地克珠利在鯽體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

林麗聰，樊海平*，廖碧釵，鐘全福，林煜

(1.福建省淡水水產(chǎn)研究所；2. 福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站：福建 福州 350002)

地克珠利在鯽體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究

林麗聰1，樊海平1*，廖碧釵2，鐘全福1，林煜1

(1.福建省淡水水產(chǎn)研究所；2. 福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站：福建 福州 350002)

在(25±1) ℃水溫條件下，按照鯽體質(zhì)量為3.0 mg/kg的劑量，混飼投喂地克珠利,每天1次，連用5 d，并于第5天投喂后0.5、1、1.5、2、3、5、7、10、12、15、18、24、36、48、72、120、240、360、480、720、1 080、1 440、2 160、2 880、3 600 h采集鯽的血漿和肌肉樣品，用高效液相色譜法測定血漿和肌肉中的藥物濃度，研究了地克珠利在鯽體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征。結(jié)果表明，鯽混飼投喂地克珠利后，其血漿和肌肉中地克珠利經(jīng)時過程均符合一級吸收二室開放模型，其理論方程分別為C血漿=9.89e-6.710E-3t+3.66e-9.04E-4t-0.74e-4.379t，C肌肉=1.026e-6.379E-2t+0.1001e-1.53E-2t-1.82e-5.566t。鯽血漿和肌肉的達(dá)峰時間(Tmax)分別為11.11和11.00 h，峰濃度(Cmax)分別為30.58和1.108 mg/L，藥時曲線下面積(AUC)分別為16 783和20.05 mg/(L·h )，消除半衰期(T1/2β)分別為827.6、45.41 h。實驗結(jié)果表明地克珠利在鯽體內(nèi)代謝緩慢。本研究為鯽的實際養(yǎng)殖過程中合理使用地克珠利提供理論依據(jù)，同時也為地克珠利在其他水產(chǎn)品中殘留量的測定及藥代動力學(xué)的研究提供技術(shù)支持。[中國漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017,7(1):16-21]

地克珠利；鯽；藥代動力學(xué)；高效液相色譜

地克珠利(diclazuril)屬于三嗪苯乙腈化合物，是由比利時Janssen公司于1986年研制開發(fā)的一種高效廣譜抗球蟲藥[1]。因其高效、廣譜、低毒性而在畜牧業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用[2]，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中也用于防治鯉科魚類球蟲、黏孢子蟲等孢子蟲病[3]。由于這類藥物作用時間短，在生產(chǎn)養(yǎng)殖中會被長期重復(fù)用藥、不合理用藥或未嚴(yán)格遵守休藥期，在動物體內(nèi)產(chǎn)生藥物殘留，進(jìn)而通過食物鏈傳遞，危害消費(fèi)者健康。1998年，F(xiàn)AO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)研究了地克珠利在兔體內(nèi)的毒物代謝動力學(xué)和致畸性實驗，發(fā)現(xiàn)地克珠利在高劑量(1 280 mg/kg b.w.·d)時具有致畸性；大于320 mg/kg b.w.·d時有胎兒毒性但無致畸性[4]。目前，地克珠利在家兔、雞組織中的殘留和消除規(guī)律研究報道較多[5-15]，而在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用研究較少。楊麗萍等[11-12]研究了地克珠利在家兔組織中的殘留及消除規(guī)律，發(fā)現(xiàn)地克珠利在腎臟中殘留量最高，且在腎臟中消除速度最快。張可煜等[15]研究了單次給藥后雛雞體內(nèi)地克珠利的血藥濃度，結(jié)果表明，地克珠利在雛雞體內(nèi)吸收比較快，消除緩慢。據(jù)報道，國內(nèi)外已制定出畜禽組織中地克珠利的最高殘留限量(MRL)：歐盟藥品管理局(Regulation(EC) No 2377/90)規(guī)定地克珠利在羊、兔、禽肌肉中的最高殘留限量為500 μg/kg；中國農(nóng)業(yè)部公告235號也規(guī)定了地克珠利在禽肌肉中的最高殘留限量為500 μg/kg[16-18]。2013年3月，歐洲獸用藥品管理委員會(CVMP) 在報道[19]中指出由于沒有用于檢測有鰭魚類肌肉中地克珠利殘留量的方法，因而無法制定地克珠利在有鰭魚類肌肉組織中的最高殘留限量。因此，目前國內(nèi)外均未制定地克珠利在魚體組織中的最高殘留限量。且國內(nèi)僅見劉永濤等[20]建立了地克珠利在魚體組織中殘留量的超高效液相色譜檢測方法。為此，本實驗利用高效液相色譜法測定鯽體內(nèi)的地克珠利濃度，研究其在鯽體內(nèi)的藥代動力學(xué)規(guī)律，為鯽養(yǎng)殖過程中合理使用該藥提供理論依據(jù)，并為地克珠利在其他水產(chǎn)品中殘留量的測定、藥代動力學(xué)研究，及其在魚體組織中的最高殘留限量的制定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鯽(Carassiusauratus)，300尾，平均體重為(150±20)g，由福建省淡水水產(chǎn)研究所榕橋中試基地提供，經(jīng)抽樣檢測，組織中無地克珠利殘留。于10個不銹鋼水族箱(每個箱體積為300 L，放水200 L)中飼養(yǎng)，每箱放鯽30尾，控制水溫為(25±1)℃，不間斷充氣增氧。實驗開始前一周停止投餌(餌料購自福州海馬飼料有限公司，經(jīng)檢測無地克珠利殘留)。地克珠利標(biāo)準(zhǔn)品(含量為99.9%)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；地克珠利原料藥(含量為98.0%)由重慶西南合成藥業(yè)提供；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗設(shè)計及采樣

