抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體對(duì)試驗(yàn)性肥胖大鼠5種激素水平的影響

劉超英，胡忠梅，李衛(wèi)真，張永云，趙素梅，代飛燕，彭 潔，俞大闊，和紹禹，周 明

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省昭通農(nóng)業(yè)學(xué)校，云南昭通 657000；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，云南昆明 650201；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201；5.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，云南昆明 650201；6.昆明學(xué)院，云南昆明 650214)

抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體對(duì)試驗(yàn)性肥胖大鼠5種激素水平的影響

劉超英1△，胡忠梅2△，李衛(wèi)真1，張永云3，趙素梅4，代飛燕1，彭 潔1，俞大闊1，和紹禹5，周 明6*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南省昭通農(nóng)業(yè)學(xué)校，云南昭通 657000；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科專業(yè)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，云南昆明 650201；4.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201；5.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，云南昆明 650201；6.昆明學(xué)院，云南昆明 650214)

為了驗(yàn)證抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體減少動(dòng)物脂肪沉積的作用效果，并對(duì)該抗體用于人類肥胖的治療提供理論依據(jù)和試驗(yàn)資料，本試驗(yàn)分別對(duì)4組試驗(yàn)性肥胖大鼠注射0、0.1、0.5、1.0 mg/mL劑量的抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體，并檢測(cè)4周內(nèi)大鼠血清中5種激素含量及變化。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組血清中胰島素(INS)含量低于對(duì)照組，Ⅰ組與Ⅳ組4周內(nèi)均差異顯著(P<0.05)；試驗(yàn)組與對(duì)照組、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-1)含量無(wú)顯著差異(P>0.05)；注射抗體后，試驗(yàn)組生長(zhǎng)激素(GH)含量顯著增高，且Ⅰ、Ⅲ組4周內(nèi)均差異顯著(P<0.05)；第1周內(nèi)，試驗(yàn)組三碘甲狀腺原氨酸(T3)含量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，后3周內(nèi)Ⅰ組和Ⅳ組差異顯著(P<0.05)；第1、3、4周內(nèi)，Ⅰ組和Ⅳ組四碘甲狀腺原氨酸(T4)含量差異顯著(P<0.05)，第2周內(nèi)無(wú)顯著差異，Ⅱ組和Ⅲ組差異均不顯著(P>0.05)。此外，不同組間的差異顯著性隨注射劑量不同而不同。

抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體；試驗(yàn)性肥胖大鼠；激素

動(dòng)物體脂的沉積程度是衡量胴體組成的一個(gè)重要指標(biāo)。由于養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)模化和快速化，動(dòng)物體脂過(guò)度沉積現(xiàn)象日益凸顯，降低脂肪沉積量已成為亟待解決的問(wèn)題之一[1]。有研究表明，脂肪細(xì)胞膜上存在許多類型的特異蛋白質(zhì)，由于抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體與被免疫動(dòng)物脂肪細(xì)胞膜蛋白的高度特異性結(jié)合[2-3]，影響或阻礙激素與脂肪細(xì)胞膜上受體的結(jié)合。激素與受體結(jié)合的改變會(huì)產(chǎn)生一系列的生化變化，進(jìn)而影響脂肪代謝。段綱等[4]通過(guò)對(duì)豬注射抗脂肪細(xì)胞特異膜蛋白單克隆抗體，研究了主要與代謝相關(guān)的胰島素(insulin，INS)[5-6]、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)[7]、生長(zhǎng)激素(growth hormone，GH)[8]、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)和四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine，T4)的含量變化，為該抗體在動(dòng)物生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。本試驗(yàn)對(duì)注射抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體后的試驗(yàn)性大鼠血清中INS、IGF-1、GH、T3和T4等5種激素含量進(jìn)行測(cè)定，不僅能夠促進(jìn)該抗體的生產(chǎn)應(yīng)用，也可為進(jìn)一步研究動(dòng)物脂肪沉積問(wèn)題奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7周齡、體重大約200 g的健康SD大鼠60只，購(gòu)自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要儀器設(shè)備和試劑 SN-682型放射免疫γ計(jì)數(shù)儀，上海福光儀器有限公司產(chǎn)品；ELISA試劑盒，天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司產(chǎn)品；膜萃取液、磷酸緩沖液、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑等試劑。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)性肥胖大鼠病理模型建立 肥胖動(dòng)物的建模方法目前主要有高脂肪飼料誘導(dǎo)、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核損傷、雙側(cè)卵巢切除法及大量維生素D誘導(dǎo)等多種肥胖動(dòng)物病理模型的建模方法[8-9]，本研究選用高脂肪飼料誘導(dǎo)法。選擇SD大鼠60只，雌雄比為1∶2。連續(xù)6周飼喂大鼠高能量飼料，飼料成分見(jiàn)表1。使大鼠增肥至體重約280 g后停止飼喂，成功建立試驗(yàn)性肥胖大鼠模型。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將60只試驗(yàn)性肥胖大鼠隨機(jī)分成Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組等4組，Ⅰ組為對(duì)照組，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組為注射抗體試驗(yàn)組。

