Toll樣受體4/NF—κB信號通路在依達(dá)拉奉影響單肺通氣患者炎性細(xì)胞因子中的作用

李恩琪++++++帥訓(xùn)軍++++++閆戰(zhàn)秋++++++艾登斌++++++侯念果

[摘要] 目的 探討Toll樣受體4（TLR4）/NF-κB信號通路在依達(dá)拉奉影響單肺通氣患者炎性細(xì)胞因子中的作用。 方法 選擇青島市市立醫(yī)院2015年12月～2016年5月?lián)衿谛蟹稳~切除術(shù)的肺癌患者40例，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為對照組（n=20）和依達(dá)拉奉組（n=20），兩組均按咪唑安定0.03 mg/kg，芬太尼3 μg/kg，維庫溴銨0.1 mg/kg，吸入8%七氟醚常規(guī)麻醉誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后，依達(dá)拉奉組給予依達(dá)拉奉0.5 mg/kg加入氯化鈉注射液100 mL靜脈滴注；對照組給予等量氯化鈉注射液靜脈滴注。兩組分別于麻醉誘導(dǎo)后（T0），單肺通氣即刻（T1），單肺通氣后60 min（T2），肺組織離體即刻（T3），膨肺后30 min（T4），術(shù)后120 min（T5）采集靜脈血，ELISA法檢測血漿IL-6、IL-10的濃度。分別于T1、T3時刻切取肺癌周邊的正常肺組織，Western blot法檢測肺組織TLR4、細(xì)胞核NF-κB P65蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果 與T0比較，兩組患者IL-6、IL-10血漿濃度以及IL-6/IL-10比值于T2～T5時刻均明顯上升（P<0.05）。與T1比較，兩組患者肺組織TLR4、細(xì)胞核NF-κB P65蛋白的表達(dá)水平于T3時刻明顯上升（P<0.05）。與對照組比較，依達(dá)拉奉組患者IL-6血漿濃度以及IL-6/IL-10比值于T2～T5時刻均顯著降低（P<0.05），肺組織TLR4、細(xì)胞核NF-κB P65蛋白的表達(dá)水平于T3時刻顯著降低（P<0.05）。 結(jié)論 TLR4/NF-κB信號通路參與了依達(dá)拉奉抑制單肺通氣患者炎性反應(yīng)的過程，能抑制促炎性細(xì)胞因子的生成和釋放，維持促炎/抗炎性細(xì)胞因子的相對平衡。

[關(guān)鍵詞] Toll樣受體4；NF-κB；依達(dá)拉奉；單肺通氣；細(xì)胞因子

[中圖分類號] R563 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）11（b）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate the role of TLR4/NF-κB signal pathway in edaravone affect cytokines in patients undergoing one lung ventilation（OLV）. Methods Fourty lung cancer patients undergoing elective lung resection in Qingdao Municipal Hospital from December 2015 to May 2016， were randomly divided into control group （group C， n=20） and edaravone group （group E， n=20）. Anesthesia was induced with midazolam 0.03 mg/kg， fentanyl 3 μg/kg， vecuronium bromide 0.1 mg/kg and 8% sevoflurane. After induction of anesthesia， group E received edaravone 0.5 mg/kg（diluted in sodium chloride injection 100 mL）， and the patients in group C were received with the same amount of sodium chloride injection. Venous blood sample were taken after anesthesia induction（T0），immediately after onset of OLV（T1），at 60 min of OLV（T2）， lung tissue in vitro instantly（T3）， 30 min after lungs were inflated（T4） and at 120 min after surgery（T5） for determination of IL-6 and IL-10 levels by ELISA. The specimens of normal lung tissues around the lung cancer were obtained at T1 and T3. Using Western blot， the expression level of TLR4，NF-κB P65 in lung tissues were measured. Results Compared with T0， plasma IL-6， IL-10 concentration and the ratio of IL-6/IL-10 were all significantly higher at T2-5 （P < 0.05） in two groups. Compared with T1， the expression of TLR4， NF-κB P65 in lung tissues were significantly higher at T3 （P < 0.05）. Compared with group C， plasma IL-6 concentration and the ratio of IL-6/IL-10 at T2-5 were significantly lower in group E than those in group C （P < 0.05）， the expression of TLR4， NF-κB P65 in lung tissues were significantly lower at T3 in group E than those in group C （P < 0.05）. Conclusion TLR4/NF-κB pathway is involved in edaravone inhibiting inflammatory response in patients undergoing OLV， which can reduce the expression and release of proinflammatory cytokines， and maintain the balance between inflammatory factors.

