天麻提取物作為流感疫苗佐劑的免疫效果及安全性

朱喆+++耿興良++李映波

[摘要] 目的 探討天麻提取物作為流感疫苗佐劑的免疫效果及安全性。 方法 將BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。天麻提取物佐劑組：含血凝素1.8 μg，天麻提取物0.2 mg；氫氧化鋁佐劑組：含血凝素1.8 μg，氫氧化鋁佐劑0.2 mg；單獨(dú)疫苗組：含血凝素1.8 μg；空白對照組：注射生理鹽水0.2 mL。采用腿部肌內(nèi)注射方式分別于0、21 d免疫2次，每次0.2 mL/只。自初次免疫開始，每隔7 d收集血清，測定小鼠血凝抑制抗體效價(jià)。初次免疫后7 d內(nèi)，每天稱量一次小鼠體重，監(jiān)測各組小鼠的體重變化。 結(jié)果 天麻提取物佐劑組各時間點(diǎn)的血凝抑制抗體效價(jià)顯著高于單獨(dú)疫苗組、空白對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；天麻提取物佐劑組與氫氧化鋁佐劑組初次免疫后7、28 d的血凝抑制抗體效價(jià)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示其能提前產(chǎn)生免疫增強(qiáng)效果。各組組內(nèi)不同時間點(diǎn)的血凝抑制抗體效價(jià)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。各組小鼠初次免疫后7 d內(nèi)體重變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），注射部位未見不良反應(yīng)產(chǎn)生。 結(jié)論 天麻提取物作為疫苗佐劑，具有良好的安全性，且佐劑效果明顯，有望成為流感滅活疫苗的新型免疫佐劑。

[關(guān)鍵詞] 流感疫苗；佐劑；天麻；提取物

[中圖分類號] R93；R392-33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）11（a）-0004-04

流感是實(shí)行全球性監(jiān)測的傳染病，具有傳播速度快、傳染性強(qiáng)等特點(diǎn)[1]。目前預(yù)防流感最主要的手段是接種疫苗[2]。對潛在的大流行性流感病毒的各種疫苗的研究和開發(fā)應(yīng)用，是大流行防備計(jì)劃的一個重要舉措之一[3]。佐劑加入流感疫苗中能夠增強(qiáng)疫苗的免疫原性，降低抗原的用量[4]，擴(kuò)大流感疫苗的生產(chǎn)數(shù)量[5]。

天麻（Gastrodia elata Bl.）屬蘭科植物，其干燥塊莖入藥，氣微，味甘。具有熄風(fēng)止痙，平抑肝陽，祛風(fēng)通絡(luò)的功效?？捎糜谥委熜后@風(fēng)、癲癇抽搐、破傷風(fēng)、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木和風(fēng)濕痹痛等[6]?，F(xiàn)代研究表明天麻具有增強(qiáng)特異性抗體生成以及細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能[7]。

本研究首次選取天麻提取物作為滅活H3N2流感疫苗佐劑的效果，并與氫氧化鋁佐劑對照組、疫苗組的佐劑效果進(jìn)行比較，為其作為流感疫苗佐劑的可行性及安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物及材料

清潔級BALB/c小鼠，雄性，28日齡，體重18～22 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院（北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院）醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所（以下簡稱“我所”）動物中心提供，動物許可證號：SCXK（滇）2010-0003，合格證號：53002100000006；實(shí)驗(yàn)前將小鼠置于常溫動物房中，飼養(yǎng)1周。流感病毒為H3N2A/Victoria/210/2009NYMC X-187，來源于WHO/NIBSC。H3N2流感病毒滅活疫苗單價(jià)原液為本實(shí)驗(yàn)室制備及保藏（血凝素含量為126 μg/mL）。天麻[來源于昭通天麻，昆明道地中藥飲片廠惠贈，經(jīng)昆明天紫江藥廠工程師馮波（國家中藥學(xué)職業(yè)藥師）鑒定為Gastrodia elata Bl.）；氫氧化鋁佐劑（濃度為14 mg/mL）由我所制備；受體破壞酶（receptordestroying enzyme，RDE）購自日本Seiken公司。