表1 飼料營(yíng)養(yǎng)成分

1.2.3 抗體注射 抗脂肪細(xì)胞特異膜蛋白抗體由云南省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備[10-11]。Ⅰ組注射1 mL生理鹽水，Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組分別腹腔注射1 mL含有0.1、0.5、1.0 mg/mL抗脂肪膜蛋白抗體劑量的生理鹽水。

1.2.4 血樣采集 前期研究表明，該抗體經(jīng)腹腔注射后4周內(nèi)會(huì)完全降解。因此，注射抗體后，分別在第0、1、2、3、4周對(duì)大鼠進(jìn)行眼眶采血，每只采血1 mL，2 500 r/min離心5 min分離血清，置-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 激素含量的測(cè)定 試驗(yàn)采用競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫測(cè)定法測(cè)定INS含量，平衡飽和競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫分析法測(cè)定胰島素樣IGF-1含量，雙抗體放射免疫法測(cè)定GH含量，液相平衡競(jìng)爭(zhēng)性放射免疫分析法測(cè)定T3、T4含量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，并進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 血清胰島素含量

由圖1可以知，注射抗體后1周內(nèi)血清INS含量Ⅱ組、Ⅲ組有所上升，但低于對(duì)照組，Ⅳ組下降，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)；第1周至第3周血清INS含量先下降后上升，試驗(yàn)組血清中INS含量低于對(duì)照組，第3周時(shí)差異顯著(P<0.05)，各試驗(yàn)組間無(wú)顯著差異(P>0.05)；第4周時(shí)，Ⅳ組低于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組且差異顯著(P<0.05)。結(jié)果表明，抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體可明顯降低大鼠血清INS含量，注射不同劑量，降低大鼠血清INS含量的程度不同，其中，高劑量組效果最為明顯。

圖1 血清INS含量變化

2.2 血清胰島素樣生長(zhǎng)因子1含量

由圖2可知，試驗(yàn)組注射0.1、0.5、1.0 mg抗體后1周內(nèi)試驗(yàn)組大鼠血清IGF-1含量有所上升，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)；1周后血清IGF-1含量均下降，第2周時(shí)下降到最低；第2周后試驗(yàn)組逐漸上升，對(duì)照組逐漸下降；第4周時(shí)試驗(yàn)組均高于對(duì)照組。4組IGF-1含量始終差異不顯著(P>0.05)。因此，抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體可在一定程度內(nèi)提高大鼠血清IGF-1含量。

圖2 血清IGF-1含量變化

2.3 血清生長(zhǎng)激素含量

由圖3可知，注射抗體后，試驗(yàn)組血清GH含量始終高于對(duì)照組。先逐漸升高達(dá)到最高水平，之后開(kāi)始下降，后又上升趨于平穩(wěn)。第1周Ⅰ組與Ⅱ組、Ⅲ組差異顯著(P<0.05)，Ⅱ組與Ⅳ組間差異顯著(P<0.05)；第2周Ⅱ組分別與Ⅰ組、Ⅲ組間差異不顯著(P>0.05)，其余組間均差異顯著；第3周時(shí)對(duì)照組低于試驗(yàn)組含量，Ⅰ組、Ⅱ組間差異不顯著(P>0.05)；第4周時(shí)Ⅳ組血清GH含量高于其余3組，Ⅱ組分別與Ⅲ組、Ⅳ組間差異不顯著(P>0.05)，其余組間均差異顯著(P<0.05)。結(jié)果顯示，抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體可明顯提高大鼠血清GH含量，根據(jù)注射的劑量不同，提高大鼠血清GH含量的程度不同，且組間有明顯差異，高劑量組提高的幅度最大，效果最明顯。

