PI3K/Akt途徑在MMC誘導(dǎo)的肝干細(xì)胞凋亡中的作用*

劉暉杰，許 丹，彭 榮

1湖北省文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院腫瘤科，襄陽 441021 2湖北省武漢市中醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430014 3湖北省宜城市醫(yī)院腫瘤科，宜城 441400

實(shí)驗(yàn)研究

PI3K/Akt途徑在MMC誘導(dǎo)的肝干細(xì)胞凋亡中的作用*

劉暉杰1，許 丹2，彭 榮3

1湖北省文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院腫瘤科，襄陽 4410212湖北省武漢市中醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 4300143湖北省宜城市醫(yī)院腫瘤科，宜城 441400

目的 探討PI3K/Akt途徑在絲裂霉素(mitomycin，MMC)誘導(dǎo)的肝干細(xì)胞凋亡中的作用。方法 用MMC刺激大鼠肝干細(xì)胞，觀察MMC刺激不同時間(6、12、24 h)對WB-F334細(xì)胞凋亡率的影響，以及不同濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)的MMC對WB-F334細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，加入磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)抑制劑曲西立濱(triciribine，API-2)和p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)抑制劑SB203580后觀察MMC對WB-F334細(xì)胞凋亡率的影響，探討MMC調(diào)節(jié)WB-F334細(xì)胞凋亡的信號途徑。結(jié)果 MMC對WB-F334細(xì)胞凋亡率的影響隨作用時間延長而上升(P<0.05)；與對照組比較，不同濃度的MMC對肝干細(xì)胞有明顯細(xì)胞毒作用，且隨著MMC濃度的升高而上升；Western blot檢測結(jié)果顯示：MMC刺激WB-F334細(xì)胞15 min后MAPK、Akt均發(fā)生磷酸化，且隨著時間延長而減弱，60 min后磷酸化消失，說明p38 MAPK及PI3K/Akt途徑能夠被MMC激活；當(dāng)MMC處理的細(xì)胞加入了p38 MAPK抑制劑后，抑制劑處理組中細(xì)胞的凋亡率與MMC處理組并無顯著差異(P>0.05)，說明MAPK途徑對MMC誘導(dǎo)WB-F334細(xì)胞凋亡并沒有明顯的作用；而當(dāng)MMC處理的細(xì)胞加入了Akt抑制劑后，Akt抑制劑處理組中細(xì)胞的凋亡率與MMC處理組相比顯著降低(P<0.05)，表明PI3K/Akt途徑對MMC誘導(dǎo)WB-F334細(xì)胞凋亡有明顯的作用。結(jié)論 MMC能夠刺激肝干細(xì)胞WB-F334發(fā)生凋亡，而其誘導(dǎo)凋亡的作用是通過激活PI3K/Akt信號通路實(shí)現(xiàn)的。

肝干細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 絲裂霉素； 磷脂酰肌醇-3激酶； 蛋白激酶B； 信號通路

之前的研究表明肝干細(xì)胞可促進(jìn)肝組織損傷后再生，增強(qiáng)機(jī)體的肝功能自修復(fù)效果。肝組織內(nèi)許多細(xì)胞因子能夠調(diào)控肝干細(xì)胞分化、增殖[1]，可顯著促進(jìn)肝干細(xì)胞再生、生長及凋亡，因此一旦這些因子的表達(dá)出現(xiàn)異常，很可能影響肝功能并引起肝臟疾病。

絲裂霉素(mitomycin，MMC)由鏈霉菌提取，化學(xué)結(jié)構(gòu)含有苯醌、乙酰亞胺基及氨甲酰，可與DNA鏈形成交聯(lián)，從而抑制細(xì)胞DNA復(fù)制[2]，可誘導(dǎo)胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、非小細(xì)胞肺癌及乳腺癌等腫瘤細(xì)胞凋亡。磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)作為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要信號途徑之一，其功能可能受到MMC調(diào)控[3]，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本文通過研究PI3K/Akt和絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPK)信號途徑對MMC誘導(dǎo)大鼠肝干細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

從美國Sigma公司購置大鼠肝干細(xì)胞WB-F334、MMC、p38 MAPK抑制劑SB203580、PI3K/Akt抑制劑曲西立濱(triciribine，API-2)。DMEM培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Gibco公司，DNM-9602酶標(biāo)分析儀購自上海精密儀器儀表有限公司，流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼公司，MTT試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞凋亡率檢測方法