[Key words] TLR4； NF-κB； Edaravone； One lung ventilation； Proinflammatory cytokines

單肺通氣已被廣泛應(yīng)用在胸科手術(shù)中，可為外科提供相對靜止的術(shù)野，有利于術(shù)者操作，但術(shù)中單肺通氣及手術(shù)操作可導(dǎo)致機(jī)體多種促炎性細(xì)胞因子釋放而觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后[1-2]。依達(dá)拉奉是一種新型的氧自由基清除劑，可抑制機(jī)體炎性反應(yīng)過程、維持促炎性細(xì)胞因子/抗炎性細(xì)胞因子的相對平衡[3]。Toll樣受體4（TLR4）是一種模式識別受體，當(dāng)與配體結(jié)合時，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引起炎性細(xì)胞因子的大量表達(dá)與釋放[4-5]。依達(dá)拉奉抑制炎性反應(yīng)的機(jī)制是否與TLR4/NF-κB通路有關(guān)尚有待研究。本文研究TLR4/NF-κB信號通路在依達(dá)拉奉抑制單肺通氣患者炎性反應(yīng)中的作用，旨在探討依達(dá)拉奉抗炎性反應(yīng)的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇青島市市立醫(yī)院2015年12月～2016年5月?lián)衿谛蟹稳~切除術(shù)的肺癌患者40例，本次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為依達(dá)拉奉組和對照組，每組20例。

入選標(biāo)準(zhǔn)：ASAⅠ級或Ⅱ級；年齡49～75歲，體重55～86 kg；術(shù)前無嚴(yán)重的心、肺功能障礙，肝、腎功能未見異常，無免疫、內(nèi)分泌、神經(jīng)以及精神系統(tǒng)等疾病；近期無感染。

排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)中單肺通氣失??；無法維持氧合；術(shù)中持續(xù)的血流動力學(xué)不穩(wěn)。

兩組患者在性別比例、年齡、體重、手術(shù)時間以及單肺通氣時間等方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表1。

1.2 麻醉方法

麻醉誘導(dǎo)：患者入手術(shù)室開放外周靜脈通路，常規(guī)監(jiān)測患者心率（HR），無創(chuàng)血壓（BP），心電圖（ECG），脈搏血氧飽和度（SpO2），行全身麻醉，靜脈依次注射咪唑安定0.03 mg/kg、芬太尼3 μg/kg，高流量（新鮮氣流量8～10 L/min）吸入8%七氟醚，待意識消失后將新鮮氣流量降至2 L/min、七氟醚呼氣末濃度降至2%，靜脈注射維庫溴銨0.1 mg/kg，3 min后插入雙腔支氣管導(dǎo)管。兩組患者均用纖維支氣管鏡確定雙腔管導(dǎo)管的位置。誘導(dǎo)后，對患者進(jìn)行橈動脈和中心靜脈穿刺置管，測定平均動脈壓（MAP）和中心靜脈壓（CVP），以便觀察患者血流動力學(xué)方面的變化。依達(dá)拉奉組給予依達(dá)拉奉（商品名：必存，江蘇先聲藥業(yè)有限公司，批號：80-130103）0.5 mg/kg加入氯化鈉注射液100 mL，30 min內(nèi)靜脈滴注完畢；對照組給予等量氯化鈉注射液。

麻醉維持：兩組患者均間斷靜脈注射維庫溴銨0.04～0.08 mg/kg、芬太尼0.05～0.1 mg，七氟醚呼氣末濃度維持在1.7%～2.8%。單肺通氣時雙腔管非通氣側(cè)與大氣相通，呼吸參數(shù)調(diào)整為8～10 ml/kg，呼吸頻率為12～14次/min，維持呼氣末二氧化碳分壓（PetCO2）在35～40 mmHg。

術(shù)畢，待患者意識恢復(fù)，吞咽及咳嗽反射活躍，潮氣量及每分通氣量恢復(fù)正常，拔出雙腔氣管導(dǎo)管，安全送往恢復(fù)室觀察。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 術(shù)中指標(biāo) 應(yīng)用Datex-Ohmeda AS/3多功能監(jiān)測儀（Datex-Ohmeda公司，美國）監(jiān)測HR、ECG、SpO2、BP、PETCO2、七氟醚呼氣末濃度和氣道阻力。觀察記錄兩組患者的手術(shù)時間、單肺通氣時間以及麻醉誘導(dǎo)后（T0），單肺通氣即刻（T1），單肺通氣后60 min（T2），肺組織離體即刻（T3），膨肺后30 min（T4），術(shù)后120 min（T5）的HR、MAP和CVP。