1.2 方法

1.2.1 天麻提取物制備 取天麻粉末100 g，以液料比10∶1加入60°C的蒸餾水1000 mL，超聲波破碎儀提取20 min后離心，上清液過濾后進(jìn)行冷凍干燥，即為天麻提取物。

1.2.2 動物分組及免疫 將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。天麻提取物佐劑組：注射含血凝素1.8 μg，天麻提取物0.2 mg的疫苗0.2 mL[8]；氫氧化鋁佐劑組：注射含血凝素1.8 μg，氫氧化鋁0.2 mg的疫苗0.2 mL；單獨(dú)疫苗組：注射含血凝素1.8 μg的疫苗0.2 mL；空白對照組：注射生理鹽水0.2 mL。分別于0、21 d免疫2次，每次經(jīng)腿部肌內(nèi)注射，0.2 mL/只。

1.2.3 各組免疫效果檢測 于初次免疫后每隔7 d采集小鼠尾動脈血，分離血清，檢測血凝抑制抗體效價(jià)[9]，連續(xù)檢測6周。

1.2.4 天麻提取物作為流感疫苗佐劑對小鼠生長情況的影響 自初次免疫之日起，連續(xù)7 d，每天稱量1次小鼠體重，記錄小鼠體重變化，通過對小鼠體重變化的統(tǒng)計(jì)分析，看天麻提取物佐劑組小鼠體重與其他對照組有無差異，并觀察小鼠注射部位有無不良反應(yīng)出現(xiàn)，從而初步評價(jià)天麻提取物佐劑的安全性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組內(nèi)不同時間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻提取物的佐劑效果

天麻提取物佐劑組各時間點(diǎn)的小鼠血清血凝抑制抗體效價(jià)均高于單獨(dú)疫苗組，從抗體效價(jià)趨勢圖（圖1）中可明顯看出兩組差距較大。在不同時間點(diǎn)，天麻提取物佐劑組與單獨(dú)疫苗組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說明天麻提取物作為流感疫苗佐劑具有較好的佐劑效果。在初次免疫后的第7天及第28天，天麻提取物佐劑組與氫氧化鋁佐劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而其他時間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），可初步表明該提取物佐劑的免疫增強(qiáng)作用先于氫氧化鋁佐劑組產(chǎn)生。在抗體最高即初次免疫后35 d時，天麻提取物佐劑組與氫氧化鋁佐劑組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），說明在抗體產(chǎn)生峰值時，天麻提取物佐劑與氫氧化鋁佐劑效果相當(dāng)；35 d后，各組抗體水平回落，于初次免疫后42 d時，天麻提取物佐劑組與氫氧化鋁佐劑組趨于一致。見表1、圖1。

對組內(nèi)不同時間點(diǎn)的血凝抑制抗體效價(jià)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，球形檢驗(yàn)結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），不滿足球形分布假設(shè)，對其進(jìn)行多變量方差分析以及自由度調(diào)整后，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，時間因素（即初次免疫后7、14、21、28、35、42 d）的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），說明各時間點(diǎn)的血凝抑制抗體效價(jià)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；時間因素分組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），表明時間因素和分組之間具有交互作用，不同時間點(diǎn)的血凝抑制抗體效價(jià)隨著分組的不同而不同。多組間整體比較顯示各組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；組間兩兩比較結(jié)果顯示天麻提取物佐劑組與氫氧化鋁佐劑組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而與其他組之間的比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），進(jìn)一步說明天麻提取物具有較好的佐劑效果，且與氫氧化鋁佐劑效果相當(dāng)。