WB-F334細(xì)胞按照每孔2×106個細(xì)胞密度接種于6孔板，分別加入0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL的MMC，對照組滴入等體積含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，各組細(xì)胞滴入0.25%胰酶消化后，收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液；冷PBS洗細(xì)胞2次，1 200 r/min離心5 min，收集細(xì)胞；用400 μL 1× 結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，濃度大約為1×106/mL；在細(xì)胞懸浮液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC，混勻后于4℃避光條件下孵育15 min；加入10 μL PI后輕輕混勻于4℃避光條件下孵育5 min，2 h內(nèi)于流式細(xì)胞儀中檢測，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 細(xì)胞毒作用檢測方法

3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)法測定細(xì)胞毒作用，WB-F344細(xì)胞按照5×105/孔置入96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后，加入0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL的MMC，對照組滴入等體積含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，作用6、12、24 h后，置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育24 h后，每孔滴入MTT 10 μL，37℃反應(yīng)6 h后，每孔再滴入鹽酸異丙醇100 μL，混勻、靜置20 min，DNM-9602酶標(biāo)分析儀檢測各孔A570nm值。

1.4 Western blot檢測信號分子磷酸化

取各組培養(yǎng)細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞至2×106個，用磷酸鹽緩沖液洗3次，2 min/次，滴入600 μL高效蛋白裂解液(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)，置于冰上30 min，細(xì)胞刮取器刮取細(xì)胞，4℃下15 000 r/min離心30 min，取上清液(細(xì)胞蛋白溶解成分)。選擇十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺進(jìn)行常規(guī)凝膠電泳，分離膠濃度為10%；100 V下以PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%BSA封閉60 min后，滴入兔抗鼠Anti-PI3K或p38 MAPK一抗(用API-2或SB203580按照1∶2 000稀釋)中反應(yīng)1 h，TBST洗3次，10 min/次。置辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(應(yīng)用API-2或SB203580按照1∶5 000稀釋)二抗中止反應(yīng)l h，TBST洗3次，10 min/次。ECL系統(tǒng)檢測、膠片顯影。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MMC作用不同時間WB-F334細(xì)胞凋亡率的變化比較

MMC作用6 h的WB-F334細(xì)胞凋亡率(9.18±10.45)%，12 h的WB-F334細(xì)胞凋亡率(32.67±12.58)%，24 h的WB-F334細(xì)胞凋亡率(58.42±12.09)%，均高于對照組(2.44±8.73)%，且隨時間的增加而上升(均P<0.05)。

2.2 不同濃度的MMC對肝干細(xì)胞的細(xì)胞毒作用比較

分別用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的MMC刺激大鼠的肝干細(xì)胞24 h，空白對照組和各濃度組的A值分別為0.835、0.601、0.574、0.498、0.369、0.305；與對照組比較，不同濃度的MMC對肝干細(xì)胞有明顯細(xì)胞毒作用，且隨著MMC濃度的升高而上升(圖1)。

圖1 不同濃度的MMC對肝干細(xì)胞的細(xì)胞毒作用比較Fig.1 Comparison of cytotoxicity of different concentrations of MMC on liver stem cells

2.3 MMC對WB-F334細(xì)胞不同信號途徑的激活

通過Western blot法檢測各信號分子的激活，結(jié)果如圖2所示。MMC刺激WB-F334細(xì)胞15 min后，與刺激前相比較，細(xì)胞中磷酸化MAPK、Akt(p-MAPK，p-Akt)蛋白的表達(dá)水平均顯著升高，提示MAPK和Akt蛋白均被活化；而且激活作用隨著時間延長而減弱，刺激30 min后，p-MAPK及p-Akt的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，直至60 min后p-MAPK及p-Akt幾乎不表達(dá)，說明MMC可以在短時間內(nèi)有效激活WB-F334細(xì)胞中的p38 MAPK及PI3K/Akt信號通路。

圖2 MMC對WB-F334細(xì)胞MAPK及PI3K/Akt信號通路的激活Fig.2 MMC activated MAPK and PI3K/Akt signaling pathway in WB-F334 cells