1.3.2 ELISA法檢測血漿IL-6、IL-10的濃度 兩組患者分別在T0～T5時刻抽取靜脈血，嚴(yán)格按照試劑盒使用說明測定血漿IL-6、IL-10的濃度，并計(jì)算IL-6/IL-10比值。

1.3.3 Western blot法檢測肺組織TLR4蛋白、細(xì)胞核NF-κB蛋白 于T1時刻在預(yù)切除的肺葉上距腫瘤邊緣>5 cm處取第一塊肺組織，肺葉離體時在第一塊取材臨近部位再取第二塊肺組織，-80℃保存待檢[6]。取肺組織切成細(xì)小的碎片，加入組織/細(xì)胞裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，離心后取上清，即為肺組織蛋白；嚴(yán)格按照核蛋白提取試劑盒提取肺組織核蛋白。BCA法檢測蛋白濃度，加入樣本孔中，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后加入兔抗人TLR4一抗、兔抗人NF-κB P65一抗，兔抗人β-action，4℃孵育過夜，洗滌后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗，孵育，加入化學(xué)發(fā)光試劑，曝光后顯影，定影，分析目標(biāo)條帶灰度值與β-action的灰度值的比值，以反應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血流動力學(xué)的比較

兩組患者圍術(shù)期的血流動力學(xué)平穩(wěn)，T0～T5時點(diǎn)的HR、MAP、CVP比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.2 兩組患者血漿IL-6、IL-10濃度及IL-6/IL-10比值的比較

與T0時點(diǎn)比較，兩組患者血漿IL-6、IL-10濃度以及IL-6/IL-10比值于T2～T5時刻明顯上升（P<0.05）。與對照組比較，依達(dá)拉奉組患者血漿IL-6濃度以及IL-6/IL-10比值于T2～T5時刻顯著降低（P<0.05）。見表3。

2.3 兩組患者TLR4和NF-κB P65蛋白表達(dá)的比較

與T1比較，兩組患者肺組織TLR4、細(xì)胞核NF-κB P65蛋白的表達(dá)水平于T3時刻明顯上升（P<0.05）。與對照組比較，依達(dá)拉奉組肺組織TLR4、細(xì)胞核NF-κB P65蛋白的表達(dá)水平于T3時刻顯著降低（P<0.05）。見表4。

3 討論

單肺通氣已被廣泛用于胸外科手術(shù)，為手術(shù)提供良好術(shù)野。但單肺通氣屬非生理狀態(tài)，開胸側(cè)肺完全萎陷，萎陷肺組織血流減少、肺泡組織缺氧和通氣/血流比例失調(diào)，手術(shù)操作、機(jī)械通氣也會造成肺組織損傷，膨肺時缺血再灌注進(jìn)一步加重機(jī)體炎性細(xì)胞因子失衡進(jìn)而促發(fā)全身炎性反應(yīng)[7-9]，從而嚴(yán)重影響患者預(yù)后。所以，有效抑制單肺通氣患者過度炎性反應(yīng)至關(guān)重要。

依達(dá)拉奉是一種新型氧自由基清除劑，可以抑制脂質(zhì)自由基生成，并抑制促炎性細(xì)胞因子表達(dá)[10]。IL-6是機(jī)體炎癥反應(yīng)早期應(yīng)答因子，其水平急劇上升可反映促炎性因子大量激活，而IL-10是機(jī)體重要的抗炎性細(xì)胞因子，能負(fù)性調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答反應(yīng)[11-12]。IL-6/IL-10比值可大致反映機(jī)體促炎/抗炎性細(xì)胞因子相對平衡，預(yù)測患者預(yù)后，比值升高提示預(yù)后不佳。本研究結(jié)果表明，依達(dá)拉奉組在T2～T5時刻，IL-6血漿濃度和IL-6/IL-10比值顯著低于對照組，提示依達(dá)拉奉可有效抑制促炎性細(xì)胞因子生成，維持促炎/抗炎性因子相對平衡，與相關(guān)研究結(jié)果一致[1]。

TLR4是機(jī)體固有免疫反應(yīng)的重要組成部分，是一種細(xì)胞表面信號傳導(dǎo)跨膜受體，在人體內(nèi)分布廣泛，幾乎表達(dá)于所有的細(xì)胞系[13-14]。單肺通氣時引起的病理變化導(dǎo)致內(nèi)源性配體與TLR4結(jié)合[15-16]，最終激活NF-κB，NF-κB是由P50亞基和P65亞基組成的異源二聚體，激活后與抑制蛋白分離，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，P65末端含有反式激活結(jié)構(gòu)域，有激活基因轉(zhuǎn)錄功能，調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)基因表達(dá)，從而促進(jìn)TNF-α、IL-6等促炎性細(xì)胞因子表達(dá)與釋放[17-20]。本研究結(jié)果顯示，依達(dá)拉奉組肺組織TLR4、細(xì)胞核內(nèi)NF-κB P65蛋白表達(dá)水平顯著低于對照組，與促炎性細(xì)胞因子IL-6血漿濃度和IL-6/IL-10比值變化相一致，提示依達(dá)拉奉可通過抑制TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而減少促炎性細(xì)胞因子生成，從而抑制過度炎癥反應(yīng)，維持促炎/抗炎性細(xì)胞因子相對平衡。

