• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    單細胞水平原鈣黏蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄分析

    2017-03-01 05:53:58陳志鋒
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2017年2期
    關(guān)鍵詞:基因簇單細胞外顯子

    陳志鋒, 彭 萊, 吳 強,

    (1.上海交通大學生命科學技術(shù)學院,上海 200240;2.上海交通大學系統(tǒng)生物醫(yī)學研究院比較生物醫(yī)學中心/系統(tǒng)生物醫(yī)學教育部重點實驗室,上海 200240)

    單細胞水平原鈣黏蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄分析

    陳志鋒1, 彭 萊2, 吳 強1,2

    (1.上海交通大學生命科學技術(shù)學院,上海 200240;2.上海交通大學系統(tǒng)生物醫(yī)學研究院比較生物醫(yī)學中心/系統(tǒng)生物醫(yī)學教育部重點實驗室,上海 200240)

    原鈣黏蛋白(protocadherin,Pcdh)基因簇由緊密相連的3個基因簇(Pcdhα、Pcdhβ和Pcdhγ)組成,其中α、β基因簇包含可變區(qū)外顯子(C型和非C型)和恒定區(qū)外顯子。這種獨特的基因排列方式使Pcdh基因簇具有產(chǎn)生單細胞分子多樣性的潛能。目前,在單細胞水平有關(guān)Pcdh基因簇轉(zhuǎn)錄表達的研究較少。為了探索單細胞Pcdh基因簇的轉(zhuǎn)錄表達模式,利用顯微操作系統(tǒng)并結(jié)合RT-PCR方法,在單細胞水平分析了小鼠大腦皮層和人類神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK-N-SH的Pcdhα和Pcdhβ基因簇表達模式。研究發(fā)現(xiàn)Pcdhα和Pcdhγ的C型和非C型亞型均是隨機表達,每個單細胞表達不同組合的若干個Pcdh基因簇亞型。本研究表明,在小鼠大腦皮層及人類神經(jīng)母細胞瘤的單個細胞中,Pcdh基因簇的轉(zhuǎn)錄表達都能夠產(chǎn)生單細胞表面分子多樣性。這為進一步揭示神經(jīng)元中Pcdh基因簇表達調(diào)控的分子機理及其在大腦神經(jīng)回路中的功能奠定理論基礎。

    原鈣黏蛋白基因簇;表達模式;單細胞;RT-PCR;單細胞表面分子多樣性

    哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)中含有上億個神經(jīng)元,這些神經(jīng)元通過突觸結(jié)構(gòu)形成復雜而有序的信號通訊網(wǎng)絡,不同神經(jīng)元之間是如何有效地相互識別,進而相互連接,形成復雜的神經(jīng)環(huán)路,這一直都是神經(jīng)科學領(lǐng)域亟待解決的重要基礎性課題。有研究提出每個神經(jīng)元都含有其特異性的身份識別標簽[1-2],這些標簽具有分子多樣性,可以用來區(qū)別于其他神經(jīng)元,指導不同神經(jīng)元之間特異性識別,保證神經(jīng)環(huán)路的正確形成。在哺乳動物系統(tǒng)中,何種蛋白能夠產(chǎn)生單細胞的分子多樣性呢?近年來,在脊椎動物中所獨有的、進化過程中高度保守的原鈣黏蛋白基因簇引起了人們的關(guān)注。原鈣黏蛋白基因簇由3個串聯(lián)排列的基因簇Pcdh(α、β和γ)組成,其中Pcdhα和Pcdhγ基因簇包含C型和非C型可變外顯子組成的可變區(qū)以及3個恒定區(qū)外顯子組成的恒定區(qū)[3-4](圖1)。小鼠Pcdhα基因簇可變區(qū)包含12個非C型可變外顯子(α1~α12)和2個C型可變外顯子(αc1~αc2),小鼠Pcdhγ基因簇可變區(qū)包含19個非C型可變外顯子(γa1~γa12,γb1~γb8,但沒有γb3)和3個C型可變外顯子(γc3~γc5)(圖1-A);人的Pcdhα基因簇可變區(qū)包含13個非C型可變外顯子(α1~α13)和2個C型可變外顯子(αc1~αc2),人的Pcdhγ基因簇可變區(qū)包含19個非C型可變外顯子(γa1~γa12,γb1~γb7)和3個C型可變外顯子(γc3~γc5)(圖1-B)。在轉(zhuǎn)錄時,通過啟動子選擇和順式可變剪接作用,使可變區(qū)外顯子與3個恒定區(qū)外顯子相連,最終形成由可變區(qū)外顯子編碼的胞外結(jié)構(gòu)域(含有6個胞外結(jié)構(gòu)域,即EC1~EC6)、跨膜結(jié)構(gòu)域和恒定區(qū)外顯子編碼的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成的原鈣黏蛋白分子[5-6](圖1)。因此,不同可變外顯子形成不同原鈣黏蛋白的組合具有產(chǎn)生單細胞多樣性的潛能。

    Yagi等對P21小鼠蒲肯野細胞Pcdh基因簇的表達模式進行了研究,認為Pcdhα和Pcdhγ基因簇C型亞型組成型表達,即每個單細胞都表達C型亞型,而非C型亞型隨機表達[7-9]。這為單細胞Pcdh基因簇表達的分子多樣性提供了初步的證據(jù),但這種表達模式的發(fā)現(xiàn)只是基于小鼠一個發(fā)育時期和一種細胞類型的研究,其普遍性有待驗證。在小鼠大腦皮層細胞中Pcdh基因簇以怎樣的模式表達,是否具有多樣性,目前還不清楚。另外,有研究表明,在人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SK-N-SH中Pcdhα和Pcdhγ基因簇表達特定亞型的組合[10],那么在單細胞水平,每個SK-N-SH細胞是否都表達這些特定亞型的組合,單細胞Pcdhα和Pcdhγ基因簇的轉(zhuǎn)錄表達是否具有多樣性,尚不清楚。