2.4 血清三碘甲狀腺原氨酸含量

由圖4可以知，注射抗體對(duì)照組血清T3含量逐漸降低，試驗(yàn)組趨于平穩(wěn)。第1周時(shí)試驗(yàn)組血清T3含量略低于對(duì)照組，但無(wú)顯著差異(P>0.05)，第2周到第4周，試驗(yàn)組高于對(duì)照組；第2周時(shí)Ⅳ組血清T3含量高于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，且均差異顯著(P<0.05)；第3周時(shí)Ⅰ組、Ⅲ組間，Ⅱ組、Ⅳ組間均差異不顯著(P>0.05)，其余組間差異顯著(P<0.05)；第4周時(shí)對(duì)照組顯著低于各試驗(yàn)組(P<0.05)。由結(jié)果可知，抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體可明顯提高大鼠血清T3的含量，0.1 mg劑量的抗體激素水平升高最為明顯。

圖3 血清GH含量變化

圖4 血清T3含量變化

2.5 血清四碘甲狀腺原氨酸含量

由圖5可知，注射抗體后對(duì)照組血清T4含量幾乎無(wú)變化，試驗(yàn)組含量高于對(duì)照組且呈現(xiàn)升高降低再升高的趨勢(shì)。第1周時(shí)Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組血清T4含量顯著高于Ⅰ組(P<0.05)；第2周時(shí)Ⅲ組略高于Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組，各組間差異不顯著(P>0.05)；第3周時(shí)Ⅰ組和Ⅳ組血清T4含量差異顯著(P<0.05)，其余組間均不顯著(P>0.05)；第4周時(shí)Ⅳ組血清T4含量顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組(P<0.05)。由結(jié)果可知，抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體可明顯提高大鼠血清T4含量，并隨著注射劑量的增加而增加，高劑量組效果最為明顯。

3 討論

抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體可與動(dòng)物脂肪細(xì)胞膜蛋白高度特異性結(jié)合，從而影響脂肪代謝以及激素與脂肪細(xì)胞膜上受體的結(jié)合，如胰島素受體、α腎上腺素受體等。激素與受體結(jié)合后，首先會(huì)使脂肪細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶(cAMP酶)發(fā)生變化，然后導(dǎo)致環(huán)腺苷酸(cAMP)濃度改變，進(jìn)而使依賴cAMP的蛋白激酶活性發(fā)生改變，從而影響脂肪代謝。Flint D J等[12]首次提出用脂肪細(xì)胞膜蛋白制備抗體的設(shè)想并進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體的動(dòng)物脂肪沉積顯著減少，體重增加，飼料轉(zhuǎn)化效率提高且無(wú)任何副作用[13]。隨著對(duì)抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體的深入研究，其應(yīng)用領(lǐng)域有可能逐漸從動(dòng)物擴(kuò)展到人，為人類肥胖癥的治療提供新的思路。

圖5 血清T4含量變化

INS是一種抗脂解激素，它一方面可以通過(guò)抑制脂肪酶的活化和促進(jìn)脂肪酸再酯化而抑制脂肪組織釋放脂肪酸；另一方面還可以通過(guò)加強(qiáng)葡萄糖-6-磷酸經(jīng)糖代謝途徑產(chǎn)生乙酰CoA和NADPH，從而增加脂肪酸的合成，還能促進(jìn)α-磷酸甘油的生成和抑制脂酰CoA進(jìn)入線粒體氧化，因而有利于脂肪的合成。另外，胰島素可增加脂蛋白脂肪酶的合成從而增加脂肪的貯存[14]。所以胰島素作用的削弱會(huì)使動(dòng)物脂肪合成受阻，從而使脂肪沉積減少。GH是調(diào)節(jié)動(dòng)物生長(zhǎng)的一種蛋白質(zhì)類激素，可促進(jìn)脂肪分解和蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)養(yǎng)分在各組織間的重新分配。GH可調(diào)控IGF-1的分泌及合成，IGF-1介導(dǎo)GH作用的發(fā)生，因此IGF-1的分泌水平能很好地反映GH水平。GH與IGF-1均呈脈沖式分泌，兩者的分泌趨勢(shì)相似，IGF-1可反映動(dòng)物的生長(zhǎng)及脂肪和蛋白質(zhì)的代謝情況[15]。T3和T4可調(diào)節(jié)脂類、蛋白質(zhì)代謝，加速脂解。T3還可抑制cAMP磷酸二酯酶，從而促進(jìn)脂肪組織中腺苷酸環(huán)化酶的合成。T3能夠促進(jìn)脂肪組織中的脂肪分解，使血漿游離脂肪酸和甘油三酯的濃度增加，促進(jìn)肝臟對(duì)膽固醇的降解。趙偉等[16-17]報(bào)道，抗脂肪細(xì)胞膜蛋白多克隆抗體免疫后2-8周血清胰島素含量試驗(yàn)組低于對(duì)照組(P>0.05)，第4周后血清T3含量高于對(duì)照組(P>0.05)。本試驗(yàn)也取得了與此一致的結(jié)果。

