遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌整合子攜帶情況調(diào)查與分析

趙鳳菊，李清竹，關(guān) 淼，李井春，王 竹，曹 東，趙曉彤，顧貴波，魏 澍

(遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110164)

遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌整合子攜帶情況調(diào)查與分析

趙鳳菊，李清竹，關(guān) 淼，李井春，王 竹，曹 東，趙曉彤，顧貴波，魏 澍

(遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽(yáng) 110164)

查明遼寧地區(qū)整合子在豬源大腸埃希菌中的分布及整合子攜帶耐藥基因盒的種類，可為該病的綜合防控提供科學(xué)依據(jù)。本研究利用整合酶基因PCR擴(kuò)增法檢測(cè)整合子，并對(duì)整合子可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。結(jié)果表明，71.43%(40/56)的菌株為Ⅰ類整合子陽(yáng)性，1.79%(1/56)的菌株同時(shí)為Ⅰ類和Ⅱ類整合子陽(yáng)性，未檢測(cè)到Ⅲ類整合子；87.8%(36/41)的菌株表現(xiàn)為Ⅰ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性，擴(kuò)增產(chǎn)物大小在116 bp～2 307 bp之間，100%(1/1)菌株表現(xiàn)為Ⅱ類整合子可變區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性，大小為2 106 bp；整合子可變區(qū)含有編碼對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥的基因(aadA1、aadA2、aadA5、aadA22、aadB、aacA4和sat2)，編碼對(duì)磺胺類抗生素耐藥的基因(dfrA1、dfrA12、dfrA17)，編碼對(duì)氯霉素抗生素耐藥的基因(cmlA1、cmlA6)。因此，整合子在大腸埃希菌中廣泛存在，遼寧地區(qū)大腸埃希菌中整合子主要攜帶編碼對(duì)氨基糖苷類、磺胺類和氯霉素耐藥基因盒。

豬；大腸埃希菌；整合子；耐藥性

大腸埃希菌(E.coli)是人類與動(dòng)物腸道內(nèi)共生菌，也是細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)的重要指示菌[1]。整合子由Stokes等于1989年首次提出，在革蘭陰性病原菌中比較常見，根據(jù)整合酶基因(intI)的同源性已經(jīng)確定了四類整合子(1～4)[2]。最常見的移動(dòng)性整合子是Ⅰ類整合子，其次為Ⅱ類整合子，已經(jīng)被證明了有助于抗生素耐藥基因的傳播[3]。整合子位于細(xì)菌染色體或質(zhì)粒上，它能夠捕獲外源基因，通過位點(diǎn)特異性重組功能促進(jìn)細(xì)菌獲得抗性基因的新組合，并能促進(jìn)抗性基因在細(xì)菌之間傳播，導(dǎo)致多耐藥菌株的出現(xiàn)[3-5]。通過國(guó)內(nèi)外學(xué)者的大量研究證明，細(xì)菌間特別是在腸桿菌如大腸埃希菌中整合子的存在與多藥耐藥密切相關(guān)。由于動(dòng)物源耐藥菌和耐藥基因可以通過食物鏈傳播給人類[6]，因此，多藥耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)不僅給動(dòng)物疫病治療帶來巨大挑戰(zhàn)，也嚴(yán)重威脅到人類健康。

通過對(duì)遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌的耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，菌株耐藥率高達(dá)98.64%(64/65)，多重耐藥率高達(dá)92.31%?？股氐牟贿m當(dāng)使用以及作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑的使用，是抗生素耐藥性發(fā)展的重要原因。整合子在細(xì)菌獲得耐藥機(jī)制中起了重要作用，整合子基因盒系統(tǒng)在細(xì)菌中能捕獲外來耐藥基因，不僅可在不同細(xì)菌間傳播耐藥性，也可同時(shí)1個(gè)整合子捕獲多個(gè)基因盒產(chǎn)生多重耐藥性[7-8]。因此，為了解遼寧地區(qū)整合子在豬源大腸埃希菌中的分布及整合子攜帶耐藥基因盒的種類，本研究利用整合酶基因PCR擴(kuò)增法對(duì)56株耐藥大腸埃希菌進(jìn)行整合子檢測(cè)，并對(duì)整合子可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增及序列測(cè)定分析，為進(jìn)一步研究豬源大腸埃希菌的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為豬源大腸埃希菌耐藥性監(jiān)測(cè)提供科學(xué)參考，為遼寧地區(qū)豬大腸埃希菌病的綜合防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 56株耐藥大腸埃希菌由遼寧不同地區(qū)病死豬或患病豬的組織臟器、活豬糞便中分離得到。由遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)分別為20130608、20130708；DNAzol提取試劑、Invitrogen、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase with GD buffer、ExTaqDNA聚合酶、10×Ex-Taqbuffer、2.5mmol/L dNTPs、DNA Marker 2 000、溴化乙錠，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；其他為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.1.3 PCR擴(kuò)增引物 Ⅰ類整合酶基因根據(jù)GenBank上登錄的intI1基因序列，利用Primer Premier5.0軟件自行設(shè)計(jì)，Ⅱ類和Ⅲ類整合酶基因及Ⅰ類和Ⅱ類整合子引物參照參考文獻(xiàn)[2-4]合成。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成(表1)。

