抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)方對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的影響

劉春玲+唐明科+秦麗娟

【摘要】 目的：探討抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性降低的作用及其與PI3K/PKB信號(hào)傳導(dǎo)通路之間的關(guān)系。方法：MTT法檢測(cè)抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)處理培養(yǎng)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率，免疫印跡法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞內(nèi)PI3K和PKB表達(dá)水平，最后，利用結(jié)晶紫染色法檢測(cè)Transwell下室面的膠質(zhì)瘤細(xì)胞數(shù)。結(jié)果：抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)可以抑制PI3K和PKB蛋白表達(dá)水平，抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用0.5 h時(shí)PI3K蛋白表達(dá)水平最低為（25.1±3.1），作用1 h時(shí)PKB蛋白表達(dá)水平最低為（25.1±3.8），與對(duì)照組的（99.1±1.6）、（91.2±3.5）比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用3 h時(shí)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制程度最大，抑制率為（91.2±5.7）%，與對(duì)照組的（68.0±5.2）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。且此時(shí)Transwell下室面的細(xì)胞數(shù)最少，為（1.4±0.4）×106個(gè)，與對(duì)照組的（35.6±2.7）×106個(gè)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)可能是通過抑制PI3K/PKB而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，從而引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的降低。

【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)瘤； 抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)； PI3K/PKB信號(hào)傳導(dǎo)通路

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions on reducing the invasiveness of glioma cells，and the relationship between Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions and PI3K/PKB signal transduction pathway.Method：MTT method was used to detect cell inhibition rate of C6 glioma cells which was treated by the Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions，the expression level of PI3K and PKB in tumor cells was detected by Western blot，in the end，the number of glioma cells in Transwell was detected by crystal violet staining method.Result：Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions can inhibit PI3K and PKB protein expression level，the expression level of PI3K protein was the lowest （25.1±3.1） when the effect of Resistance to Glioma Ⅰ was 0.5 h，and the lowest level of PKB protein expression was （25.1±3.8） at the effect of Resistance to glioma Ⅰ was 1 h，compared with the control group （99.1±1.6），（91.2±3.5），the differences were statistically significant（P<0.05）.While the largest inhibition rate appear at 3 h after Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions，inhibition rate was （91.2±5.7）%， compared with （68.0±5.2）% in control group，the difference was statistically significant（P<0.01）.At the same time，the glioma cell number on transwell chamber surface was the least（1.4±0.4）×106，compared with（35.6±2.7）×106 in control group，the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion：Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions may is through the inhibition of PI3K/PKB signal transduction pathway and inhibit the proliferation of glioma cells，thereby reducing the invasiveness of glioma cells.

【Key words】 Glioma； Resistance to Glioma Ⅰ Prescriptions； PI3K/PKB signal transduction pathway

First-arthors address：The Second Hospital of Chifeng，Chifeng 024000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.36.004

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中，膠質(zhì)瘤是最為常見的[1-3]。而對(duì)于膠質(zhì)瘤的治療，除了大家廣為熟悉的手術(shù)治療以外，還往往在術(shù)后進(jìn)行相應(yīng)的放、化療等輔助治療[4-5]。這是由于膠質(zhì)瘤侵襲性高，而手術(shù)只能切除成型的病灶，已經(jīng)侵襲到遠(yuǎn)處的膠質(zhì)瘤細(xì)胞不易發(fā)現(xiàn)也做不到全部清除，因此術(shù)后膠質(zhì)瘤患者往往復(fù)發(fā)率極高?？鼓z質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)方中的部分成分已經(jīng)應(yīng)用于臨床其他腫瘤的治療并取得了一定的效果，文獻(xiàn)[6]研究發(fā)現(xiàn)，抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)具有抗膠質(zhì)瘤作用，但其確切的分子生物學(xué)作用機(jī)制尚不十分清楚。endprint

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 （1）C6大鼠腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心提供。（2）主要試劑羊抗大鼠PI3K和PKB購自英國Abcam公司，小鼠抗大鼠β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司?？鼓z質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)組成成分包括鴉膽子口服液、白花蛇草、蜈蚣、水蛭、枸杞子、土茯苓、豬苓、葛根。

