℃培養(yǎng)箱保溫3 h，用真空泵吸出培養(yǎng)基，再加入100 μL DMSO溶解沉淀，搖床均勻搖晃板子0.5 h，OD570檢測吸光度。作圖并進行統(tǒng)計學檢驗。

1.4 細胞周期凋亡檢測 用不同濃度丙泊酚處理過的大鼠肺動脈細胞經過消化離心，用300 μL預冷的PBS重懸于5 mL離心管中，在漩渦振蕩器上低速以5 s一滴的速度緩慢滴入共700 μL提前預冷的無水乙醇，-20℃放置過夜。經過PI和RNaseI混合染料在37℃水浴染色1 h，在通過流式細胞儀進行細胞周期和中晚期凋亡檢測。實驗共重復3次，分別用ModFit和Flowjo軟件對流式結果進行分析、作圖。

1.5 RNA提取和實時熒光定量PCR 對用不同濃度丙泊酚處理過的大鼠肺動脈細胞，分別加入Trizol裂解液提取總RNA并保存于-80℃冰箱。利用Promega公司的總RNA反轉錄試劑盒進行反轉錄合成cDNA。實時熒光定量PCR在ABI公司的ABI 7500系統(tǒng)上進行，定量檢測PCNA的mRNA表達情況，actin被用作內參基因，所用引物均合成自華大基因公司。

1.6 蛋白印跡檢測 對用不同濃度丙泊酚處理過的大鼠肺動脈細胞，經過碧云天公司的RIPA裂解液裂解，提取細胞總蛋白。各樣品經過定量，分別取60 μg進行SDS-PAGE。經過硝酸纖維素膜轉膜，再用5%BSA屏蔽非特異性結合，依次孵育一抗及二抗，用ECL顯色液顯影檢測細胞中BAX的蛋白表達。同樣以actin作為內參。

1.7 統(tǒng)計學處理 本研究中用到的統(tǒng)計學檢驗均由SAS軟件v9.2完成。所有數據均以()表示，兩組數據間的比較采用成組t檢驗，P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異。對細胞周期和細胞凋亡的結果進行了重復測量方差分析。

2 結果

2.1 MTT法檢測丙泊酚對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的影響 C組與F1、F2組比較，細胞增殖較為活躍。F1組與C組比較，增殖在72 h時受到一定程度的降低，但未有統(tǒng)計學差異。在較高劑量的F2組中，48及72 h時間點下細胞增殖速度較C組顯著下降（P＜0.05）圖1。流式細胞術顯示，丙泊酚處理72 h后，三組細胞周期分布存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05），表1。提示高劑量的丙泊酚長期作用于大鼠肺動脈平滑肌細胞后，可抑制其正常增殖活性和周期進程，對增殖的抑制率具有時間和濃度依賴性。

圖1 丙泊酚對大鼠肺動脈平滑肌細胞增殖的影響

表1 丙泊酚對大鼠肺動脈平滑肌細胞周期的影響

2.2 流式細胞術測定丙泊酚對大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡的影響 低劑量（2 μg/mL）丙泊酚處理48 h，可使細胞凋亡增加12%。以高劑量（5 μg/mL）丙泊酚處理48 h，細胞凋亡比例較C組增加31%（P＜0.05），表2。高劑量丙泊酚對于正常肺動脈平滑肌細胞具有損傷作用。

表2 丙泊酚對大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡的影響

2.3 不同劑量丙泊酚處理對增殖和凋亡標志物PCNA、Bax的調節(jié) 熒光定量PCR的結果顯示，與C組比較，F1、F2組細胞中增殖標志物PCNA的mRNA表達隨丙泊酚濃度增加而下降，其中F1組較C組差異不顯著(P＞0.05)，F2組較F1及C組具有顯著性差異(P＜0.05)，即高劑量的丙泊酚處理可下調PCNA的mRNA表達（圖2A）。免疫印跡Western blot實驗證實，在F2組細胞中觀察到PCNA蛋白顯著下降和Bax蛋白的顯著上調，從蛋白層面支持凋亡發(fā)生（圖2B）。