    通過轉(zhuǎn)錄分析手段如逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)[11]的方法可以得到細胞中基因表達的信息,常規(guī)的RT-PCR方法至少需要上萬個細胞。這種群體細胞轉(zhuǎn)錄分析方法得到的是一群細胞基因表達的綜合信息,但是無法知道單細胞內(nèi)基因表達的情況以及單細胞間基因表達的差異。只有將單細胞技術(shù)(單細胞顯微操作技術(shù)等)與轉(zhuǎn)錄分析技術(shù)結(jié)合,將RT-PCR等轉(zhuǎn)錄分析方法直接應用于單個細胞的研究,才能揭示單個細胞中基因表達的真實情況,才能比較不同細胞間基因表達的差異[12]。

    本研究利用根據(jù)Smart-Seq2[13]的部分步驟改進而來的單細胞RT-PCR的方法探索了P0小鼠大腦皮層細胞和 SK-N-SH 細胞系原鈣黏蛋白基因簇Pcdhα和Pcdhγ的表達模式,發(fā)現(xiàn)所有亞型的轉(zhuǎn)錄表達都是隨機的,不同單細胞隨機表達不同亞型的組合,從而賦予單個細胞原鈣黏蛋白基因簇表達的分子多樣性,為原鈣黏蛋白作為神經(jīng)元特異性身份識別標簽參與神經(jīng)回路的形成提供了新的證據(jù),為進一步揭示單個神經(jīng)元中原鈣黏蛋白基因簇表達的分子機理奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 小鼠與細胞系 小鼠為B6野生型小鼠,購于南京大學模式動物研究所;SK-N-SH細胞系為人神經(jīng)母細胞瘤細胞系,購于上海細胞庫。

    1.1.2 試驗試劑 1×TrypLE Express enzyme,no phenol red(12604-021)購于Gibco公司;Triton X-100(T9284)購于Sigma-Aldrich公司;dNTP Mix(R0192)購于Fermentas公司;5×First-strand buffer(18064-014)購于Invitrogen公司;DTT(18064-014)購于Invitrogen公司,Superscript Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄酶(18064-014)購于Invitrogen公司;重組核酸酶抑制劑(2313A)購于Clontech公司;Betaine(61962)購于Sigma-Aldrich公司;MgCl2(M8266)購于Sigma-Aldrich公司;KOD-Plus-Neo(KOD-401)購于TOYOBO公司;TaqPCR Master Mix(BS9298)購于BBI公司;FBS(10099-141)購于Gibco公司;DMEM/ High Glucose(SH30243.01B)購于Thermo公司;Papain(P4752-50MG)、DNaseⅠ(DN25-10MG)購于Sigma公司。

    1.1.3 實驗儀器 Laser based micropipette puller系統(tǒng)(美國Sutter Instrument 公司);XenoworksTMMicromanipulator(美國Sutter Instrument公司);Mini Vortexer(82019-170)美國VWR公司;Leica Microsystems(德國Leica公司);5810R離心機(德國Eppendorf公司);PCR儀(美國Applied Biosystems公司);電泳儀(美國Bio-Rad公司);Forma 902超低溫冰箱(美國Thermo公司);Forma series Ⅱ細胞培養(yǎng)箱(美國 Thermo 公司)。

    1.1.4 引物 本研究所用引物(表1)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    表1 本研究所用引物

    1.2 方法

    1.2.1 細胞系的單細胞懸浮液制備 于長滿有SK-N-SH細胞系的60 mm培養(yǎng)皿中,棄培養(yǎng)基;加入2 mL 37 ℃ PBS溶液,然后去除PBS;加入1 mL 37 ℃胰蛋白酶消化3 min;加入1 mL 37 ℃培養(yǎng)基終止消化,用移液槍輕輕吹打細胞;取 200 μL 細胞液于15 mL離心管中,再加入1 mL培養(yǎng)基和 1 mL 胰蛋白酶溶液進行稀釋,置于冰上待用。

    1.2.2 小鼠大腦皮層的酶消化分離溶液的制備 稱量1 mg木瓜蛋白酶于1.5 mL離心管中,加入1 mL DMEM-High Glucose培養(yǎng)基和1 μL 1 mg/mL DNaseⅠ并混勻,置于37 ℃水浴鍋中待用。

    1.2.3 小鼠大腦皮層的單細胞懸浮液制備 使用高壓滅菌后的外科手術(shù)器械取下P0時期的小鼠大腦,置于冰浴 DMEM-High Glucose培養(yǎng)基中;用尖細的鑷子取少量大腦皮層放入酶消化分離溶液中,37 ℃消化15 min;除去上層液體,加入 1 mL DMEM-High Glucose和FBS的混合液(9 ∶1)清洗,用移液槍吹散細胞;并使用100 μm孔隙濾膜過濾;400 r/min離心5 min除去上層液體,加入1 mL DMEM-High Glucose和FBS的混合液,重懸細胞,置于冰上待用。

    1.2.4 單細胞的挑取與裂解 準備工作:(1)單細胞裂解緩沖液的配制:將0.2%體積分數(shù)的Triton X-100溶液、RNA酶抑制劑和DTT(100 μmol/L)按95 ∶5 ∶1的比例混合,并充分混勻。(2)10 μmol/L特異性逆轉(zhuǎn)錄引物(表1)溶液的配制:將10 μL 100 μmol/L的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物溶液和90 μL無核酸酶超純水充分混勻。(3)單細胞裂解混合液的配制:將單細胞裂解緩沖液、特異性逆轉(zhuǎn)錄引物溶液和10 mmol/L dNTP mix溶液按2 ∶1 ∶1的比例充分混合均勻。