1.2 方法

1.2.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞培養(yǎng) 膠質(zhì)瘤細(xì)胞采用F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)加入2.5%胎牛血清和15%馬血清，37 ℃孵箱內(nèi)孵育，并通以5%的CO2。細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)生長期后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組為抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用0.1、0.5、1、2、3、4 h 六個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)照組在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)加入等量生理鹽水，每組選10個(gè)標(biāo)本。

1.2.2 免疫印跡法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的PI3K和PKB蛋白表達(dá)水平 培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞給予抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)后，收集不同時(shí)間點(diǎn)（0.1、0.5、1、2、3、4 h）的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，細(xì)胞進(jìn)行裂解、超聲破碎后，低溫離心并收集上清液，采用7.5%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳，每個(gè)泳道樣本的加樣量為30 μg。半干轉(zhuǎn)印結(jié)束后用脫脂奶粉封閉1 h后并4 ℃過夜。次日取出NC膜分別加入PI3K和PKB的一抗震蕩孵育2 h。TTBS洗后行二抗震蕩孵育1 h。TTBS洗后的NC膜采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，結(jié)果用IDV值進(jìn)行分析。

1.2.3 抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響 培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤接種于96孔板，密度調(diào)整為1×104個(gè)細(xì)胞/孔，細(xì)胞增殖至對(duì)數(shù)生長期24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)，對(duì)照組加入不含血清的培養(yǎng)基。MTT染色法檢測(cè)抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用后不同時(shí)間點(diǎn)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)膠質(zhì)瘤侵襲性 Transwell膜上室接種膠質(zhì)瘤細(xì)胞，密度為5×104個(gè)/膜，培養(yǎng)24 h后，分別于抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用后不同時(shí)間點(diǎn)用測(cè)定Tanswell膜下室面的貼壁細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)PI3K的表達(dá)水平 抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)處理后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，PI3K的表達(dá)水平降低，于抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)處理后的0.5 h時(shí)達(dá)最低為（25.1±3.1），與對(duì)照組的（99.1±4.2）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其后隨時(shí)間PI3K的表達(dá)水平逐漸增高，見圖1。

2.2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)PKB的表達(dá)水平 抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)處理后，膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)PKB的表達(dá)水平降低，并于抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)處理后的1 h時(shí)達(dá)最低（25.1±3.8），與對(duì)照組的（99.4±3.1）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其后PKB的表達(dá)水平逐漸增高，見圖2。

2.3 抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)處理作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，選取抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用0.1、0.5、1、2、3、4 h六個(gè)時(shí)間點(diǎn)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選取10例標(biāo)本，分別觀察抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用于膠質(zhì)瘤后的不同時(shí)間點(diǎn)引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制率的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，隨時(shí)間延長，抑制率開始增大，于3 h時(shí)抑制程度最大，其后又隨時(shí)間的延長而降低。其中，抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞后的2、3 h時(shí)，其抑制率分別為（68.0±5.2）%和（91.2±5.7）%，與對(duì)照組的（9.5±1.5）%、（9.4±2.1）%比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性的影響 抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)可使得侵入transwell下室的細(xì)胞數(shù)量減少，于處理后的3 h時(shí)明顯降低，提示抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)可降低膠質(zhì)瘤侵襲性，并且于抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用3 h時(shí)降至最低，侵襲細(xì)胞數(shù)為（1.4±0.4）×106個(gè)，與對(duì)照組的（35.6±2.7）×106個(gè)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3。

