橄欖油中蠟含量測(cè)定方法的改進(jìn)及氣質(zhì)聯(lián)用分析

柴 杰 薛雅琳 金青哲 王興國(guó) 張 東

(江南大學(xué)食品學(xué)院1，無錫 214122) (國(guó)家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037)

橄欖油中蠟含量測(cè)定方法的改進(jìn)及氣質(zhì)聯(lián)用分析

柴 杰1,2薛雅琳2金青哲1王興國(guó)1張 東2

(江南大學(xué)食品學(xué)院1，無錫 214122) (國(guó)家糧食局科學(xué)研究院2，北京 100037)

利用硅膠固相萃取柱凈化，四氯化碳洗脫，從橄欖油中分離出蠟質(zhì)組分，內(nèi)標(biāo)法定量，氣相色譜測(cè)定蠟含量，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析蠟質(zhì)組成。結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為79.95%～94.03%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.85%～1.70%。GC-MS分析得出蠟質(zhì)主要成分為長(zhǎng)碳鏈脂肪酸和長(zhǎng)碳鏈脂肪醇組成的長(zhǎng)碳鏈脂肪族蠟質(zhì)，相同碳數(shù)及飽和程度的蠟質(zhì)有多種組成，單不飽和蠟質(zhì)主要由棕櫚油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)與相應(yīng)的長(zhǎng)碳鏈脂肪醇(C20～C32)組成，含量高于飽和蠟質(zhì)。

橄欖油 蠟含量 固相萃取 氣相 氣質(zhì)聯(lián)用

初榨橄欖油是采用機(jī)械壓榨等物理方式直接從油橄欖果中制取[1]，因豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，宜人的香氣深受消費(fèi)者的青睞，被譽(yù)為“液體黃金”。巨大的經(jīng)濟(jì)利益誘使生產(chǎn)商將低等級(jí)的精煉橄欖油、混合橄欖油和橄欖果渣油摻入初榨橄欖油中以次充好，牟取暴利。目前橄欖油摻偽研究方法包括液相色譜法[2]、核磁共振光譜法[3]、紅外線光譜法[4]、熒光光譜法[5]和化學(xué)計(jì)量分析法[6]。

橄欖油中含有多種蠟質(zhì)，包括長(zhǎng)碳鏈脂肪酸和短碳鏈脂肪醇(C1～C6)或長(zhǎng)碳鏈脂肪醇(C22～C28)形成的脂肪族蠟質(zhì)、苯甲醇酯、甾醇酯等，主要以長(zhǎng)碳鏈脂肪酸與長(zhǎng)碳鏈脂肪醇形成的脂肪族蠟質(zhì)為主[7]。不同等級(jí)的橄欖油蠟含量不同，初榨橄欖油中蠟含量少，通過測(cè)定橄欖油中蠟含量能有效判定橄欖油等級(jí)，國(guó)際橄欖油協(xié)會(huì)(IOC)及中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)通過測(cè)定長(zhǎng)碳鏈脂肪族蠟質(zhì)含量制訂了COI/T.20/Doc.No.28/(2010)[8]和GB/T 22501—2008[1]2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定根據(jù)C40～C46偶碳數(shù)脂肪族蠟質(zhì)含量鑒定橄欖油等級(jí)。