    操作步驟:將單細胞懸液與臺盼藍按9 ∶1比例混合,并充分混勻;取100 μL上述混合液涂在載玻片上,置顯微鏡下,靜置1 min;在顯微鏡下用毛細玻璃移液管吸取單個細胞(圖2-c);將吸入的單細胞吹出(伴隨有0.3 μL液體)至含有 4 μL 的單細胞裂解混合液PCR管的蓋子中(圖2-d);將含有單細胞的蓋子蓋回PCR管,立即渦旋并放置于冰上;17 000 r/min 離心15 s;將樣品放置在72 ℃水浴鍋中恒溫加熱3 min后,瞬時離心并立即置于冰上。

    1.2.5 單細胞樣品逆轉(zhuǎn)錄反應 解凍逆轉(zhuǎn)錄反應各試劑,并混勻;混合以下組分:0.25 μL重組RNA酶抑制劑(40 U/μL),2.00 μL Superscript Ⅱ first-strand buffer(5×),0.5 μL DTT(100 mmol/L),2.00 μL Betaine(5 mol/L),0.06 μL MgCl2(1 mol/L),0.10 μL TSO(100 μmol/L),0.29 μL Nuclease-free water,0.50 μL SuperScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL);將混合組分加入到單細胞樣品中,并混勻;離心700 r/min 10 s并立即放置冰上;設置以下反應參數(shù)進行逆轉(zhuǎn)錄:42 ℃ 90 min;50 ℃ 2 min,42 ℃ 2 min,10個循環(huán);70 ℃ 15 min。

    1.2.6 單細胞樣品PCR預擴增反應 依次向PCR試管中加入以下組分并充分混勻,2.5 μL KOD-Plus-Neo聚合酶 10×PCR緩沖液,2.5 μL 2 mmol/L dNTP,0.25 μL ISPCR primers(10 mol/L),9.25 μL無核酸酶的超純水,0.5 μL KOD-Plus-Neo 聚合酶;加15 μL PCR預擴增反應的混合液于單細胞樣品中,使最終反應體系為25 μL,充分混勻,以 700 r/min 離心10 s并置于冰上;PCR反應參數(shù):98 ℃ 3 min;98 ℃ 20 s,67 ℃ 15 s,72 ℃ 4 min,30個循環(huán);72 ℃ 5 min。

    1.2.7 單細胞Pcdh基因簇亞型特異性PCR 于PCR管中加入1 μL稀釋了2倍的PCR預擴增反應產(chǎn)物,并向PCR管中依次加入以下組分:5 μLTaqPCR Master Mix,0.4 μL Primer F(10 μmol/L),0.4 μL Primer R(10 μmol/L),3.2 μL去離子水;PCR反應參數(shù):94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,35個循環(huán);72 ℃ 7 min;瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)Pcdhα和Pcdhγ各亞型對應條帶的有無來判斷亞型是否表達。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 小鼠大腦皮層單細胞Pcdhα基因簇的轉(zhuǎn)錄分析

    首先,取P0時期小鼠大腦皮層,通過普通RT-PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析大腦皮層群體細胞中Pcdhα各個亞型的表達情況。由圖3可知,在群體細胞水平上,大腦皮層細胞表達所有的Pcdhα亞型。

    圖4為單細胞RT-PCR分析P0小鼠大腦皮層Pcdhα亞型表達的結(jié)果。由圖4可知,所有細胞都表達Pcdhα,但并不是每個細胞都表達C型亞型,如有6個細胞表達αc2,有1個細胞表達αc1。在非C型亞型中,有的非C型亞型沒有被檢測到表達,如α1、α6,有的非C型亞型在3個細胞中被檢測到表達,如α7、α11等,因此,表達不同亞型的細胞個數(shù)不同。由圖4縱向看,每個細胞表達不同的Pcdhα亞型組合,如2#表達α4和α8的組合,14#表達α2、α5和αc2的組合。

    以上結(jié)果表明,在P0小鼠的大腦皮層單細胞中,PcdhαC型亞型(αc1和αc2)和非C型亞型的表達是隨機的,單細胞隨機選擇表達這些亞型的組合,單細胞間Pcdhα的表達具有多樣性。

    2.2 小鼠大腦皮層單細胞Pcdhγ基因簇的轉(zhuǎn)錄分析

    由圖5可知,群體細胞水平上,P0小鼠大腦皮層細胞表達所有Pcdhγ亞型的組合。

    圖6為14個(1#~14#)小鼠(P0)大腦皮層單細胞Pcdhγ各個亞型表達的情況。每個細胞都表達Pcdhγ,71%(10/14)的細胞表達C型亞型γc3,只有21%(3/14)的細胞表達γc4,這批細胞中沒有檢測到表達γc5的細胞,PcdhγC型亞型(γc3、γc4和γc5)是隨機表達的。另外,表達不同非C型亞型的細胞個數(shù)差異很大,有的非C型亞型不表達,如γa8、γb5等等,而有的非C型亞型在多個細胞中被檢測到表達,如有6個細胞表達γa11。不同單細胞間表達γ亞型的種類數(shù)也相差很大,有的細胞表達1~2種Pcdhγ亞型,如12#只表達γb4,6# 只表達γb2和γc3,而有的細胞表達5種Pcdhγ亞型組合,如3#表達γa3、γa4、γa6、γa11和γc3的組合,4#表達γa4、γb2、γa7、γa12和γc3的組合。

    綜合以上結(jié)果分析,小鼠(P0)的大腦皮層單細胞Pcdhγ亞型的表達是隨機的,每個細胞隨機選擇表達不同的Pcdhγ亞型組合,單細胞Pcdhγ的表達具有多樣性。