表1 本研究所用引物

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌DNA模板的制備 挑取18 h～24 h培養(yǎng)的培養(yǎng)物，用1 mL無菌生理鹽水制備成一定濃度的菌懸液。吸取200 μL菌懸液至1.5 mL Eppendorf管中，加入800 μL DNAzol提取試劑，混勻后4℃、12 000 r/min離心10 min。吸取900 μL上清，置于另一1.5 mL Eppendorf管中，加入500 μL無水乙醇，混勻后4℃、12 000 r/min離心5 min。棄上清，無菌水配制的750 mL/L乙醇洗滌2次，干燥后用40 μL無菌水溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 整合酶基因及整合子檢測(cè)體系 采用25 μL反應(yīng)體系，10×PCR buffer 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，ExTaq酶0.125 μL，滅菌水16.375 μL，模板 2 μL。

1.2.3 基因測(cè)序檢測(cè)體系 采用50 μL反應(yīng)體系，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，2×Prime STAR GD buffer(Mg2+plus)25 μL， dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)8 μL，上、下游引物各1 μL(引物濃度為20 μmol/L)，模板5 μL，滅菌水補(bǔ)至50 μL。

1.2.4 PCR反應(yīng)條件 94℃ 5 min；94℃ 45 s，根據(jù)不同引物選擇相應(yīng)的退火溫度 45 s，72℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產(chǎn)物。

1.2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定 選取整合子PCR陽(yáng)性樣品，將其PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并與NCBI基因庫(kù)進(jìn)行序列同源性比較。

2 結(jié)果

2.1 整合酶基因及整合子檢測(cè)結(jié)果

通過對(duì)56株耐藥大腸埃希菌進(jìn)行整合酶基因及整合子檢測(cè)，71.43%(40/56)的大腸埃希菌為Ⅰ類整合子陽(yáng)性，1.79%(1/56)的大腸埃希菌同時(shí)為Ⅰ類、Ⅱ類整合子陽(yáng)性，未檢測(cè)到Ⅲ類整合子。在41株Ⅰ類整合子陽(yáng)性的大腸埃希菌中，有36株(87.8%)表現(xiàn)為整合子可變區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性；1株Ⅱ類整合子陽(yáng)性的大腸埃希菌表現(xiàn)為整合子可變區(qū)擴(kuò)增陽(yáng)性。在這些Ⅰ類整合子陽(yáng)性菌株中， 150 bp為22株， 1000 bp為1株， 2 000 bp為13株。Ⅱ類整合子陽(yáng)性菌株，2 000 bp為1株。

2.2 整合子可變區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定結(jié)果

對(duì)Ⅰ類整合子可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以確定耐藥基因盒類型(表2)。測(cè)序結(jié)果表明，G1的擴(kuò)增產(chǎn)物為2 307 bp的片段中含有cmlA1-aacA4 基因。H1的擴(kuò)增產(chǎn)物為1 867 bp的片段中含有aadA2-linF 基因；K1、P1、P2的擴(kuò)增產(chǎn)物為1 835 bp的片段中含有dfrA12-orfF-aadA2基因。K2、F1、C1的擴(kuò)增產(chǎn)物為1 583 bp片段中含有dfrA17- aadA5基因。A2的擴(kuò)增產(chǎn)物為1 505 bp的片段中含有dfrA1- aadA1 基因。A1的擴(kuò)增產(chǎn)物為1 260 bp的片段中含有cmlA6-aadA1-aadB 基因。C2的擴(kuò)增產(chǎn)物為916 bp的片段中含有aadA22 基因。同源性均為98%～100%。A3、C4、G2、G3、G4擴(kuò)增產(chǎn)物為116 bp的片段中無耐藥基因。