2.2 天麻提取物對小鼠生長情況的影響

對小鼠在初次免疫后7 d內(nèi)的體重變化數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[F=1.451，F(xiàn) 0.05]，表明各組小鼠體重增長變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對于天麻提取物佐劑組與其他各組之間進(jìn)行多重比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），表明天麻提取物佐劑組體重變化與其他組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。觀察注射部位，未發(fā)現(xiàn)明顯不良反應(yīng)現(xiàn)象，從而初步證明，此天麻提取物佐劑具有良好的安全性。

3 討論

據(jù)估計(jì)，全球每年有300萬～500萬例嚴(yán)重的流感病例，造成250 000～500 000例死亡，給人類的生命安全及社會的經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來嚴(yán)重的威脅[10]。流感病毒具有多種亞型，且變異性強(qiáng)[11]，目前一些流感抗病毒藥物可用于重癥流感住院或一些流行病的早期階段[12]。在流感疫苗研究中，改進(jìn)現(xiàn)有疫苗技術(shù)，佐劑的研究仍然是其中重要的一步；盡管水包油型的乳佐劑MF59能夠增加?jì)雰杭竟?jié)性流感的免疫反應(yīng)，但是，面對健康的成年人、老年人和免疫低下的人群卻不能起到相同的功效[13]。因此研發(fā)出一種良好的疫苗佐劑以應(yīng)用于流感疫苗，對于流感疫苗的足量供應(yīng)以應(yīng)對疫情暴發(fā)具有重大意義[14]。

我國中草藥資源豐富，其作為疫苗佐劑具有毒性低、免疫原性低、能夠降解等優(yōu)點(diǎn)，而成為近幾年疫苗佐劑研究的一個熱點(diǎn)[15]。目前研究較多的是中草藥提取多糖佐劑、皂苷佐劑、菊粉佐劑等。從臺灣紫芝中提取的多糖PS-F2能夠在體外刺激樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子（TNF）-α、白介素（IL）-6、IL-12和IL-23以及表達(dá)成熟的CD40、CD80和CD86分子；其作為佐劑進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛘T導(dǎo)Th1激活的適應(yīng)性免疫反應(yīng)，用于疫苗中能夠有效抵抗病毒和腫瘤[16]。從酸漿果實(shí)成熟的莖中用堿提取出的水溶性酸性雜多糖（WSPA），其用作DNA疫苗（pd-hsp90c）免疫小鼠能夠顯著增強(qiáng)小鼠特異性抗體IgG、IgG1、IgG2b抗體滴度[17]。一種新的基于三角菊粉微粒多糖佐劑用于滅活甲型H1N1疫苗可以幫助解決新生兒免疫反應(yīng)低下的問題，其用于幼犬及幼鼠能夠顯著增強(qiáng)體液免疫及細(xì)胞免疫[18]。QS21，一種來自于皂樹的天然皂苷，由兩個同分異構(gòu)體組成，是目前很有發(fā)展前景的佐劑之一，已被應(yīng)用于許多臨床實(shí)驗(yàn)中[19]，但由于其毒副作用以及作用分子機(jī)制不清楚等而限制了其進(jìn)一步應(yīng)用[20]。從中草藥中篩選出一種可用的疫苗佐劑具有較強(qiáng)的可行性及重要性，仍有許多種類的中草藥有待進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)選取了天麻提取物進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，檢測其作為流感疫苗佐劑的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天麻提取物具有良好的佐劑效果，能有效提高血凝抑制抗體效價(jià)，可減少抗原用量，并增強(qiáng)免疫效果，而其抗體產(chǎn)生的時間也較鋁佐劑更早、更快。且天麻提取物沒有對小鼠的生長狀況產(chǎn)生明顯的影響，對注射部位也未發(fā)現(xiàn)有不良反應(yīng)產(chǎn)生，可作為安全有效的新型疫苗候選佐劑，并為相關(guān)的藥物開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。關(guān)于天麻提取物的免疫增強(qiáng)機(jī)制及對不同疫苗的佐劑效果仍需進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Li XL，Liu K，Yao HW，et al. Highly pathogenic avian influenza H5N1 in mainland China[J]. Int J Environ Res Public Health，2015，12（5）：5026-5045.