    2.3 SK-N-SH細胞系中單細胞Pcdhα基因簇的轉(zhuǎn)錄分析

    SK-N-SH是人神經(jīng)母細胞瘤細胞系,以往研究表明,在群體細胞水平,該細胞系Pcdhα基因簇表達α4、α8、α12、αc1和αc2等5種亞型[10]。

    如圖7所示,這批細胞中只有α4、α12和αc2被檢測到表達,只有6個細胞被檢測到表達Pcdhα,由圖7可知,4#、10#和15#都只表達α12,11#和18#都只表達Pcdhα4,13#只表達Pcdhαc2。結(jié)果表明,并不是每個SK-N-SH細胞都表達一樣的Pcdhα特定亞型組合,單細胞Pcdhα的表達具有多樣性。

    2.4 SK-N-SH細胞系中單細胞Pcdhγ基因簇的轉(zhuǎn)錄分析

    前期研究表明,在群體細胞水平上,SK-N-SH細胞系Pcdhγ基因簇表達γb1、γa4、γb2、γb3、γa7、γb5、γa9、γa10、γb7、γc3、γc4和γc5等12種亞型[10]。由于Pcdhγ基因簇結(jié)構(gòu)的獨特性[3],筆者推測,每個SK-N-SH細胞隨機表達Pcdh基因簇的亞型,每個細胞表達不一樣的Pcdhγ亞型組合。由于細胞群體的Pcdh基因簇表達是所有單細胞Pcdh基因簇綜合表達的結(jié)果,群體細胞穩(wěn)定表達特定亞型的組合。

    如圖8所示,用單細胞RT-PCR的方法全面分析了36個SK-N-SH單細胞(圖8A,1#~20#;圖8B,21#~36#)所有Pcdhγ亞型表達的情況,每個SK-N-SH細胞都會表達Pcdhγ,94%(34/36)的細胞表達C型亞型Pcdhγc3,表達Pcdhγc4和Pcdhγc5的細胞分別占細胞總數(shù)的8%(3/36)和44%(16/36)。在非C型亞型中,有的非C型亞型沒有被檢測到表達,如γa3等;有的非C型亞型在大部分細胞中被檢測到表達,如γb7。從縱向看圖8,并不是所有細胞都表達相同的特定某些Pcdhγ亞型組合,有的細胞表達亞型的種類多,如3#表達γa4、γb2、γa7、γb7、γc3和γc5的組合,有的細胞表達亞型的種類少,如19#表達γa7和γb7,29#表達γb7和γc3,32#表達γa7和γc3。

    以上結(jié)果分析表明,在SK-N-SH細胞系單細胞中,Pcdhγ亞型的表達是隨機的,有的亞型表達幾率大,有的亞型表達的幾率小,不同SK-N-SH單細胞表達不同的Pcdhγ亞型組合,單細胞Pcdhγ的表達具有多樣性。

    3 結(jié)論與討論

    哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)由數(shù)以億計的神經(jīng)元組成,神經(jīng)元之間通過多樣而特異的突觸連接用以交流和傳遞信息。原鈣黏蛋白可能在復雜的神經(jīng)系統(tǒng)中扮演重要角色,如原鈣黏蛋白介導樹突的自我回避[14],決定神經(jīng)元的存活[15-16],調(diào)控樹突的形成與發(fā)育[17-18],指導突觸的發(fā)育[19-20]等等。有研究認為每個神經(jīng)元的表面都有其自身特異性的身份識別標簽,這些標簽具有分子多樣性的特征,用以指導不同神經(jīng)元間特異性識別[1-2]。而原鈣黏蛋白基因簇獨特的排列方式及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特異性表達[3-4]表明其在神經(jīng)元中具有產(chǎn)生原鈣黏蛋白分子多樣性的潛能,可能作為神經(jīng)元的身份識別標簽參與到神經(jīng)回路的形成中。但哺乳動物許多神經(jīng)元(如大腦皮層細胞等)中的原鈣黏蛋白基因簇表達是否真的都具有分子多樣性,這還不清楚。

    前人對小鼠(P21)蒲肯野細胞原鈣黏蛋白基因簇的表達模式進行了研究,為神經(jīng)元產(chǎn)生原鈣黏蛋白的分子多樣性提供了直接的試驗證據(jù)。Yagi等基于小鼠(P21)蒲肯野細胞的研究提出了原鈣黏蛋白基因簇獨特的表達模式,認為原鈣黏蛋白基因簇的C型亞型組成型表達,即每個神經(jīng)元都表達C型亞型,而其他非C型亞型隨機性表達[9]。但小鼠(P21)蒲肯野細胞Pcdh基因簇的這種表達模式是否具有普遍性,并且在小鼠大腦皮層中Pcdh基因簇的轉(zhuǎn)錄表達是否具有多樣性,目前仍不清楚。另外,有關(guān)研究表明,SK-N-SH細胞系會穩(wěn)定表達某些特定亞型的組合[10]。但在單細胞水平,每個SK-N-SH細胞是否都表達這些特定亞型的組合,Pcdh基因簇的轉(zhuǎn)錄表達是否具有多樣性,這還尚未清楚。

    常規(guī)的基因表達的轉(zhuǎn)錄分析是利用逆轉(zhuǎn)錄PCR[11]或RNA-Seq[21]的方法從群體細胞水平分析群體細胞基因表達的綜合情況,但這樣得到的結(jié)果是所有細胞基因表達的平均水平,沒法得到單個細胞中各基因表達的情況,沒法區(qū)分單細胞間基因表達的差異,因此,只有將基因轉(zhuǎn)錄分析方法直接運用于單個細胞,才能揭示單個細胞中基因表達的信息,才能比較單細胞間基因表達的差異。