對(duì)Ⅱ類整合子可變區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)以確定耐藥基因盒類型。測(cè)序結(jié)果表明，C3的擴(kuò)增產(chǎn)物為2 106 bp片段中含有dfrA1-sat2-aadA1 基因，同源性為100%。

表2 大腸埃希菌整合子的特征

3 討論

在細(xì)菌通過可移動(dòng)遺傳元件如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子傳播耐藥基因中水平基因轉(zhuǎn)移具有重要作用[10]。整合子能夠在它們的結(jié)構(gòu)中整合耐藥基因盒，超過194種基因盒編碼氨基糖苷類、β內(nèi)酰胺類、氯霉素、喹諾酮類和甲氧芐氨嘧啶抗性[11]。在整合子中可以整合1個(gè)或多個(gè)基因盒，通常不超過5個(gè)基因盒[5]。整合子在人、動(dòng)物和農(nóng)養(yǎng)魚細(xì)菌中均有報(bào)道，在革蘭陰性病原菌耐藥性的發(fā)展中起著重要作用[1]。

本項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，71.43%(40/56)的大腸埃希菌攜帶Ⅰ類整合子，1株大腸埃希菌同時(shí)攜帶Ⅰ類和Ⅱ類整合子。在Ⅰ類整合子中58.33%(7/12)的菌株攜帶編碼甲氧芐啶-鏈霉素耐藥基因，16.67%(2/12)的菌株攜帶編碼氯霉素-氨基糖苷類耐藥基因，16.67%(2/12)的菌株攜帶編碼鏈霉素耐藥基因。在Ⅱ類整合子中攜帶編碼甲氧芐啶-鏈絲菌素-鏈霉素耐藥基因。由此可見，整合子在遼寧地區(qū)豬源大腸埃希菌中普遍存在，主要攜帶Ⅰ類整合子。整合子中檢出了攜帶含有磺胺類、氨基糖苷類及氯霉素相關(guān)耐藥基因的基因盒，從而造成攜帶耐藥基因盒的菌株對(duì)磺胺類、氨基糖苷類及氯霉素類抗生素耐藥，導(dǎo)致大腸埃希菌多重耐藥的形成。

在既往的研究中發(fā)現(xiàn)，整合子在大腸埃希菌的多重耐藥和耐藥傳播中發(fā)揮了重要作用。因此，研究大腸埃希菌中整合子的種類及所攜帶耐藥基因的構(gòu)成，對(duì)大腸埃希菌所致疾病的綜合防治具有重要意義。

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Investigation and Analysis of Whole Carrying Integrons ofEscherichiacolifrom Swine in Liaoning Area

ZHAO Feng-ju,LI Qing-zhu,GUAN Miao,LI Jing-chun,WANG Zhu,CAO Dong, ZHAO Xiao-tong,GU Gui-bo,WEI Shu

(PreventionandControlCenterofLiaoningProvinceAnimalEpidemicDisease,Shenyang,Liaoning,110164,China)

In order to understand the distribution of integrons and types of drug resistance gene cassette inEscherichiacolifrom swine in Liaoning area,and to provide a scientific basis for the comprehensive prevention and control of the disease,the integrons were detected by integrase gene PCR,and variable region of the integron was amplified and sequenced.Results showed that 71.43%(40/56)of the strains were shown to be class Ⅰintegron positive,1.79%(1/56)of the strains were shown to be classⅠ and classⅡ integron positive,and no classⅢ integron was detected.87.8%(36/41)of the positive strains of classⅠintegron contained a gene cassette,which sized from 116 bp to 2 307 bp,100%(1/1)classⅡ integron positive strain contained a 2 106 bp size gene cassette.These gene cassettes included genes encoding resistance to aminoglycosides (aadA1,aadA2,aadA5,aadA22,aadB,aacA4,sat2),sulfonamides (dfrA1,dfrA12,dfrA17),chloramphenicol (cmlA1,cmlA6).Therefore,integrons are widespread inE.coli,theE.colimainly carried resistance gene cassettes of aminoglycosides,sulfonamides,and chloramphenicol in Liaoning.

swine;Escherichiacoli; integron; drug resistance

2016-06-03

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201402573)；遼寧省農(nóng)業(yè)攻關(guān)及產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(2015202013)；2014年中央財(cái)政農(nóng)業(yè)科技推廣示范項(xiàng)目(2130106)

趙鳳菊(1978-)，女，河北廊坊人，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，主要從事動(dòng)物人畜共患病的防控與研究。

S852.612；S858.28

B

1007-5038(2017)01-0115-04