1.2.1 餌料的制備

準(zhǔn)確稱取地克珠利原料藥1.0 g，加適量二甲亞砜溶解，加水對倍稀釋至100 mL,均勻噴至1.0 kg餌料上，50 ℃烘干，餌料表面再噴一層花生油，烘干。

1.2.2 給藥及樣品采集

稱取魚體重，按3.0 mg/kg投餌量投喂，每天投喂1次，連續(xù)投喂5 d。并于第5天投喂后0.5、1、1.5、2、3、5、7、10、12、15、18、24、36、48、72、120、240、360、480、720、1 080、1 440、2 160、2 880、3 600 h采集血漿和肌肉樣品，每個采樣點采10尾魚，5個平行。血漿、肌肉于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 色譜條件

高效液相色譜儀型號為Agilent 1200，帶有多波長紫外檢測器。色譜柱為Eclipse XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈:磷酸溶液(1 ∶1，V/V)，其中磷酸溶液由3.4 mL磷酸加水稀釋至1 L而成；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；紫外檢測波長為240 nm；進(jìn)樣量為50 μL。

1.4 樣品處理

1.4.1 血漿樣品

血漿樣品解凍后，準(zhǔn)確吸取1 mL置于15 mL離心管中，加入5 mL乙腈 ∶氯仿(9 ∶1，V/V)，再分別加入C18粉，中性氧化鋁各200 mg，漩渦混合3 min，5 000 r/min離心5 min后，取上清液于50 ℃氮?dú)獯蹈?，殘余物? mL流動相溶解，離心，過0.45 μm濾膜，待HPLC檢測。

1.4.2 肌肉樣品

肌肉樣品解凍，勻漿，準(zhǔn)確稱取2.0 g于50 mL離心管中，加入2 g無水硫酸鈉和4 mL乙腈，渦旋振蕩5 min，5 000 r/min離心3 min后，吸取乙腈層到15 mL離心管中；殘渣再加4 mL乙腈，重復(fù)提取1次，合并乙腈層，于50 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL流動相溶解殘留物后，加10 mL正己烷去脂，流動相層過0.45 μm濾膜，待HPLC檢測。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取地克珠利標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置100 mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容，使用時根據(jù)實驗要求用流動相稀釋至所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在1 mL空白血漿中加入適量已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使血漿中地克珠利濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 mg/L；在2.0 g空白肌肉中加入適量已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使肌肉中地克珠利含量分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、0.50 mg/kg，按1.4方法處理并檢測后，得到血漿和肌肉樣品的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.6 回收率和精密度

1.6.1 回收率的測定

在空白樣品中分別添加適量地克珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成含地克珠利分別為0.05、0.10和0.5 0 mg/L的血漿樣品和0.05、0.10和0.50 mg/kg 肌肉樣品，每個添加水平5個重復(fù)，按1.4方法進(jìn)行樣品前處理，考察方法的回收率。