圖2 不同劑量丙泊酚處理對大鼠肺動脈平滑肌細胞的增殖凋亡標志物PCNA、Bax的影響

3 討論

丙泊酚是臨床常用的靜脈鎮(zhèn)靜催眠劑，同時廣泛應用于各種手術的麻醉誘導。有效成分是2,6-二異丙酚，水溶性較差，市售丙泊酚一般為脂溶劑。新近的實驗數據表明，丙泊酚具有抗腫瘤作用，包括直接或間接抑制細胞增殖和生存能力、誘導細胞凋亡及抑制侵襲遷移[6-7]。有報道顯示，5 μg/mL丙泊酚處理肝癌細胞系HepG2后，該細胞的克隆形成率和愈合率顯著下降，凋亡率顯著上升[8-9]。在肺癌細胞HCC827細胞中，低劑量的丙泊酚（1.5 μL/mL）處理可抑制細胞增殖并誘導凋亡，且這一過程與細胞內Nrf2的激活表達有關[10]。以丙泊酚處理結腸癌細胞LOVO可抑制其侵襲能力[11]，也有人報道34 μmol/L丙泊酚處理可增強乳腺癌細胞MDA-MB-468的侵襲[12]。丙泊酚對腫瘤細胞生物學行為的影響及分子機制尚不明確，其對正常細胞特別是對肺動脈平滑肌細胞的影響更無研究。

目前，大部分研究認為，采用丙泊酚作為手術麻醉藥物，一方面可發(fā)揮重要的麻醉作用達到手術的目的，另一方面根據體外的研究結果推測，丙泊酚可能對腫瘤患者的腫瘤細胞增殖和凋亡有良好的調節(jié)作用[13-15]。然而，由于丙泊酚對腫瘤細胞表型及功能影響的分子機制未明，其對正常體細胞是否也具有殺傷作用也值得關注。

本研究以大鼠肺動脈平滑肌細胞為研究對象，研究了高、低劑量的丙泊酚處理后，其對正常肺動脈平滑肌細胞的增殖能力和凋亡的影響。結果證實，在增殖方面，以高劑量的丙泊酚處理時間長達48～72 h時會顯著抑制細胞增殖，這一抑制作用與細胞內PCNA的mRNA和蛋白下調表達具有相關性。在周期和凋亡方面，高濃度的丙泊酚處理48 h時可誘導較多的細胞周期抑制和細胞凋亡，這一促進凋亡作用與細胞內Bax蛋白水平升高有關。由于實驗設計的局限性，本研究未能得到丙泊酚處理對大鼠肺動脈平滑肌細胞的在體效果，藥物處理濃度和時間與臨床使用習慣是否一致也不清楚，同時其抑制增殖和誘導凋亡的機制尚存有許多未知途徑，需要后續(xù)工作繼續(xù)探索和挖掘。

本研究通過體外實驗證實，高劑量的丙泊酚可有效抑制大鼠肺動脈平滑肌細胞的增殖并誘導細胞凋亡，這一作用的發(fā)揮與細胞內下調表達的PCNA與上調的Bax蛋白相關。提示其作為手術麻醉藥物，在高劑量長時間處理下對正常細胞具有一定的損傷作用。

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（收稿：2016-05-10 修回：2016-12-20）

（責任編輯 李文碩 屈振亮）

Study of Propofol on Growth and Apoptosis of Rat Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells and the Re-lated Mechanisms

WANG Peng,HAO Wei,ZHANG Ying,et al.Department of Anesthesiology,Tianjin 5th Center Hospital,Tianjin(300450),China

ObjectiveTo study the effects and related molecular mechanisms of propofol on growth and apoptosis of rat pulmonary artery smooth muscle cells.MethodsRat pulmonary artery smooth muscle cells were seeded in culture plates and treated with propofol(0,2,4～5 μg/mL)for 24 and 48 hours.Then,cells were harvested for measuring cell growth,cell cycle and apoptosis rates.RNA and protein were also extracted for real-time PCR and western blotting analysis of PCNA and BAX expression,respectively.ResultsPropofol could significantly induce growth inhibition and apoptosis in rat pulmonary artery smooth muscle cells at a concentration-and time-dependent manner.MTT assay showed that 5 μg/mL propofol could suppress growth of rate pulmonary artery smooth muscle cells,and reduce the mRNA and protein expression of PCNA(both at an approximate 40%reduction rate).Also,flow cytometry showed that propofol at high dose could induce cell cycle arrest,elevate the apoptosis rate of pulmonary artery smooth muscle cells,and meanwhile up-regulate the BAX protein expression in the treated groups(at an approximate 3.6-fold up-regulation).ConclusionPropofol at 5 μg/mL could suppress growth and promote apoptosis of rat pulmonary artery smooth muscle cells in vitro.

Propofol;pulmonary artery smooth muscle cells;growth;apoptosis

Q95-33；R971+.3

A

1007-6948(2017)01-0057-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.01.016

天津市衛(wèi)生局科技基金項目（2014ZK016）天津市第五中心醫(yī)院麻醉科（天津 300450）

單世民，E-mail：wangpang776@163.com