綜上所述，TLR4/NF-κB信號通路參與依達(dá)拉奉抑制單肺通氣患者促炎性細(xì)胞因子的生成和釋放，維持了促炎/抗炎性細(xì)胞因子相對平衡。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 帥訓(xùn)軍，于洋，艾登斌，等.不同麻醉下依達(dá)拉奉對開胸手術(shù)單肺通氣患者炎性反應(yīng)的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志，2010，30（1）：113-115.

[2] Sugasawa Y，Yamaguchi K，Kumakura S，et al. The effect of one-lung ventilation upon pulmonary inflammatory responses during lung resection [J]. J Anesth，2011，25（2）：170-177.

[3] Tajima S，Soda M，Bando M，et al.Preventive effects of edaravone，a free radical scavenger，on lipopolysaccharide-induced lung injury in mice [J]. Respirology，2008，13（5）：646-653.

[4] Connor AJ，Laskin JD，Laskin DL. Ozone-induced lung injury and sterile inflammation. Role of toll-like receptor 4 [J]. Exp Mol Pathol，2012，92（2）：229-235.

[5] Hu R，Xu H，Jiang H，et al.The role of TLR4 in the pathogenesis of indirect acute lung injury [J]. Front Biosci （Landmark Ed），2013，18（1）：1244-1255.

[6] 郭瓊梅，周長浩，陳歡，等.右美托咪定對單肺通氣患者血漿IL-8、IL-10及肺組織AQP1表達(dá)的影響[J].臨床麻醉學(xué)雜志，2016，32（3）：245-247.

[7] Della Rocca G，Coccia C. Acute lung injury in thoracic surgery [J]. Curr Opin Anaesthesiol，2013，26（1）：40-46.

[8] Lohser J，Slinger P. Lung Injury After One-Lung Ventilation：A Review of the Pathophysiologic Mechanisms Affecting the Ventilated and the Collapsed Lung [J]. Anesth Analg，2015，121（2）：302-318.

[9] Yu J，Li R. Effects of dexmedetomidine preconditioning attenuating remote lung injury of lower limb ischemia-reperfusion [J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2014，94（44）：3510-3514.

[10] Wu Z，Ming Y，Zhang Z，et al. Edaravone rescues the lung by inhibiting lipid peroxidation and pro-inflammatory cytokines in a rat model [J]. Chin Med J （Engl），2014，127（5）：968-970.

[11] Van Der Wal S，Vaneker M，Steegers M，et al. Lidocaine increases the anti-inflammatory cytokine IL-10 following mechanical ventilation in healthy mice [J]. Acta Anaesthesiol Scand，2015，59（1）：47-55.

[12] Gao W，Liu D，Li D，et al. Effect of Therapeutic Hypercapnia on Inflammatory Responses to One-lung Ventilation in Lobectomy Patients [J]. Anesthesiology，2015，122（6）：1235-1252.

[13] Imai Y，Kuba K，Neely GG，et al. Identification of oxidative stress and Toll-like receptor 4 signaling as a key pathway of acute lung injury [J]. Cell，2008，133（2）：235-249.

[14] Zanotti G，Casiraghi M，Abano JB，et al. Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema [J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2009，297（1）：L52-L63.

[15] Wu Y，Liu Y，Huang H，et al. Dexmedetomidine inhibits inflammatory reaction in lung tissues of septic rats by suppressing TLR4/NF-κB pathway [J]. Mediators Inflamm，2013，2013：562154.

[16] Feng G，Sun B，Li TZ. Daidzein attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury via toll-like receptor 4/NF-kappaB pathway [J].Int Immunopharmacol，2015，26（2）：392-400.

[17] Müller JM，Ziegler-Heitbrock HW，Baeuerle PA. Nuclear factor kappa B，a mediator of lipopolysaccharide effects [J]. Immunobiology，1993，187（3-5）：233-256.

[18] Schuliga M.NF-kappaB Signaling in Chronic Inflammatory Airway Disease [J]. Biomolecules，2015，5（3）：1266-1283.

[19] You Z，F(xiàn)eng D，Xu H，et al. Nuclear factor-kappa B mediates one-lung ventilation-induced acute lung injury in rabbits [J]. J Invest Surg，2012，25（2）：78-85.

[20] 王媛媛，曹建，陳勤，等.依達(dá)拉奉對肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞NF-κB和IL-6，IL-8表達(dá)及凋亡的影響[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，11（7）：8-12.