1.6.2 精密度的測定

對空白血漿樣品在0.05、0.10和0.50 mg/L 3個濃度水平，空白肌肉在0.05、0.10和0.50 mg/kg 3個濃度水平上進(jìn)行精密度實驗，按1.4方法進(jìn)行樣品前處理后，每2小時測定一次，平行測定5次，計算日內(nèi)變異系數(shù)。每天測定1次，平行測定5次，計算日間變異系數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

將鯽血漿與肌肉樣品中地克珠利藥-時曲線采用PKSlover 1.0藥動學(xué)軟件進(jìn)行藥物動力學(xué)模型擬合及參數(shù)計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 高效液相色譜圖

在本實驗選定的色譜條件下，地克珠利保留時間為15.1 min左右，且峰形尖銳，對稱?？瞻籽獫{和肌肉中均無地克珠利峰。見圖1。

圖1 不同樣品中地克珠利色譜圖A：地克珠利標(biāo)準(zhǔn)品(0.5 mg·L-1)；B：在空白血漿中添加了地克珠利(0.5 mg·L-1)；C：空白血漿；D：在空白肌肉中添加了地克珠利(0.5 mg·kg-1)；E：空白肌肉；F：在空白肌肉中添加了地克珠利(定量限為40 μg·kg-1)。Fig.1 Chromatograms of diclazuril of different samplesA: The standard of diclazuril(0.5 mg·L-1); B: The blank plasma added diclazuril(0.5 mg·L-1); C: The blank plasma；D: The blank muscle added diclazuril(0.5 mg·kg-1); E: The blank muscle; F: The blank muscle added diclazuril(quantification limit： 40 μg·kg-1).

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢測限

將1.5實驗結(jié)果以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(表1)。結(jié)果表明，鯽血漿在0.05～5.0 mg/L線性范圍內(nèi)，肌肉在0.05～5.00 mg/kg線性范圍內(nèi)，地克珠利線性關(guān)系良好。以引起3倍基線噪音的藥物濃度為最低檢測限，血漿中地克珠利的最低檢測限為10 μg/L，定量限為40 μg/L；肌肉中的最低檢測限為10 μg/kg，定量限為40 μg/kg。

表1 鯽血漿和肌肉中地克珠利的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.3 回收率及精密度

從表2可知，本實驗條件下，地克珠利在鯽血漿的回收率為72.06%～80.21%，日內(nèi)精密度為1.27%～2.45%，日間精密度為3.13%～5.01%；地克珠利在鯽肌肉中的回收率為72.98%～74.29%，日內(nèi)精密度為1.76%～2.56%，日間精密度為2.17%～4.65%。上述實驗結(jié)果符合殘留檢測方法對回收率與精密度的要求。

2.4 地克珠利在鯽體內(nèi)的濃度變化及代謝動力學(xué)特征

按1.2方法給藥后，鯽血漿和肌肉中地克珠利的含量變化見表3，主要藥動學(xué)參數(shù)見表4。將地克珠利濃度-時間數(shù)據(jù)采用PKSlover 1.0藥動學(xué)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，鯽連續(xù)投喂地克珠利5 d后血漿及肌肉中的藥物經(jīng)時過程均符合一級吸收二室開放模型，其理論方程為：C血漿=9.89e-6.710E-3t+3.66e-9.04E-4t-0.74e-4.379t，C肌肉=1.026e-6.379E-2t+0.1001e-1.53E-2t-1.82e-5.566t。

表2 空白樣品中添加地克珠利的回收率及精密度

表3 地克珠利在鯽血漿和肌肉中的藥物濃度

注：“ND”為未檢出。

表4 地克珠利在鯽體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)