    本研究通過單細胞RT-PCR的方法分析了小鼠(P0)大腦皮層和SK-N-SH單細胞中原鈣黏蛋白基因簇的表達模式,發(fā)現(xiàn)C型和非C型亞型的表達均是隨機的,每個神經(jīng)元隨機選擇表達不同的原鈣黏蛋白基因簇亞型組合,Pcdh基因簇的轉(zhuǎn)錄表達在單細胞中具有多樣性。原鈣黏蛋白基因簇轉(zhuǎn)錄表達的多樣性為其作為神經(jīng)元身份識別標簽參與神經(jīng)回路的形成提供了新的證據(jù),也為進一步從單細胞水平研究原鈣黏蛋白基因簇轉(zhuǎn)錄表達多樣性的分子機理奠定了基礎。有研究表明,在雙相情感障礙和自閉癥等多種精神類疾病中,均伴隨有神經(jīng)回路形成缺陷[22-23],本研究也為系統(tǒng)理解精神類疾病的發(fā)病機制提供理論參考。

    近年來,隨著單細胞檢測技術(shù)的不斷發(fā)展,人們可以將轉(zhuǎn)錄組高通量測序(RNA-Seq)技術(shù)運用于單細胞的研究,各種單細胞RNA-Seq技術(shù)相繼涌現(xiàn),如scRNA-Seq[24]、Smart-Seq[25]、Smart-Seq2[13,26]等等,各種單細胞轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)形式各異,但本質(zhì)上都是為了更加真實全面地得到單細胞中轉(zhuǎn)錄組的全部信息。因此,將來可以在已有研究的基礎上利用單細胞RNA-Seq技術(shù),對各個發(fā)育階段小鼠大腦皮層單細胞和神經(jīng)系統(tǒng)其他組織的單細胞進行高通量測序,不僅可以獲得各種細胞中原鈣黏蛋白基因簇表達的亞型種類,還可以獲得各亞型的表達水平,從而更進一步地揭示原鈣黏蛋白基因簇表達的分子多樣性,還可以進一步研究單細胞原鈣黏蛋白基因簇組合型的表達模式是否受時空調(diào)控,為原鈣黏蛋白作為神經(jīng)元特異性身份識別標簽參與神經(jīng)回路的形成提供更多的證據(jù)。

    [1]Zipursky S L,Sanes J R. Chemoaffinity revisited:dscams,protocadherins,and neural circuit assembly[J]. Cell,2010,143(3):343-353.

    [2]Sperry,W R. Chemoaffinity in the orderly growth of nerve fiber patterns and connections[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1963,50:703-710.

    [3]Wu Q,Maniatis T. A striking organization of a large family of human neural cadherin-like cell adhesion genes[J]. Cell,1999,97(6):779-790.

    [4]Wu Q,Zhang T,Cheng J F,et al. Comparative DNA sequence analysis of mouse and human protocadherin gene clusters[J]. Genome Research,2001,11(3):389-404.

    [5]Tasic B,Nabholz C E,Baldwin K K,et al. Promoter choice determines splice site selection in protocadherin α and γ pre-mRNA splicing[J]. Molecular Cell,2002,10(1):21-33.

    [6]Wang X Z,Su H,Bradley A. Molecular mechanisms governingPcdhγ gene expression:evidence for a multiple promoter and cis-alternative splicing model[J]. Genes & Development,2002,16(15):1890-1905.

    [7]Esumi S,Kakazu N,Taguchi Y,et al. Monoallelic yet combinatorial expression of variable exons of the protocadherin-α gene cluster in single neurons[J]. Nature Genetics,2005,37(2):171-176.

    [8]Esumi S,Kaneko R,Kawamura Y,et al. Split single-cell RT-PCR analysis of Purkinje cells[J]. Nature Protocols,2006,1(4):2143-2151.

    [9]Kaneko R,Kato H,Kawamura Y,et al. Allelic gene regulation ofPcdhα andPcdhγ clusters involving both monoallelic and biallelic expression in single Purkinje cells[J]. Journal of Biological Chemistry,2006,281(41):30551-30560.

    [10]Guo Ya,Monahan K,Wu Hai Yang,et al. CTCF/cohesin-mediated DNA looping is required for protocadherin α promoter choice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2012,109(51):21081-21086.

    [11]Rio C D. Reverse transcription-polymerase chain reaction[J]. Cold Spring Harbor Protocols,2014(11):1207-1216.

    [12]Phillips J K,Lipski J. Single-cell RT-PCR as a tool to study gene expression in central and peripheral autonomic neurones[J]. Autonomic Neuroscience-Basic & Clinical,2000,86(1/2):1-12.

    [13]Picelli S,F(xiàn)aridani O R,Bjorklund A K,et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2[J]. Nature Protocols,2014,9(1):171-181.

    [14]Lefebvre J L,Kostadinov D,Chen W V,et al. Protocadherins mediate dendritic self-avoidance in the mammalian nervous system[J]. Nature,2012,488(7412):517-521.

    [15]Chen W V,Alvarez F J,Lefebvre J L,et al. Functional significance of isoform diversification in the protocadherin γ gene cluster[J]. Neuron,2012,75(3):402-409.

    [16]Wang X,Weiner J A,Levi S,et al. Gamma protocadherins are required for survival of spinal interneurons[J]. Neuron,2002,36(5):843-854.

    [17]Garrett A M,Schreiner D,Lobas M A,et al. γ-Protocadherins control cortical dendrite arborization by regulating the activity of a FAK/PKC/MARCKS signaling pathway[J]. Neuron,2012,74(2):269-276.

    [18]Suo L,Lu H N,Ying G X,et al. Protocadherin clusters and cell adhesion kinase regulate dendrite complexity through Rho GTPase[J]. Journal of Molecular Cell Biology,2012,4(6):362-376.