IOC及GB方法利用人工裝填的硅膠柱層析洗脫，將弱極性的蠟質(zhì)組分先于甘油三酯洗脫下來，內(nèi)標(biāo)法定量，氣相色譜法測(cè)定蠟含量，此方法不破壞蠟質(zhì)組成，能準(zhǔn)確定量蠟質(zhì)組分，但人工裝填層析柱等步驟耗時(shí)耗力，此后有學(xué)者優(yōu)化了前處理，Amelio等[9]利用液相色譜分離蠟質(zhì)組分，簡(jiǎn)化了步驟。有學(xué)者利用氣相色譜測(cè)定蠟含量及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析蠟質(zhì)組成，氣相色譜根據(jù)蠟質(zhì)碳原子數(shù)及不飽和度進(jìn)行分離從而測(cè)定總量，利用GC-MS可對(duì)蠟質(zhì)進(jìn)行定性分析及同分異構(gòu)組成研究。Reiter等[10]利用SPE固相萃取小柱分離茴香和香菜種子油中蠟質(zhì)，氣相色譜法測(cè)定蠟含量，方法節(jié)約了前處理時(shí)間。Bianchi等[7]通過GC-MS分析橄欖果渣油的蠟質(zhì)組分，其主要成分為油酸或棕櫚酸與長(zhǎng)碳鏈脂肪醇(C22～C28)形成的單不飽和長(zhǎng)碳鏈脂肪族蠟質(zhì)。Reiter等[11]通過質(zhì)譜分析得出，橄欖油中蠟質(zhì)含有不同碳鏈長(zhǎng)度的酯類，包括短碳鏈脂肪族酯類，長(zhǎng)碳鏈脂肪族飽和酯類，長(zhǎng)碳鏈脂肪族不飽和酯類，芐基酯，二萜酯等。

本試驗(yàn)利用SPE固相萃取小柱分離橄欖油中蠟質(zhì)，內(nèi)標(biāo)法定量，氣相色譜測(cè)定C40～C46偶碳數(shù)脂肪族蠟質(zhì)含量，建立了一種快速簡(jiǎn)便的橄欖油蠟含量測(cè)定方法，有效鑒定橄欖油等級(jí)，同時(shí)利用GC-MS分析了橄欖油中C40～C46偶碳數(shù)脂肪族蠟質(zhì)組成，為蠟質(zhì)組分分析提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

特級(jí)初榨橄欖油，混合橄欖油；正己烷(色譜純)，正庚烷(色譜純)：Fisher Science；硝酸銀、四氯化碳、正己烷、乙醚：北京化工試劑廠；花生酸月桂醇酯(C32酯)、C40酯標(biāo)準(zhǔn)品、蘇丹Ⅰ：Sigma公司；硅膠(100～200 μm)：青島海洋化工工廠。

GC2010氣相色譜儀，SPL進(jìn)樣口，F(xiàn)ID檢測(cè)器：島津公司；Agilent 7890-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用，DB-5HT毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.1 μm)：Agilent公司；SPE固相萃取小柱(1 g硅膠6 mL容量)：上海安譜科學(xué)儀器公司；SX-4-10馬弗爐：天津泰斯特儀器有限公司；R-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士Buchi公司；玻璃層析柱(d=1.5 cm,l=40 cm)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柱層析分離蠟組分

硅膠固相萃取柱，上樣前用正己烷活化，準(zhǔn)確稱取橄欖油20～25 mg，加入200 μL 0.01 mg/mL內(nèi)標(biāo)物(花生酸月桂醇酯，C32酯)，上樣，2次200 μL正己烷清洗試管使轉(zhuǎn)移徹底，6 mL四氯化碳洗脫，收集洗脫液，弱氮?dú)饬鞔蹈扇軇?，?50 μL正庚烷，氣相色譜及GC-MS分析。

人工裝填硅膠柱分離橄欖油中蠟質(zhì)組分同GB/T 22501—2008。

1.2.2 氣相色譜法測(cè)定蠟含量

氣相色譜條件：DB-5HT毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.10 μm)，程序升溫：初始溫度200 ℃，保持1 min，20 ℃/min程序升溫至300 ℃，2 ℃/min程序升溫至346 ℃，保持26 min；高純氦氣，流速1.5 mL/min；SPL進(jìn)樣口，溫度340 ℃，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比10∶1；FID檢測(cè)器，350 ℃。

蠟含量=[A(W)×m(IS)×1 000]/[A(IS)×m]

式中：A(W)：蠟質(zhì)(C40酯～C46酯)峰面積；m(IS)：內(nèi)標(biāo)質(zhì)量/mg；A(IS)：內(nèi)標(biāo)物峰面積；m：樣品質(zhì)量/g。