注：A為分布相的零時截距；α為一級分布速率常數(shù)；B為消除相的零時截距；β為一級消除速率常數(shù)；Ka為吸收速率常數(shù)；T1/2α為分布半衰期；T1/2β為消除半衰期；T1/2ka為吸收半衰期；Tmax為達(dá)峰時間；Cmax為峰濃度；AUC為藥時曲線下面積。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，在該實驗條件下，鯽血漿和肌肉中地克珠利的藥物代謝動力學(xué)過程均符合一級吸收二室開放模型。地克珠利在鯽血漿中的達(dá)峰時間為11.11 h,達(dá)峰濃度為30.58 mg/L，消除半衰期為827.6 h，而肌肉中達(dá)峰時間為11.00 h,達(dá)峰濃度為1.108 mg/kg，消除半衰期為45.41 h，可見地克珠利在血漿和肌肉中達(dá)峰時間相近，而血漿中峰濃度比肌肉中高出30倍左右，且消除較肌肉中緩慢得多。該研究結(jié)果表明地克珠利在鯽體內(nèi)吸收比較迅速，但消除緩慢，屬慢速消除藥物，殘留在機(jī)體內(nèi)的藥物增加了耐藥性發(fā)生的可能性。因此，在生產(chǎn)應(yīng)用中應(yīng)采用輪換用藥、穿梭用藥等措施抑制耐藥性的發(fā)生和藥物殘留。張可煜等[15]采用高效液相色譜法研究地克珠利在雛雞體內(nèi)的藥動學(xué)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地克珠利在雛雞體內(nèi)藥物吸收快、消除慢，容易在體內(nèi)蓄積；Meuldermans等[21-22]研究1 mg/kg b.w.) 劑量的14C標(biāo)記地克珠利與乳糖混合物單次給藥后在肉雞、火雞體內(nèi)的代謝時，發(fā)現(xiàn)血液中藥物濃度比組織中高2～l0倍。說明地克珠利在鯽體內(nèi)的藥動學(xué)特征與禽類類似。

通過研究地克珠利在鯽體內(nèi)的藥代動力學(xué)規(guī)律，從而為鯽養(yǎng)殖過程中合理使用該藥提供理論依據(jù)，也為水產(chǎn)品中地克珠利的殘留量的測定、藥代動力學(xué)研究，及最高殘留限量的制定提供技術(shù)支持。

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Pharmacokinetics of diclazuril inCarassiusauratus

LIN Licong1，F(xiàn)AN Haiping1*，LIAO Bichai2，ZHONG Quanfu1，LIN Yu1

(1.The Freshwater Fisheries Research Institute of Fujian Province;2. Fujian Fishery Technical Extension Center: Fuzhou 350002, China)

At water temperature of (25±1) ℃,Carassiusauratuswas treated by oral administration of diclazuril in dose of 3 mg/kg once a day for 5 d. The concentration of diclazuril in the plasma and muscle ofCarassiusauratusat 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 5, 7, 10, 12, 15, 18, 24, 36, 48, 72, 120, 240, 360, 480, 720, 1 080, 1 440, 2 160, 2 880 and 3 600 h after feeding were determined by high performance liquid chromatography, and the pharmacokinetics of diclazuril inCarassiusauratuswere studied．The results showed that following oral administration, the plasma and muscle concentration-time course of diclazuril both conformed to a two-compartment open model with the first order absorption. The pharmacokinetic equations were as follows,Cplasma=9.89e-6.710E-3t+3.66e-9.04E-4t-0.74e-4.379t,Cmuscle=1.026e-6.379E-2t+0.1001e-1.53E-2t-1.82e-5.566t. The time to peak (Tmax) of diclazuril in plasma and muscle were 11.11 and 11.00 h, respectively, and the peak concentration (Cmax) were 30.58 and 1.108 mg/L, respectively, and the area under the concentration-time curve (AUC) were 16 783 and 20.05 mg/(L·h ), respectively, and the elimination half-life(T1/2β)were 827.6 and 45.41 h, respectively.The results showed that diclazuril was eliminated slowly fromCarassiusauratus. This study provided theoretical basis for the actual breeding ofCarassiusauratuswith diclazuril, and technical support for the determination of residues and pharmacokinetic study of diclazuril in the other aquatic products. [Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(1):16-21]

diclazuril;Carassiusauratus; pharmacokinetics; high performance liquid chromatography

FAN Haiping, fanhaiping16@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.01.003

2016-06-15；接收日期：2016-10-15

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-46-35)

林麗聰(1982-)，女，碩士，高級工程師，研究方向為水產(chǎn)品藥物代謝動力學(xué)與質(zhì)量安全， linlicong82@163.com 通信作者：樊海平，研究員，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖動物病害防治，fanhaiping16@163.com

S94

A

2095-1833(2017)01-0016-05