    [19]Garrett A M,Weiner J A. Control of CNS synapse development by γ-protocadherin-mediated astrocyte-neuron contact[J]. Journal of Neuroscience,2009,29(38):11723-11731.

    [20]Weiner J A,Wang Xiaozhong,Tapia J C,et al. Gamma protocadherins are required for synaptic development in the spinal cord[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2005,102(1):8-14.

    [21]Mortazavi A,Williams B A,Mccue K,et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq[J]. Nature Methods,2008,5(7):621-628.

    [22]Iossifov I,Ronemus M,Levy D,et al. De Novo gene disruptions in children on the autistic spectrum[J]. Neuron,2012,74(2):285-299.

    [23]Pedrosa E,Stefanescu R,Margolis B,et al. Analysis of protocadherin alpha gene enhancer polymorphism in bipolar disorder and schizophrenia[J]. Schizophrenia Research,2008,102(1/2/3):210-219.

    [24]Tang F C,Barbacioru C,Wang Y Z,et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell[J]. Nature Methods,2009,6(5):377-382.

    [25]Ramskold D,Luo Shu Jun,Wang Y C,et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells[J]. Nature Biotechnology,2012,30(8):777-782.

    [26]Picelli S,Bjorklund A K,F(xiàn)aridani O R,et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells[J]. Nature Methods,2013,10(11):1096-1098.

    10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.010

    2016-01-26

    國家自然科學基金(編號:91519302,812111583);中國博士后科學基金(編號:2015M571558);上海市科學技術(shù)委員會科研計劃(編號:14JC1403601)。

    陳志鋒(1989—),男,江西贛州人,碩士研究生,主要從事生物化學與分子生物學研究。E-mail:chenzf2013@qq.com。

    吳 強,教授,博士生導師,主要從事分子細胞生物學和神經(jīng)發(fā)育生物學研究。Tel:(021)34204300;E-mail:qiangwu@sjtu.edu.cn。

    Q786

    A

    1002-1302(2017)02-0038-06

    陳志鋒,彭 萊,吳 強. 單細胞水平原鈣黏蛋白基因簇的轉(zhuǎn)錄分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學,2017,45(2):38-43.