[2] Godinho CA，Yardley L，Marcu A，et al. Increasing the intent to receive a pandemic influenza vaccination：testing the impact of theory-based messages[J]. Prev Med，2016， 89：104-111.

[3] Rudenko L，Isakova-Sivak I. Pandemic preparedness with live attenuated influenza vaccines based on A/Leningrad/134/17/57 master donor virus[J]. Expert Rev Vaccines，2015， 14（3）：395-412.

[4] Liang F，Lore K. Local innate immune responses in the vaccine adjuvant-injected muscle[J]. Clin Transl Immunol，2016，5（4）：e74.

[5] Gellin BG，Ampofo WK. Seasonal and pandemic influenza vaccine：demand，supply and vaccine availability[J]. Vaccine，2014，32（52）：7037-7039.

[6] 國家藥典委員會.中國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：58-59.

[7] 魯艷嬌，王強(qiáng)，張偉，等.天麻苷增強(qiáng)小鼠免疫功能的實(shí)驗(yàn)研究[J].內(nèi)科急危重癥雜志，2015，21（2）：141-143.

[8] 李慧，趙蘭華，朱云，等.紅豆杉醇提物作為流感疫苗佐劑的免疫效果及安全性[J].中國生物制品學(xué)雜志，2012， 25（8）：956-958.

[9] 郭元吉，程曉雯.流行性感冒病毒及其實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：中國三峽出版社，1997：100-104.

[10] Palache A，Oriol-Mathieu V，Abelin A，et al. Seasonal influenza vaccine dose distribution in 157 countries（2004-2011）[J]. Vaccine，2014，32（48）：6369-6376.

[11] Tong S，Zhu X，Li Y，et al. New world bats harbor diverse influenza A viruses[J]. PLoS Pathog，2013，9（10）：e1003657.

[12] Hurt AC. The epidemiology and spread of drug resistant human influenza viruses[J]. Curr Opin Virol，2014，8：22-29.

[13] Jennings LC. Influenza vaccines：an Asia-Pacific perspective[J]. Influenza Other Respir Viruses，2013，7 Suppl 3：44-51.

[14] Huang MH，Dai SH，Chong P. Mucosal delivery of a combination adjuvant comprising emulsified fine particles and LD-indolicidin enhances serological immunity to inactivated influenza virus[J]. Microbes Infect，2016， 18（11）：706-709.

[15] 胡莉萍.我國中草藥等免疫佐劑的研究現(xiàn)狀[J].山東畜牧獸醫(yī)，2015，36（2）：62-64.

[16] Pi CC，Chu CL，Lu CY，et al. Polysaccharides from Ganoderma formosanum function as a Th1 adjuvant and stimulate cytotoxic T cell response in vivo[J]. Vaccine，2014，32（3）：401-408.

[17] Yang J，Yang F，Yang H，et al. Water-soluble polysaccharide isolated with alkali from the stem of Physalis alkekengi L.：structural characterization and immunologic enhancement in DNA vaccine[J]. Carbohydr Polym，2015， 121：248-253.

[18] Honda-Okubo Y，Ong CH，Petrovsky N. Advax delta inulin adjuvant overcomes immune immaturity in neonatal mice thereby allowing single-dose influenza vaccine protection[J]. Vaccine，2015，33（38）：4892-4900.

[19] Ng HI，F(xiàn)ernando GJ，Depelsenaire AC，et al. Potent response of QS-21 as a vaccine adjuvant in the skin when delivered with the Nanopatch，resulted in adjuvant dose sparing[J]. Sci Rep，2016，6：29368.

[20] Fernandez-Tejada A，Chea EK，George C，et al. Development of a minimal saponin vaccine adjuvant based on QS-21[J]. Nat Chem，2014，6（7）：635-643.

（收稿日期：2016-07-28 本文編輯：李亞聰）