總含蠟量=Σ [C40酯含量～C46酯含量]

1.2.3 GC-MS分析

氣相色譜條件：同1.2.2；MS條件：電子轟擊源(EI源)，溫度230 ℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲8 min，質(zhì)量范圍(m/z)：50～800。

1.2.4 蠟質(zhì)定性分析

采用蠟質(zhì)酯基斷裂后形成的脂肪酸和脂肪醇離子碎片確定蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)，以定性碎片離子占該峰總定性碎片離子的百分含量確定蠟質(zhì)組成，同Bianchi、Reiter等[7, 10-11]的分析方法。

2 結(jié)果與討論

2.1 橄欖油蠟含量測(cè)定

橄欖油中蠟質(zhì)以C40～C46偶碳數(shù)的脂肪族蠟質(zhì)為主，不飽和蠟質(zhì)出峰先于飽和蠟質(zhì)[11]，蠟含量以C40酯～C46酯偶碳數(shù)脂肪族蠟質(zhì)總和表示，不同等級(jí)的橄欖油蠟含量不同，初榨橄欖油中蠟含量少，混合橄欖油中蠟含量高。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品出峰及文獻(xiàn)譜圖對(duì)照，蠟質(zhì)組成依次為，1∶WE40∶1，2∶WE40∶0，3∶WE42∶1，4∶WE42∶0，5∶WE44∶1，6∶WE44∶0，7∶WE46∶1，8∶WE46∶0。相同碳鏈長(zhǎng)度的蠟質(zhì)不飽和蠟質(zhì)含量高于飽和蠟質(zhì)，Reiter等[11]也得出相同結(jié)論。

圖1 特級(jí)初榨橄欖油中蠟含量氣相色譜圖

2.1.1 方法的線性范圍及檢出限

由IOC及GB方法可知，C40酯等脂肪族蠟質(zhì)與花生酸月桂醇酯(C32酯)的響應(yīng)值比近似為1，將C40酯標(biāo)準(zhǔn)品用正庚烷稀釋成0.19、0.095、0.047 5、0.019、0.009 5、0.000 95 mg/mL系列質(zhì)量濃度，按照1.2.2氣相色譜條件進(jìn)行測(cè)定。峰面積為縱坐標(biāo)y，C40酯質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x，曲線方程為y=1.959 8×106x-2.330 5×103，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 4，線性范圍0.000 95～0.19 mg/mL，表明在0.000 95～0.19 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。方法的最低檢出限以基線噪音的3倍所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，該方法的最低檢出限為0.095 μg/mL。

2.1.2 方法的精密度、加標(biāo)回收率及準(zhǔn)確度

取一橄欖油樣對(duì)其蠟含量進(jìn)行6次重復(fù)試驗(yàn)測(cè)定，蠟含量分別為68.74、70.22、68.59、65.74、65.95、65.61 mg/kg，均值為67.47 mg/kg，變異系數(shù)為2.91%。再取18份該橄欖油油樣，每6份為1組，分為3組，每組依次加入0.011 9 mg/mL C40酯正己烷溶液60、120、200 μL，按1.2.1中改進(jìn)法及1.2.2進(jìn)行蠟質(zhì)分離及蠟含量測(cè)定。平均回收率及每個(gè)加標(biāo)量條件下的6次試驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表3。

表1 橄欖油中C40酯加標(biāo)回收率及準(zhǔn)確度(n=6)

方法加標(biāo)回收率為79.95%～94.03%，試驗(yàn)過程中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.85%～1.70%(n=6)，表明該方法精密度及準(zhǔn)確度良好。

2.1.3 實(shí)際樣品測(cè)定及與GB/T 22501—2008方法比較

選取2個(gè)橄欖油樣品，分別采用改進(jìn)方法和GB/T 22501—2008方法對(duì)其總蠟含量及C40酯～C46酯各單酯含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表2。比較得出，2種方法都能有效的測(cè)定橄欖油中總蠟含量及蠟質(zhì)各單酯含量，且2種方法在總蠟含量及C40～C46酯各單量的測(cè)定結(jié)果相近。