    猜你喜歡
    基因簇單細胞外顯子
    外顯子跳躍模式中組蛋白修飾的組合模式分析
    外顯子組測序助力產(chǎn)前診斷胎兒骨骼發(fā)育不良
    人工智能助力微生物單細胞鑒定
    科學(2020年4期)2020-11-26 08:27:16
    冬瓜高通量轉(zhuǎn)錄組測序及分析
    外顯子組測序助力產(chǎn)前診斷胎兒骨骼發(fā)育不良
    聯(lián)合SNaPshot和單倍型分析技術(shù)建立G6PD缺乏癥單細胞基因診斷體系
    單細胞測序技術(shù)研究進展
    腸球菌萬古霉素耐藥基因簇遺傳特性
    遺傳(2015年5期)2015-02-04 03:06:55
    海洋稀有放線菌 Salinispora arenicola CNP193 基因組新穎PKS 和NRPS基因簇的發(fā)掘
    海洋科學(2014年12期)2014-12-15 03:35:00
    人類組成型和可變外顯子的密碼子偏性及聚類分析
    中文字幕av电影在线播放| 天堂动漫精品| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美另类亚洲清纯唯美| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲无线在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 一本精品99久久精品77| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品久久久av美女十八| 欧美日韩乱码在线| 国产单亲对白刺激| 91在线观看av| av中文乱码字幕在线| 国产一区二区激情短视频| 高清毛片免费观看视频网站| 久久久久久久久免费视频了| 999精品在线视频| 亚洲,欧美精品.| 精品久久久久久久末码| 亚洲avbb在线观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 91麻豆精品激情在线观看国产| 色播亚洲综合网| 国产区一区二久久| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲精品美女久久av网站| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久人妻av系列| 一级a爱视频在线免费观看| 一区二区日韩欧美中文字幕| 夜夜爽天天搞| 最近最新中文字幕大全电影3 | 亚洲性夜色夜夜综合| 久99久视频精品免费| 一级毛片女人18水好多| 自线自在国产av| 久久香蕉国产精品| 国产日本99.免费观看| 真人做人爱边吃奶动态| 97碰自拍视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产亚洲欧美98| 久久久久免费精品人妻一区二区 | 精品欧美国产一区二区三| 午夜久久久久精精品| av免费在线观看网站| 欧美黑人精品巨大| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 美女午夜性视频免费| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| xxxwww97欧美| 天天一区二区日本电影三级| 婷婷六月久久综合丁香| 在线观看免费日韩欧美大片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久精品91蜜桃| 日韩欧美三级三区| 亚洲人成电影免费在线| av电影中文网址| 久久久国产欧美日韩av| 黄色视频,在线免费观看| 成年免费大片在线观看| 婷婷亚洲欧美| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99国产精品一区二区蜜桃av| 精品欧美一区二区三区在线| 日韩精品中文字幕看吧| 国产不卡一卡二| 人成视频在线观看免费观看| 黄色丝袜av网址大全| 一级黄色大片毛片| 老汉色av国产亚洲站长工具| 99久久精品国产亚洲精品| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线av久久热| 国产精品免费视频内射| 国产一卡二卡三卡精品| 人人妻人人澡人人看| 成人欧美大片| 成人国产一区最新在线观看| 欧美zozozo另类| 日本三级黄在线观看| 麻豆成人av在线观看| 亚洲激情在线av| 久久九九热精品免费| 亚洲人成网站高清观看| 韩国精品一区二区三区| 国产成人精品无人区| 99热这里只有精品一区 | 天堂影院成人在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美中文日本在线观看视频| 国产亚洲av高清不卡| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 老司机午夜十八禁免费视频| 激情在线观看视频在线高清| 免费电影在线观看免费观看| 一级作爱视频免费观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 97人妻精品一区二区三区麻豆 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 日韩av在线大香蕉| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 久久国产乱子伦精品免费另类| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲一区高清亚洲精品| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 99热只有精品国产| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲av成人一区二区三| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲av成人一区二区三| 免费av毛片视频| 久久午夜亚洲精品久久| 看黄色毛片网站| 国产亚洲精品第一综合不卡| 黄片大片在线免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲精品一区av在线观看| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲avbb在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 久久久水蜜桃国产精品网| 无人区码免费观看不卡| 白带黄色成豆腐渣| 久久香蕉国产精品| √禁漫天堂资源中文www| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产亚洲欧美在线一区二区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品九九99| 在线av久久热| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 无人区码免费观看不卡| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成年人精品一区二区| 成年人黄色毛片网站| 看黄色毛片网站| www日本黄色视频网| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 久久中文看片网| 中国美女看黄片| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲片人在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 哪里可以看免费的av片| 免费看日本二区| 久久国产精品影院| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品永久免费网站| 精品人妻1区二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产高清videossex| 午夜视频精品福利| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 正在播放国产对白刺激| 国产男靠女视频免费网站| 欧美zozozo另类| 精品国产乱子伦一区二区三区| 999久久久国产精品视频| а√天堂www在线а√下载| 日韩欧美国产在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 又大又爽又粗| 亚洲午夜理论影院| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲,欧美精品.| 老司机午夜十八禁免费视频| 久久国产精品影院| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品野战在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 精品熟女少妇八av免费久了| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 桃红色精品国产亚洲av| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 黄色丝袜av网址大全| 好男人电影高清在线观看| 亚洲av熟女| 中文在线观看免费www的网站 | 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 我的亚洲天堂| av欧美777| 真人一进一出gif抽搐免费| 搞女人的毛片| www.999成人在线观看| 成年免费大片在线观看| 久久婷婷成人综合色麻豆| 露出奶头的视频| www.精华液| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 在线观看午夜福利视频| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲中文av在线| 午夜久久久在线观看| ponron亚洲| 欧美zozozo另类| 国产激情欧美一区二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 在线av久久热| 国产爱豆传媒在线观看 | www.熟女人妻精品国产| 亚洲成人精品中文字幕电影| 日本一区二区免费在线视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产午夜精品久久久久久| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费| 老鸭窝网址在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 岛国视频午夜一区免费看| 免费看日本二区| 悠悠久久av| 免费搜索国产男女视频| 中文字幕精品免费在线观看视频| 黄色视频不卡| 日本一本二区三区精品| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 中文亚洲av片在线观看爽| 俄罗斯特黄特色一大片| 丁香六月欧美| 国产精品二区激情视频| 天堂影院成人在线观看| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 999精品在线视频| 69av精品久久久久久| 99国产精品99久久久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日韩免费av在线播放| 久久精品成人免费网站| 色老头精品视频在线观看| 国产三级黄色录像| 欧美一级a爱片免费观看看 | 禁无遮挡网站| 又紧又爽又黄一区二区| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 免费人成视频x8x8入口观看| 一级毛片高清免费大全| 亚洲av成人av| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 婷婷精品国产亚洲av在线| 一区二区三区精品91| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 波多野结衣高清作品| 午夜福利成人在线免费观看| 成人三级黄色视频| 亚洲免费av在线视频| 妹子高潮喷水视频| 在线观看午夜福利视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 久久久精品欧美日韩精品| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 久久久国产成人精品二区| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲五月婷婷丁香| 久久香蕉精品热| 久久久久久久精品吃奶| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜免费鲁丝| 日本精品一区二区三区蜜桃| 级片在线观看| 午夜a级毛片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美成人午夜精品| 