注射抗脂肪細(xì)胞膜蛋白抗體后試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，血清INS含量明顯降低，血清IGF-1、T3、T4含量有所提高。本試驗(yàn)結(jié)果與段綱等[4]和李衛(wèi)真等[18]研究結(jié)果一致。血清INS含量的降低表明大鼠脂肪合成受阻，同時(shí)血清GH、IGF-1、T3、T4水平提高可促進(jìn)脂肪分解、蛋白質(zhì)合成，減少體脂沉積，增加蛋白質(zhì)沉積，調(diào)節(jié)養(yǎng)分在各組織間重新分配?？怪炯?xì)胞膜蛋白抗體對(duì)內(nèi)分泌代謝的影響與注射劑量有關(guān)，注射劑量不同對(duì)內(nèi)分泌代謝影響的程度不同，高劑量組的影響比較明顯。

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Effects of Antibody against Adipocyte Membrane Protein on Five Kind of Hormone Levels in Experimental Obese Rats

LIU Chao-ying1,HU Zhong-mei2,LI Wei-zhen1,ZHANG Yong-yun3,ZHAO Su-mei4, DAI Fei-yan1,PENG Jie1,YU Da-kuo1,HE Shao-yu5,ZHOU Ming6

(1.FacultyofAnimalScienceandTechnology,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan， 650201,China; 2.AgriculturalschoolofZhaotong,Zhaotong,Yunnan， 657000,China;3.TeachingDemonstrationCenteroftheBasicExperimentsofAgriculturalMajors,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming,Yunnan， 650201,China;4.YunnanKeyLaboratoryofAnimalNutritionandFeed，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming，Yunnan， 650201,China;5.EasternBeeResearchInstitute,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming，Yunnan， 650201,China;6.KunmingUniversity,Kunming，Yunnan， 650214,China)

To verify the effects of antibody against adipocyte membrane protein on animal fat deposition and provide the theoretical basis and experimental data for using the antibody to reduce human obesity,sixty experimental obese rats were injected with antibodies at 0,0.1,0.5,1.0 mg/mL respectively and the serum hormone contents were determinated every week.The results showed that the INS content in treatment groups was lower than that in the control group,but there was significant difference between Ⅰ group and Ⅳ groups(P<0.05).The content of IGF-1 showed no significant difference between treatment groups and control group (P>0.05).The GH contents in treatment groups increased significantly compared with the control group,and there was significant difference between Ⅰ group and Ⅲ group at 4 week (P<0.05).In the first week,the contents of T3in treatment groups had no significant difference with control group(P>0.05).But it showed significant difference between Ⅰand Ⅳ groups during the next 3 weeks(P<0.05).The T4contents in Ⅰand Ⅳ groups had significant difference at 1st,3rd and 4th week(P<0.05),and the Ⅱ group and Ⅲ group had similar tendency at 4 weeks(P>0.05).In conclusion,the hormones among different groups varied with the dose of antibody injected.

antibody against adipocyte membrane protein;experimental obese rat;hormone

2015-12-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (30260079)

劉超英(1992-)，女，河南安陽(yáng)人，博士研究生，主要從事特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物飼養(yǎng)研究?！魍蓉暙I(xiàn)作者 *通訊作者

S856.5

A

1007-5038(2017)01-0061-04