2.4 p38 MAPK及PI3K/Akt信號通路在MMC誘導(dǎo)的WB-F334細(xì)胞凋亡中的作用

為了進(jìn)一步研究p38 MAPK及PI3K/Akt信號通路在MMC誘導(dǎo)的WB-F334細(xì)胞凋亡中的作用，我們將細(xì)胞分為4個組別，分別為未處理組(control)，MMC處理組(MMC)，MMC處理組+ p38 MAPK抑制劑SB203580組(SB)及MMC處理組+PI3K/Akt抑制劑API-2組(API-2)，以研究p38 MAPK及PI3K/Akt信號通路在MMC誘導(dǎo)的WB-F334細(xì)胞凋亡中的作用。首先，為了驗(yàn)證SB203580及API-2的效果，我們使用Western blot方法比較加入API-2及SB203580后MMC處理組WB-F334細(xì)胞中p-MAPK及p-Akt的表達(dá)情況。如圖3所示，與未加抑制劑相比，當(dāng)加入了SB203580后，MMC刺激的WB-F334細(xì)胞中未見p-MAPK的表達(dá)，提示SB203580顯著抑制了MAPK的磷酸化，而加入API-2對WB-F334細(xì)胞中MAPK的磷酸化并未產(chǎn)生影響；而當(dāng)加入了API-2后，WB-F334細(xì)胞中Akt的磷酸化程度明顯減弱，而加入SB203580對WB-F334細(xì)胞中Akt的磷酸化并未產(chǎn)生影響。

接下來我們研究了p38 MAPK及PI3K/Akt信號通路在MMC誘導(dǎo)的WB-F334細(xì)胞凋亡中的作用。結(jié)果顯示，MMC組(33.74±5.57)%，SB組(34.06±5.49)%及API-2組(12.04±5.62)%的細(xì)胞凋亡率均顯著高于control組(2.44±8.73)%，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。此外，SB組與MMC組中細(xì)胞的凋亡率并無顯著差異(P>0.05)，提示SB對MMC誘導(dǎo)的WB-F334細(xì)胞凋亡并沒有明顯的作用；而API-2組中的細(xì)胞凋亡率明顯低于MMC組，提示API-2對MMC誘導(dǎo)的WB-F334細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用(P<0.05)。

圖3 p38 MAPK抑制劑和PI3K/Akt抑制劑對MAPK及PI3K/Akt信號通路的抑制作用Fig.3 Effect of p38 MAPK inhibitor and Akt inhibitor on MAPK and PI3K/Akt signaling pathway in WB-F334 cells

3 討論

肝干細(xì)胞可被定向誘導(dǎo)分化成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞[4]，當(dāng)肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p害或受特定因素影響而造成肝臟組織再生時，可選擇促使肝干細(xì)胞增殖、分化，實(shí)現(xiàn)對肝損傷的修復(fù)[5]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑作為調(diào)控細(xì)胞發(fā)育和生長的關(guān)鍵性因素之一，可顯著影響細(xì)胞增殖、分化及凋亡等機(jī)制。

PI3K屬于機(jī)體細(xì)胞內(nèi)重要磷脂酰肌醇激酶之一，結(jié)構(gòu)包括1個催化亞基和1個調(diào)節(jié)亞基[6]。該蛋白酶可作為關(guān)鍵信號分子參與機(jī)體多種生理活動。Akt則為PI3K下游直接靶蛋白[7]，屬于一種原癌基因c-Akt過表達(dá)產(chǎn)物。已有研究者將多種細(xì)胞因子與其受體相互結(jié)合、作用生成PI3K基因p85片段亞單位位點(diǎn)，其具有高親和性，可刺激Akt活化而誘發(fā)細(xì)胞生命活動[8]。文獻(xiàn)報道稱，PI3K/Akt通路可調(diào)控多種細(xì)胞生理信息傳導(dǎo)，參與機(jī)體內(nèi)各細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)[9-10]，啟動細(xì)胞凋亡機(jī)制，并激活細(xì)胞侵襲特性。在肝細(xì)胞再生的過程中，有許多細(xì)胞因子參與肝細(xì)胞的生長、凋亡調(diào)控。MAPK作為一類胞質(zhì)內(nèi)蛋白激酶，其家族成員包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、p38 MAPK和c-Jun氨基末端激酶(JNK)[11]，均可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化或凋亡等?；诖?，筆者認(rèn)為可通過人工干預(yù)方式調(diào)控MAPK和PI3K/Akt通路，實(shí)現(xiàn)對肝干細(xì)胞生長、增殖及分化的定向誘導(dǎo)。

研究顯示[12]，機(jī)體內(nèi)多種細(xì)胞因子均可調(diào)控肝組織細(xì)胞增殖及凋亡，從而促使肝臟再生。MMC可由鏈霉菌提取，分子含有苯醌、乙酰亞胺基和氨甲酰等活性基團(tuán)，并于DNA鏈形成交聯(lián)從而實(shí)現(xiàn)對DNA及RNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，可誘導(dǎo)肝細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞凋亡。但既往研究中，關(guān)于MMC誘發(fā)肝干細(xì)胞凋亡及其在肝干細(xì)胞生長調(diào)控過程中具體作用文獻(xiàn)較少。在本研究中，筆者通過選擇不同濃度MMC對肝干細(xì)胞采取細(xì)胞毒干擾，結(jié)果顯示，MMC作用6、12和24 h時的WB-F334細(xì)胞凋亡率均高于對照組，且隨時間的增加而上升，而MMC對肝干細(xì)胞的細(xì)胞毒作用也隨MMC濃度升高而上升，結(jié)果表明MMC可明顯抑制肝干細(xì)胞增殖及促使肝干細(xì)胞凋亡。