表2 實(shí)際樣品測(cè)定與國(guó)標(biāo)法比較(n=2)

改進(jìn)的方法主要優(yōu)化了前處理，采用分流進(jìn)樣口進(jìn)樣。SPE固相萃取小柱能有效替代人工裝填的硅膠柱，縮短前處理時(shí)間，提取效率快，同時(shí)避免人工裝柱及洗脫的不穩(wěn)定性，耐用性強(qiáng)，在色譜條件選擇，使用SPL分流進(jìn)樣，減少了對(duì)色譜柱的污染，選用DB-5HT耐高溫低流失氣相色譜柱，基線穩(wěn)定，耐受較高溫度的同時(shí)確保良好的分離效果，色譜圖出峰尖銳。2種方法比較見表3。

表3 IOC法、GB法與改進(jìn)法方法比較

2.2 橄欖油蠟質(zhì)GC-MS分析

氣相色譜中每一個(gè)蠟質(zhì)峰中包含相同碳數(shù)、相同飽和程度的多種不同脂肪酸-脂肪醇組成的蠟質(zhì)[10]，蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)表示為R1-COO-R2，R1代表組成蠟質(zhì)的長(zhǎng)碳鏈脂肪酸組分，R2代表組成蠟質(zhì)的長(zhǎng)碳鏈脂肪醇組分，飽和蠟質(zhì)中檢測(cè)出母離子峰[M]+，因Mclafferty重排產(chǎn)生的[R1CO2H2]+，[R1CO]+和[R2-1]+，不飽和蠟質(zhì)中檢測(cè)出Mclafferty重排產(chǎn)生的[R1CO2H2]+， Mclafferty裂解蠟質(zhì)中不飽和脂肪酸組分產(chǎn)生的[R1CO-1]+，同Reiter等[11]的測(cè)定結(jié)果。

根據(jù)Bianchi和Reiter等[7, 11]的方法，采用蠟質(zhì)酯基斷裂形成的脂肪酸和脂肪醇離子碎片確定蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)，以定性碎片離子占該峰總定性碎片離子的百分含量確定蠟質(zhì)組成，以[R1CO2H2]+、[R1CO]+和[R2-1]+碎片離子確定飽和蠟質(zhì)的中各組成的百分含量，以[R1CO2H2]+和[R1CO-1]+碎片離子確定不飽和蠟質(zhì)中各組成的百分含量，分析特級(jí)初榨橄欖油中蠟質(zhì)組成成分，測(cè)定結(jié)果見表4。

表4 特級(jí)初榨橄欖油蠟質(zhì)組成成分質(zhì)譜鑒定結(jié)果

注：a:CN蠟質(zhì)碳鏈長(zhǎng)度；DB雙鍵數(shù)；WE蠟質(zhì)；b:acid-alcohol，組成蠟質(zhì)的脂肪酸-脂肪醇；c:該種脂肪酸-脂肪醇組成占此碳數(shù)蠟質(zhì)組成的百分含量；d:離子碎片的相對(duì)百分峰度；e:[]表示未檢出。

通過GC-MS分析可對(duì)特級(jí)初榨橄欖油中C40～C46偶碳數(shù)脂肪族蠟質(zhì)中相同碳數(shù)單不飽和蠟質(zhì)及飽和蠟質(zhì)組成進(jìn)行確定，根據(jù)表4可知，相同碳數(shù)及相同飽和程度的蠟質(zhì)有多種不同的脂肪酸-脂肪醇組成，不飽和長(zhǎng)碳鏈脂肪族蠟質(zhì)主要由棕櫚油酸(C16∶1)和油酸(C18∶1)與長(zhǎng)碳鏈脂肪醇(C20～C32)組成，油酸(C18∶1)與長(zhǎng)碳鏈脂肪醇組成的不飽和脂肪族蠟質(zhì)含量更高。飽和脂肪族蠟質(zhì)主要為棕櫚酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)、花生酸(C20∶0)、山崳酸(C22∶0)與相應(yīng)的長(zhǎng)碳鏈脂肪醇(C20～C32)組成。相同碳數(shù)脂肪族蠟質(zhì)，單不飽和蠟質(zhì)出峰先于飽和蠟質(zhì)，單不飽和蠟質(zhì)含量高于飽和蠟質(zhì)含量，分析結(jié)果與氣相色譜法推斷結(jié)果相同。

