Legumain基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的表達(dá)分析

賈小娥，朱 偉，樊 燕，謝 偉，姜樹原，石 蕊，劉曉蕾，許文強(qiáng)，邵 國

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060；3.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

Legumain基因在斑馬魚胚胎發(fā)育中的表達(dá)分析

賈小娥1△，朱 偉2△，樊 燕3，謝 偉1，姜樹原1，石 蕊1，劉曉蕾1，許文強(qiáng)1，邵 國1

(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究中心，內(nèi)蒙古包頭 014060；2.包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060；3.包頭醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014060)

為明確天冬酰胺內(nèi)肽酶(legumain)基因在斑馬魚發(fā)育中的表達(dá)特性，利用全胚胎原位雜交的方法檢測legumain在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)分布情況，并采用雙色原位雜交的方法研究legumain和泛髓系細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的共定位情況。結(jié)果顯示，legumain轉(zhuǎn)錄本為母系表達(dá)，在胚胎發(fā)育早期泛在性表達(dá)。在受精18 h后在造血組織有特異的高豐度表達(dá)。雙色原位雜交顯示，legumain和泛髓系細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞有共定位表達(dá)。結(jié)果提示legumain在斑馬魚發(fā)育過程中有重要作用，在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)并參與相關(guān)生理功能的完成。

天冬酰胺內(nèi)肽酶；斑馬魚；胚胎發(fā)育；表達(dá)特性；共定位

天冬酰胺內(nèi)肽酶(legumain，LGMN)是半胱氨酸蛋白酶家族的新成員。最早在植物刀豆和豇豆中發(fā)現(xiàn)，隨后研究人員發(fā)現(xiàn)在脊椎動物、哺乳動物中均有l(wèi)egumain的表達(dá)。legumain和其他家族的組織蛋白酶一樣，主要定位于細(xì)胞的溶酶體中，參與降解基質(zhì)蛋白等多種生理過程[1-2]。

研究表明，legumain基因在多種腫瘤組織中高表達(dá)[3-5]，并且legumain的高表達(dá)與腫瘤的分化程度、腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系[6-7]。更多的研究表明，legumain不僅在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，在腫瘤微環(huán)境和腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞(tumor associated macrophages,TAMs)中也高表達(dá)[8]。

然而關(guān)于legumain在機(jī)體正常發(fā)育過程中和正常組織中的作用研究相對較少。本研究以斑馬魚作為模式生物，研究legumain在胚胎發(fā)育中的表達(dá)特性。研究發(fā)現(xiàn)，legumain基因?yàn)槟赶当磉_(dá)基因，早期胚胎發(fā)育時期泛在性表達(dá)，在受精18 h后在造血組織有特異的高豐度表達(dá)。雙色原位雜交顯示，legumain和泛髓系細(xì)胞(pan myeloid cells)、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞有共定位表達(dá)。結(jié)果為進(jìn)一步研究legumain在胚胎發(fā)育中的功能研究奠定了基礎(chǔ)，并為legumain在巨噬細(xì)胞中的功能研究提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動物 試驗(yàn)用斑馬魚為Tubigen系野生型斑馬魚，由包頭醫(yī)學(xué)院斑馬魚模式動物平臺保種并飼養(yǎng)，14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)，水溫28.5 ℃±0.5 ℃，pH 7.2～7.5。

1.1.2 質(zhì)粒和引物 pGEM-Teasy載體為Promega公司產(chǎn)品；引物zlegumain-F:TGTCGAATTCGCAGAAATGAGCCCAAAGAC，zlegumain-R:GAGACTCGAGCCCCCTTCAGTTCAGTTT- CA，產(chǎn)物大小為2 133 bp，用于擴(kuò)增legumain基因，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、SacⅡ、DNA聚合酶、rTaq、質(zhì)粒小提試劑盒、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒、DNA連接試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara公司產(chǎn)品；mMESSAGE mMACHINE○RSP6 Transcription Kit (Ambion, AM1340)，NucAway Spin Columns(Ambion, AM10070)，Dig RNA Labeling Mixture (Roche, 11277073910), Fluorescein RNA Labeling Mix (Roche,11685619910)。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 提取斑馬魚組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA為模版，用zlegumain-F和zlegumain-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到legumain基因片段。將擴(kuò)增得到的legumain基因片段連接到pGEM-T easy載體中，然后轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。篩選陽性克隆，陽性克隆培養(yǎng)并提取質(zhì)粒后經(jīng)EcoRⅠ酶切鑒定后測序驗(yàn)證,正確的質(zhì)粒命名為zlegumain-pGEM-T easy。