亚洲黑人精品在线| 99国产精品一区二区三区| 国产精品日韩av在线免费观看| 国产片内射在线| 国产在线观看jvid| 在线av久久热| 亚洲自拍偷在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 老司机靠b影院| a在线观看视频网站| 女性被躁到高潮视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 中文字幕久久专区| 免费在线观看完整版高清| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜福利18| 欧美日韩一级在线毛片| 黄色 视频免费看| 久久久久九九精品影院| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产精品精品国产色婷婷| 国产1区2区3区精品| 亚洲熟妇熟女久久| 99精品在免费线老司机午夜| 久久中文看片网| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 日韩成人在线观看一区二区三区| 99热6这里只有精品| 色哟哟哟哟哟哟| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 成人亚洲精品一区在线观看| 精品高清国产在线一区| 露出奶头的视频| 一级毛片精品| 国产精品日韩av在线免费观看| 黄片播放在线免费| 亚洲精品色激情综合| 中文字幕最新亚洲高清| 免费av毛片视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产主播在线观看一区二区| 日本三级黄在线观看| 午夜福利欧美成人| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 波多野结衣高清无吗| 日韩av在线大香蕉| 久久午夜综合久久蜜桃| 在线观看www视频免费| 日韩欧美三级三区| av福利片在线| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲激情在线av| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲国产欧美日韩在线播放| 中文字幕人妻熟女乱码| 精品国产亚洲在线| 久久午夜亚洲精品久久| 日韩欧美 国产精品| 最近在线观看免费完整版| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 制服诱惑二区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 两性夫妻黄色片| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久久国内视频| 动漫黄色视频在线观看| 久久久国产成人免费| 999久久久精品免费观看国产| 一本久久中文字幕| 色哟哟哟哟哟哟| 久久午夜亚洲精品久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产色视频综合| 欧美成人午夜精品| tocl精华| 午夜视频精品福利| 99热6这里只有精品| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品久久久av美女十八| 特大巨黑吊av在线直播 | 午夜福利成人在线免费观看| 日韩精品青青久久久久久| 久久久精品欧美日韩精品| www日本黄色视频网| a级毛片在线看网站| www.熟女人妻精品国产| 久久国产精品影院| 欧美黄色片欧美黄色片| 欧美日韩福利视频一区二区| 午夜日韩欧美国产| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久精品国产亚洲av高清一级| 一级毛片精品| 听说在线观看完整版免费高清| 精品高清国产在线一区| 91av网站免费观看| 手机成人av网站| 母亲3免费完整高清在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 免费看十八禁软件| 国产午夜福利久久久久久| 国产av又大| 久久久久久人人人人人| x7x7x7水蜜桃| 亚洲国产精品999在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 美女午夜性视频免费| 日韩欧美在线二视频| 欧美午夜高清在线| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 国产精品亚洲美女久久久| 51午夜福利影视在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 国产区一区二久久| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 国产一卡二卡三卡精品| 日日夜夜操网爽| 亚洲无线在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 俺也久久电影网| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜老司机福利片| 亚洲自拍偷在线| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品久久久久久精品电影 | 免费看美女性在线毛片视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久性视频一级片| 好男人电影高清在线观看| 最新在线观看一区二区三区| 日韩欧美一区视频在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲精品粉嫩美女一区| 又黄又粗又硬又大视频| 中国美女看黄片| 不卡一级毛片| 禁无遮挡网站| 久久久久亚洲av毛片大全| www国产在线视频色| 久久亚洲精品不卡| 男女那种视频在线观看| av有码第一页| 国产精品乱码一区二三区的特点| 十八禁人妻一区二区| 国产成人欧美| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 亚洲专区中文字幕在线| 性欧美人与动物交配| 久久久久亚洲av毛片大全| 后天国语完整版免费观看| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费看日本二区| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 日韩av在线大香蕉| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久国产欧美日韩av| 人人妻人人澡人人看| 成人特级黄色片久久久久久久| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 可以在线观看毛片的网站| 日本 av在线| 日韩有码中文字幕| 又紧又爽又黄一区二区| 一夜夜www| 成人一区二区视频在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 成人18禁在线播放| 搡老岳熟女国产| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 18禁观看日本| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 中亚洲国语对白在线视频| 日韩精品中文字幕看吧| 两个人视频免费观看高清| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品乱码一区二三区的特点| 听说在线观看完整版免费高清| 久久国产亚洲av麻豆专区| 哪里可以看免费的av片| 最近最新中文字幕大全电影3 | 人成视频在线观看免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 久久国产亚洲av麻豆专区| 男女之事视频高清在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 这个男人来自地球电影免费观看| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 十分钟在线观看高清视频www| 国产免费av片在线观看野外av| 99精品在免费线老司机午夜| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产亚洲av高清不卡| 黄色片一级片一级黄色片| 99re在线观看精品视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日韩视频一区二区在线观看| 国语自产精品视频在线第100页| 久9热在线精品视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲人成77777在线视频| 欧美精品亚洲一区二区| 一进一出抽搐动态| 一区二区日韩欧美中文字幕| 99精品在免费线老司机午夜| 51午夜福利影视在线观看| 国产黄片美女视频| www.www免费av| 成人特级黄色片久久久久久久| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产黄色小视频在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 两性夫妻黄色片| 亚洲自拍偷在线| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 欧美日韩一级在线毛片| 午夜a级毛片| 国内精品久久久久精免费| 性色av乱码一区二区三区2| 亚洲精品在线美女| 免费看日本二区| 亚洲久久久国产精品| 美国免费a级毛片| 桃红色精品国产亚洲av| 无遮挡黄片免费观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 香蕉丝袜av| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 午夜福利高清视频| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产精品99久久99久久久不卡| bbb黄色大片| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲精品色激情综合| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产色视频综合| 国产精品久久久av美女十八| 午夜免费鲁丝| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲中文av在线| 国产精品99久久99久久久不卡| 三级毛片av免费| 国产欧美日韩一区二区三| 黄片播放在线免费| 国产一区二区激情短视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 免费av毛片视频| 亚洲avbb在线观看| 在线观看一区二区三区| 欧美中文日本在线观看视频| 久久欧美精品欧美久久欧美| 中文字幕人妻熟女乱码| 中文亚洲av片在线观看爽| 一区二区三区精品91| 老熟妇仑乱视频hdxx| 日韩欧美在线二视频| 免费高清在线观看日韩| 国产精品亚洲一级av第二区| 十分钟在线观看高清视频www| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 色老头精品视频在线观看| 国产国语露脸激情在线看| 国产欧美日韩一区二区三| 成人永久免费在线观看视频| 好男人在线观看高清免费视频 | 中文字幕久久专区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品人妻1区二区| 国产在线精品亚洲第一网站| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 在线av久久热| 啦啦啦 在线观看视频| 国产精品免费视频内射| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美不卡视频在线免费观看 | 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 久热爱精品视频在线9| 国产97色在线日韩免费| 哪里可以看免费的av片| 久热爱精品视频在线9| 首页视频小说图片口味搜索| 一二三四社区在线视频社区8| 精品福利观看| av片东京热男人的天堂| 天堂√8在线中文| 国产精品一区二区精品视频观看| e午夜精品久久久久久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 国产精品1区2区在线观看.| 最新在线观看一区二区三区| 黄色视频不卡| 国产视频一区二区在线看| 91麻豆av在线| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| av在线天堂中文字幕| 12—13女人毛片做爰片一| 高清在线国产一区| 搡老妇女老女人老熟妇| 日韩精品青青久久久久久| 我的亚洲天堂| 国产精品久久视频播放| 美女大奶头视频|