在研究中，筆者進(jìn)一步采取MMC刺激WB-F334細(xì)胞，結(jié)果顯示MAPK，Akt均發(fā)生磷酸化，且磷酸化程度隨著時間而減弱，這表明p38 MAPK和PI3K/Akt途徑能夠被MMC激活。在此基礎(chǔ)上，筆者使用抑制劑API-2阻斷PI3K/Akt和SB203580阻斷p38 MAPK，結(jié)果顯示API-2處理可以成功阻斷Akt的磷酸化過程，而其對p38 MAPK的磷酸化并無影響；SB203580可以成功阻斷p38 MAPK的磷酸化而并不影響Akt的磷酸化。我們發(fā)現(xiàn)MAPK途徑阻斷后，由MMC引起的肝干細(xì)胞凋亡率并沒有受到明顯抑制，而PI3K/Akt途徑被阻斷后則造成MMC誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)顯著下降，這表明MMC誘導(dǎo)肝干細(xì)胞凋亡機(jī)制可能以PI3K/Akt途徑介導(dǎo)為主，而p38 MAPK途徑可能不參與MMC介導(dǎo)肝干細(xì)胞凋亡過程或參與程度較低。

綜上所述，MMC能夠刺激肝干細(xì)胞WB-F334發(fā)生凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的作用是通過激活PI3K/Akt信號通路實(shí)現(xiàn)的。當(dāng)然，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能作用機(jī)制較復(fù)雜，故仍需進(jìn)一步研究加以完善。

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(2016-10-11 收稿)

Role of PI3K/Akt Pathway in MMC Induced Apoptosis of Liver Stem Cells

Liu Huijie1，Xu Dan2，Peng Rong3

1DepartmentofOncology,XiangyangCentralHospitalAffiliatedtoHubeiCollegeofArtsandScience，Xiangyang441021，China2DepartmentofGastroenterology，WuhanHospitalofTraditionalChineseMedicine，Wuhan430014，China3DepartmentofOncology，YichengHospital，Yicheng441400，China

Objective To investigate the role of PI3K/Akt pathway in mitomycin(MMC) induced apoptosis of liver stem cells.Methods Rat liver stem cells were stimulated with MMC，and the effect of MMC on the apoptosis rate of WB-F334 cells at different time points(6，12，24 h)，as well as the effects of different concentrations of (0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL) MMC on the cytotoxicity of WB-F334 cells were evaluated；moreover，cells were treated with p38 MAPK inhibitor and PI3K/Akt inhibitor，and the roles of MAPK and PI3K/Akt signaling pathway in MMC mediated apoptosis of WB-F334 cells were explored.Results The apoptosis rate of the MMC-treated WB-F334 increased with time(P<0.05).Compared with the un-treated control group，different concentrations of MMC had obvious cytotoxicity on liver stem cells，and the cytotoxicity increased with concentration.Western blotting results showed that Akt and MAPK in WB-F334 cells were significantly phosphorylated 15 min after MMC stimulation；the degree of phosphorylation decreased with time，and phosphorylation disappeared after 60 min，suggesting that the p38 MAPK，PI3K/Akt pathway can be activated by MMC；furthermore，when p38 MAPK inhibitor was added to MMC treated cells，the apoptosis rate of p38 MAPK inhibitor treated cells showed no significant difference compared to the un-treated cells(P>0.05)，indicating that the MAPK pathway had no significant effect on MMC induced WB-F334 cell death；however，when the PI3K/Akt inhibitor(API-2)was added，the apoptosis rate of API-2 treated cells was significantly decreased compared to the un-treated cells(P<0.05)，indicating that the PI3K/Akt pathway had a significant effect on MMC induced apoptosis of WB-F334 cells(P<0.05).Conclusion Stimulation of MMC can induce apoptosis of hepatic stem cells WB-F334 through the activation of the PI3K/Akt signaling pathway.

hepatic stem cell； apoptosis； mitomycin； PI3K； Akt； signal pathway

*湖北省襄陽市2014年市級立項(xiàng)課題(No.20140915)

劉暉杰，女，1977年生，副主任醫(yī)師，E-mail：xfhuahua@163.com

R322.4

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.01.015