1.2.2 地高辛或熒光素標(biāo)記的反義mRNA探針的制備 合成探針時，以限制性內(nèi)切酶SacⅡ線性化的zlegumain-pGEM-T easy質(zhì)粒為模板，用 SP6 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄得到反義RNA探針。探針體外轉(zhuǎn)錄采用RNA地高辛/熒光素標(biāo)記試劑盒(DIG/ Fluorescein RNA Labeling Kit，Roche)，步驟參照試劑盒說明書。合成的探針用 NucAway Spin Columns進(jìn)行純化，經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，置-80℃保存。

1.2.3 斑馬魚整體胚胎原位雜交 選取野生型斑馬魚發(fā)育至0.75、1.5 、3.7、6、12、18、22、36、48、72 h的胚胎進(jìn)行原位雜交，40 mL/L甲醛4℃固定過夜，甲醇梯度脫水，置于-20℃ 100%甲醇中備用。甲醇梯度復(fù)水，蛋白酶K處理，用1×PBST洗去消化液后，40 mL/L甲醛再次固定20 min,1×PBST洗3次。將胚胎置于68℃雜交爐中預(yù)雜交2 h，然后加入legumain反義RNA探針于68℃雜交爐中雜交過夜。雜交后第2天回收探針并加入SSCT梯度清洗胚胎，加入anti-Dig-AP抗體與反義探針4℃結(jié)合過夜。雜交后第3天用1×PBST洗去多余抗體，加入顯色試劑 BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate(Vector labs)溶液,避光室溫輕搖染色，每隔20 min觀測顯色情況。染色結(jié)束后，PBST洗凈染液，在體視顯微鏡下(Nikon SMZ18)觀察記錄結(jié)果并拍照。

1.2.4 斑馬魚整體胚胎雙色原位雜交 試驗(yàn)步驟同單色原位雜交。雙色原位雜交時第1天需要加入地高辛標(biāo)記的和熒光素標(biāo)記的反義RNA探針，雙色原位雜交第2天還需要加入抗熒光素的抗體，雙色原位雜交第3天在用BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate溶液顯色后，再使用Fast Red Tablets進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果

2.1 legumain探針質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增得到legumain基因片段，連接入pGEM-Teasy載體，得到用于合成legumain反義探針的重組載體zlegumain-pGEM-Teasy，載體包括legumain基因的CDS區(qū)域和部分3′UTR區(qū)域(圖1A)。使用EcoRⅠ內(nèi)切酶對zlegumain-pGEM-Teasy進(jìn)行酶切鑒定。經(jīng)瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒被切成線性，分別為3 015 bp的pGEM-Teasy載體骨架和2 133 bp legumain片段，表明重組載體中正確插入了legumain基因片段(圖1B)。隨后送公司測序表明，legumain片段與NCBI上序列一致，證實(shí)legumain探針質(zhì)粒構(gòu)建成功。

A.legumain探針質(zhì)粒圖譜； B.EcoRⅠ酶切鑒定質(zhì)粒；M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；1～3.zlegumain-pGEM-Teasy

A.The map of zlegumain-pGEM-Teasy; B.The digestion of zlegumain-pGEM-Teasy byEcoRⅠ; M.DNA Marker DL 15 000; 1-3.zlegumain-pGEM-Teasy

圖1 legumain探針質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

Fig.1 The construction and identification of legumain probe plasmid

2.2 legumain同源性分析

對斑馬魚和人類的legumain基因進(jìn)行了同線性分析(synteny analysis)，結(jié)果顯示，在斑馬魚13號染色體上包含legumain基因及其上、下游6個基因在內(nèi)的基因組序列，同時在人類的14號染色體上完全可以找到其對應(yīng)的同源區(qū)(圖2A)。使用ClustalW軟件對8個物種的legumain進(jìn)行氨基酸序列對比，結(jié)果顯示，斑馬魚legumain氨基酸序列與人的同源性為66.7%，與黑猩猩的同源性為66.7%，與大鼠的同源性為65.4%，與小鼠的同源性為66%，與雞的同源性為69.2%，與線蟲的同源性為43.5%。繪制這8個物種legumain的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2B。結(jié)果說明，從斑馬魚到人類的進(jìn)化過程中，legumain基因是高度保守的。