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來，神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病率有逐年升高的趨勢(shì)，且其發(fā)病群體也日趨年輕化[7-8]。膠質(zhì)瘤的臨床主要表現(xiàn)為一系列的腦組織壓迫癥狀。在臨床上，膠質(zhì)瘤的治療依然以手術(shù)為首選。但因膠質(zhì)瘤高侵襲性的特點(diǎn)，使得手術(shù)無法做到病理學(xué)上的徹底清除。因此，即使患者術(shù)后短期效果明顯，但很快又會(huì)復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響了膠質(zhì)瘤患者的生活質(zhì)量和生命周期[9]。為了最大程度減少或消除膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的概率，膠質(zhì)瘤患者術(shù)后通常均輔助放射治療或化學(xué)治療，但這兩種治療方法同時(shí)又會(huì)產(chǎn)生大的副作用，因此，效果往往差強(qiáng)人意。隨著中醫(yī)中藥的研究進(jìn)展，臨床上中醫(yī)中藥治療腦瘤的成功報(bào)道亦日趨增多[10-12]。在很多臨床與實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥確實(shí)可以控制患者的疾病發(fā)展與轉(zhuǎn)歸，可以減少由放、化療造成的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量和生存周期。

腦膠質(zhì)瘤的中醫(yī)病機(jī)主要可分為以下幾個(gè)方面，（1）痰濕內(nèi)阻型：痰濕之邪長久不化，彈性重濁黏膩，凝聚于腦，脈絡(luò)受阻，形成腫塊，阻塞清竅。在其病變過程中，腦絡(luò)痹阻日久，化熱動(dòng)風(fēng)，風(fēng)火相煽，耗傷陰液，致頭痛嘔吐，昏花復(fù)視，肢體偏癱，甚則昏迷不醒，抽搐癲癇。（2）氣滯血瘀型：顱內(nèi)脈絡(luò)受阻，邪毒積聚，損傷正氣，不化之食、不去之濕日久演變成痰濁積聚，久而瘀血內(nèi)生，氣血耗損，經(jīng)脈阻滯，形成腫瘤。（3）肝腎陰虛型：腎主骨，骨生髓，腦為髓海，處頭部巔頂清虛之地，腎虛可致髓?？仗?，邪易乘虛而入。在疾病治療過程中，中醫(yī)學(xué)強(qiáng)調(diào)整體觀念，其重在調(diào)整機(jī)體陰陽、氣血、臟腑功能平衡，并因人而異采取標(biāo)本兼治、扶正祛邪的治療原則，借此達(dá)到提高患者生命周期和生活質(zhì)量的目的。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)方劑中的很多成分對(duì)抗腫瘤有很好的臨床療效[13-15]，但抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)方劑發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不十分明了。endprint

近年來，關(guān)于中草藥及其活性成分抗膠質(zhì)瘤作用的研究已經(jīng)證實(shí)，人參皂甙、紫杉醇、氧化砷、苦參堿、欖香烯、丹參酮等多種中藥以及合劑對(duì)抗膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制主要包括：影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞周期；抑制癌發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)；調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能；抑制腫瘤血管生長；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化；調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)；抑制端粒酶活性和細(xì)胞毒作用等[16-18]。中藥誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡是通過多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的。

筆者通過研究抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性、細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)方劑可以降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性，并于抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用3 h時(shí)最為明顯。而抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用亦于作用3 h時(shí)達(dá)最高水平。說明抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，降低膠質(zhì)瘤侵襲性。

有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/PKB信號(hào)通路在機(jī)體生命活動(dòng)過程中的很多方面發(fā)揮著重要作用，且常常可被多種腫瘤所激活[19-20]，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥性等密切相關(guān)[21]。PKB是PI3K的一個(gè)重要下游信號(hào)分子，可促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。

本研究發(fā)現(xiàn)，抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)可以降低PI3K信號(hào)蛋白的表達(dá)，并于抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用后的0.5 h時(shí)達(dá)最低水平，而信號(hào)蛋白PKB則在抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用后1 h時(shí)達(dá)最低表達(dá)，據(jù)此推測(cè)，抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，可能是通過降低PI3K的表達(dá)而激活了其下游的信號(hào)分子PKB，通過此信號(hào)通路的激活最終引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖受抑降低了膠質(zhì)瘤的侵襲性。

有關(guān)抗膠質(zhì)瘤Ⅰ號(hào)降低膠質(zhì)瘤侵襲性的作用，可能還有其他的信號(hào)通路或信號(hào)蛋白分子參與其中，亦可能是調(diào)動(dòng)了機(jī)體某些內(nèi)在機(jī)制而實(shí)現(xiàn)的，這些尚待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2016-10-16） （本文編輯：張爽）endprint