3 結(jié)論

3.1 建立了一種快速準(zhǔn)確測(cè)定橄欖油蠟含量的方法，方法加標(biāo)回收率為79.95%～94.03%，試驗(yàn)過程中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.85%～1.70%。前處理利用商業(yè)成品SPE固相萃取小柱，操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，有效避免人工裝填硅膠柱引起的誤差，有機(jī)溶劑使用量少，總測(cè)定時(shí)間短，提取效率快，耐用性強(qiáng)。

3.2 利用碎片離子峰進(jìn)行定性，在不經(jīng)皂化破壞蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)的條件下對(duì)脂肪族蠟質(zhì)組成進(jìn)行分析，分析了C40～C46飽和及單不飽和脂肪族蠟質(zhì)的組成，相同碳數(shù)及飽和程度的蠟質(zhì)有多種組成，單不飽和脂肪族蠟質(zhì)含量高于飽和脂肪族蠟質(zhì)。

[1]GB/T 22501—2008 動(dòng)植物油脂 橄欖油中蠟含量的測(cè)定 氣相色譜法[S]. 2008 GB/T 22501—2008 Animal and vegetable fats and oils—Determination of wax content of olive oils by gas chromatography [S]. 2008

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[5]鐘誠(chéng)，薛雅琳，王興國(guó)，等. 紫外光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)檢測(cè)初榨橄欖油摻偽研究[J]. 中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2013，28(10)：113-117 Zhong Cheng，Xue Yalin，Wang Xingguo，et al. Study on the detection of virgin olive oil adulteration by ultraviolet spectroscopy combined with chemometrics [J]. Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2013，28(10)：113-117[6]F Priego C，J Ruiz J，Castro M D L D. Sequential (step-by-step)detection，identification and quantitation of extra virgin olive oil adulteration by chemometric treatment of chromatographic profiles [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，388(8)：1859-1865

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Improvement of the Determination Method of Wax Content in Olive Oils and Analysis by GC-MS

Chai Jie1,2Xue Yalin2Jin Qingzhe1Wang Xingguo1Zhang Dong2

(School of Food Science, Jiangnan University1, Wuxi 214122) (Academy of State Administration of Grain2, Beijing 100037)

The waxy component of olive oil was obtained by silica gel solid phase extraction column purification, carbon tetrachloride elution, and internal standard method quantification, subsequently the wax content measured by gas chromatography and the waxiness composition analysized by gas chromatography-mass spectrometry. The results showed that the adding standard recovery was 79.95%～94.03%, with the relative standard deviation (RSD) of 0.85%～1.70%. With respect to the GC-MS analysis, the main component of the wax was long carbon chain fatty esters and long carbon chain aliphatic series waxiness which were composed of long carbon chain fatty alcohol. The waxiness of the same carbon number and same degree of saturation had various components, and monounsaturated waxiness was mainly composed of palmitoleic acid (C16∶1), oleic acid (C18∶1) and the corresponding long carbon chain fatty alcohol (C20～C32), the content of unsaturated waxiness were higher than saturated waxiness.

olive oil， wax content， solid-phase extraction，gas chromatography， GC-MS

公益性行業(yè)(糧食)科研專項(xiàng)(201313006-3)

2015-07-21

柴杰，男，1990年出生，碩士，糧油食品檢驗(yàn)

薛雅琳，女，1960年出生，教授級(jí)高級(jí)工程師，糧油質(zhì)量與檢測(cè)

TS227

A

1003-0174(2017)02-0135-05