2.3 legumain基因在斑馬魚胚胎中的表達(dá)譜分析

分別收集受精后0.75、1.5、3.7、6、12、18、22、36、48、72 h共10個不同發(fā)育時期的斑馬魚胚胎，進(jìn)行全胚胎原位雜交，在體視顯微鏡下觀察斑馬魚不同發(fā)育時期legumain基因的表達(dá)情況(圖3)。由圖3A和圖3B可見，legumain基因?yàn)槟赶祦碓椿颍摶蜃月蚜褧r期就開始表達(dá)。在發(fā)育初期50%外包時期6 h時(圖3C和圖3D)呈現(xiàn)泛在性表達(dá)。在斑馬魚胚胎發(fā)育12 h時，legumain呈現(xiàn)體節(jié)表達(dá)(圖3E)。在斑馬魚胚胎發(fā)育22 h時，legumain在早期造血組織ICM(intermediate cell mass,ICM)區(qū)域有相對特異表達(dá)(圖3G)。在斑馬魚胚胎發(fā)育36 h時，legumain在定向造血組織AGM(aorta-gonad-mesonephros,AGM)區(qū)域有特異表達(dá)(圖3H)。在斑馬魚胚胎發(fā)育48 h～72 h時，legumain在定向造血組織CHT(caudal hematopoietic tissue,CHT)區(qū)域有特異表達(dá)(圖3I和圖3J)。

2.4 legumain基因和血管內(nèi)皮生長因子受體flk-1的共定位分析

為了進(jìn)一步證實(shí)legumain基因是否也在血管組織中表達(dá)，采用雙色原位雜交技術(shù)觀察legumain基因和血管內(nèi)皮生長因子受體flk-1是否有共定位表達(dá)。血管內(nèi)皮生長因子受體flk-1在斑馬魚全身血管內(nèi)皮表達(dá)，特異性標(biāo)記血管系統(tǒng)。圖4A和圖4B顯示，血管內(nèi)皮生長因子受體flk-1(藍(lán)色)和legumain(紅色)沒有共定位表達(dá)，說明legumain基因不在血管內(nèi)皮組織中表達(dá)。

A. legumain同線性分析；B. legumain系統(tǒng)發(fā)育樹

A.Synteny analysis of legumain; B.Phylogenetic tree of legumain

圖2 legumain同源性分析

Fig.2 legumain homology analysis

A、B、C、D、E、F、G、H、I、J為側(cè)面觀；D’、E’、H’為背面觀

A.24 h pf時flk-1和legumain雙色原位雜交；B.36 h pf時Flk-1和legumain雙色原位雜交

2.5 legumain基因在造血細(xì)胞中的表達(dá)分析

Legumain不在血管內(nèi)皮組織中表達(dá)，并且在造血組織AGM和CHT均有特異性的表達(dá)，那么在血液細(xì)胞中是否有l(wèi)egumain的表達(dá)呢？使用雙色原位雜交技術(shù)觀察legumain和泛髓系細(xì)胞(l-plastin標(biāo)記,哺乳動物中同源基因?yàn)長CP1)、中性粒細(xì)胞(mpo標(biāo)記,哺乳動物中同源基因?yàn)镸PO)和巨噬細(xì)胞(lyz標(biāo)記,哺乳動物中同源基因?yàn)長YZ)分別進(jìn)行共定位分析。如圖5所示，泛髓系細(xì)胞特異表達(dá)基因l-plastin(藍(lán)色)和legumain(紅色)在受精后36 h有共定位表達(dá)(圖5A和圖5B)。中性粒細(xì)胞特異表達(dá)基因mpo(藍(lán)色)和legumain(紅色)在受精后36 h有共定位表達(dá)(圖5C和圖5D)。巨噬細(xì)胞特異表達(dá)基因lyz(藍(lán)色)和legumain(紅色)在受精后36 h有共定位表達(dá)(圖5E和圖5F),而將lyz和legumain反義探針的顏色互換時，巨噬細(xì)胞特異表達(dá)基因lyz(紅色)和legumain(藍(lán)色)在受精后36 h同樣有共定位表達(dá)(圖5G和圖5H)。說明legumain不僅在造血組織AGM和CHT表達(dá)，同時在造血細(xì)胞中也有l(wèi)egumain的表達(dá)。

A(24hpf)、B(36hpf)為legumain(red)和l-plastin(blue)的共定位; C(22hpf)、D(36hpf)為legumain(red)和mpo(blue)的共定位; E(24hpf)、F(36hpf)為legumain(red)和lyz(blue)的共定位; G(24hpf)、H(28hpf)為legumain(blue)和lyz(red)的共定位

A(24hpf)，B(36hpf).Co-localization of legumain (red) and l-plastin (blue); C(22hpf)，D(36hpf).Co-localization of legumain (red) and mpo (blue); E(24hpf)，F(xiàn)(36hpf).Co-localization of legumain (red) and lyz (blue); G(24hpf)，H(28hpf).Co-localization of legumain (blue) and lyz (red)

圖5 legumain基因在泛髓系細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中的表達(dá)

Fig.5 Expressions of legumain in pan-myeloid cells/ macrophages/ neutrophiles

3 討論

Legumain在物種進(jìn)化中高度保守，生物信息學(xué)分析表明，斑馬魚legumain蛋白質(zhì)序列與部分物種中l(wèi)egumain的同源性達(dá)到60%以上，特別是和人類的legumain同源性達(dá)到66.7%，說明legumain在進(jìn)化中的高度保守性以及重要作用。本研究以斑馬魚為模式生物，對legumain的時空表達(dá)譜進(jìn)行分析，legumain在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中具有明顯的時空表達(dá)差異和組織特異性。在胚胎發(fā)育早期，legumain呈現(xiàn)普遍性表達(dá)，在受精22 h后特異性，表達(dá)于造血組織。這與legumain在小鼠和人類造血組織中的泛在性表達(dá)譜一致[9]，進(jìn)一步說明了legumain在從斑馬魚到人類的進(jìn)化過程是非常保守的。

為了更進(jìn)一步說明legumain的表達(dá)特異性，本研究使用雙色原位雜交的方法，證實(shí)legumain不在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而是在造血細(xì)胞中表達(dá)，特別是在泛髓系細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞中有l(wèi)egumain的表達(dá)。這些結(jié)果提示legumain在巨噬細(xì)胞和免疫細(xì)胞中有重要作用，并可能與巨噬細(xì)胞、免疫細(xì)胞的功能相關(guān)。有報道，在單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞模型中，巨噬細(xì)胞表達(dá)并分泌legumain，特別是在單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的過程中，legumain的表達(dá)和活性明顯上升[10]。還有一些研究發(fā)現(xiàn)，legumain參與免疫細(xì)胞的抗原遞呈過程[11]，并以抗原和Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)作為酶切底物參與了抗原遞呈和自身免疫的激活[12]。

Legumain被認(rèn)為是治療腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲的一個潛在靶點(diǎn)[3-4]，與legumain在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)并參與巨噬細(xì)胞相關(guān)功能有直接關(guān)系。在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞中也有l(wèi)egumain的高表達(dá),并且使用藥物阻斷TAMs能夠有效抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[8]，在腫瘤細(xì)胞中敲除legumain，也能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲[6,13]。利用legumain特異性的酶切位點(diǎn)以及在TAMs中特異性表達(dá)的特點(diǎn)，開發(fā)了legumain特異性剪切的抗腫瘤藥物[14-15]，在抗腫瘤藥物上連接legumain特異性剪切序列作為藥物前體，這些藥物前體在腫瘤細(xì)胞中被高表達(dá)的legumain剪切變成活性藥物，能發(fā)揮抗腫瘤作用并殺死腫瘤細(xì)胞，能夠有效的靶向腫瘤細(xì)胞，減少對正常細(xì)胞的副作用。

總之，legumain在斑馬魚胚胎正常發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，并在巨噬細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞中特異性表達(dá)。本研究為進(jìn)一步探討legumain在胚胎發(fā)育及疾病中的作用奠定了基礎(chǔ)。

[1] 覃金定，蔣堯傳，肖榮馳.基質(zhì)金屬蛋白酶參與椎間盤突出組織再吸收的研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36(1):87-91.

[2] 王 東，顧建紅，劉宗平.組織蛋白酶K在骨吸收中的作用研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2014，35(6):114-116.

[3] Haugen M H,Boye K，Nesland J M,et al.High expression of the cysteine proteinase legumain in colorectal cancer - implications for therapeutic targeting[J].Eur J Cancer,2015，51(1):9-17.

[4] Wu M,Shao G R,Zhang F X,et al.Legumain protein as a potential predictive biomarker for Asian patients with breast carcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014，15(24):10773-10777.

[5] Wu T,Sun L,Wu Y,et al.Prognostic value of legumain in uveal melanoma[J].Mol Med Rep,2016，13(3):2377-2384.

[6] Meng F，Liu W,Knockdown of legumain suppresses cervical cancer cell migration and invasion[J].Oncol Res,2016,23(1):7-12.

[7] Zhen Y,Chunlei G,Wenzhi S,et al.Clinicopathologic significance of legumain overexpression in cancer:a systematic review and meta-analysis[J].Sci Rep,2015,5:16599.

[8] Luo Y,Zhou H,Krueger J,et al.Targeting tumor-associated macrophages as a novel strategy against breast cancer[J].J Clin Invest,2006,116(8):2132-2141.

[9] Dall E,Brandstetter H.Structure and function of legumain in health and disease[J].Biochimie,2016,122:126-150.

[10] Solberg R,Smith R,Almlof M,et al.Legumain expression,activity and secretion are increased during monocyte-to-macrophage differentiation and inhibited by atorvastatin[J].Biol Chem,2015,396(1):71-80.

[11] Dall E,Fegg J C,Briza P,et al.Structure and mechanism of an aspartimide-dependent peptide ligase in human legumain[J].Angew Chem Int Ed Engl,2015,54(10):2917-2921.

[12] Ewald S E,Engel A,Lee J,et al.,Nucleic acid recognition by Toll-like receptors is coupled to stepwise processing by cathepsins and asparagine endopeptidase[J].J Exp Med,2011,208(4):643-651.

[13] Edgington-Mitchell L E, Rautela J,Duivenvoorden H M,et al.Cysteine cathepsin activity suppresses osteoclastogenesis of myeloid-derived suppressor cells in breast cancer[J].Oncotarget,2015,6(29):27008-27022.

[14] Liu Z,Xiong M,Gong J,et al.Legumain protease-activated TAT-liposome cargo for targeting tumours and their microenvironment[J].Nat Commun,2014,5:4280.

[15] Smith R L,Astrand O A,Nguyen L M,et al.Synthesis of a novel legumain-cleavable colchicine prodrug with cell-specific toxicity[J].Bioorg Med Chem,2014,22(13):3309-3315.

Expression Pattern Analysis of Legumain Gene in Zebrafish Embryonic Development

JIA Xiao-e1,ZHU Wei2,FAN Yan3,XIE Wei1,JIANG Shu-yuan1,SHI Rui1, LIU Xiao-lei1,XU Wen-qiang1,SHAO Guo1

(1.BiomedicalResearchCenter,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China; 2.SchoolofPharmacy,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China; 3.SchoolofBasicMedical,BaotouMedicalCollege,Baotou,InnerMongolia,014060,China)

To explore the spatio-temporal expression pattern of legumain in the zebrafish development,whole-mount in situ hybridization (WISH) was used to detect the expression pattern of legumain in the process of zebrafish embryonic development.Double in situ hybridization (D-WISH) was performed to detect the co-localization of legumain and pan-myeloid cells/ macrophages/ neutrophiles.Legumain transcript was maternal expressed,and expressed ubiquitously in most tissues of early embryos.Then legumain transcript was specific highly expressed in hematopoietic tissue from 18 hour post fertilization (hpf).Legumain was found to co-localization with pan-myeloid cells/ macrophages/ neutrophiles using double in situ hybridization.The present study provided important clues that legumain plays an important role in embryonic development in zebrafish,and has high expression in macrophages and participates macrophage functions.

legumain; zebrafish; embryonic development; expression pattern; co-localization

2016-05-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81550038，81660204)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015BS0801，2015BS0807)；包頭醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金項(xiàng)目(BSJJ201632，BSJJ201623)；內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(NJZY16207)；包頭醫(yī)學(xué)院科學(xué)研究基金項(xiàng)目(BYJJ-YF 201610，BYJJ-YF 201606)

賈小娥(1984-)，女，內(nèi)蒙古包頭人，講師，博士，主要從事發(fā)育生物學(xué)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者

S852.161

A

1007-5038(2017)01-0045-05