小反芻獸疫病毒N蛋白原核表達與間接ELISA檢測方法的建立

孫 雨，趙柏林，王曉英，董 浩，翟新驗，曲 萍，胡冬梅，楊天意，石 慧，宋曉暉

(中國動物疫病預防控制中心，北京 102600)

小反芻獸疫病毒N蛋白原核表達與間接ELISA檢測方法的建立

孫 雨，趙柏林，王曉英，董 浩，翟新驗，曲 萍，胡冬梅，楊天意，石 慧，宋曉暉*

(中國動物疫病預防控制中心，北京 102600)

小反芻獸疫病毒(PPRV)N蛋白是病毒粒子的主要結(jié)構蛋白，也是診斷小反芻獸疫的主要靶蛋白。為獲得高效表達的可溶性N蛋白，并建立基于N蛋白的小反芻獸疫的間接ELISA檢測方法，通過優(yōu)化密碼子、優(yōu)化表達條件等條件探索，在大腸埃希菌表達系統(tǒng)中獲得了高效表達的可溶性N蛋白，進一步基于N蛋白建立了間接ELISA檢測方法，該方法對其他相關的羊類病原無交叉反應，其組內(nèi)與組間變異系數(shù)均低于9%，具有良好的重復性。對480份臨床血清樣品進行檢測，同時用法國IDVET競爭ELISA試劑盒進行比較，符合率達到98.33%。本研究為進一步開發(fā)成熟的小反芻獸疫抗體檢測試劑盒奠定了基礎。

小反芻獸疫；N活性蛋白；可溶性表達與純化；間接酶聯(lián)免疫吸附試驗

小反芻獸疫(Peste des petitis ruminants,PPR)是由小反芻獸疫病毒(Peste des petitis ruminants virus,PPRV)引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，具有高發(fā)病率和高病死率的特點[1-5]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須上報的動物傳染病，我國將其列為一類動物疫病。該病主要感染綿羊、山羊等家養(yǎng)小反芻動物及一些野生小反芻動物,本病發(fā)病以口炎、發(fā)熱、腹瀉為主要特征[6]。該病于1942年首次在非洲的科特迪瓦發(fā)生，目前主要在非洲西部、中東、阿拉伯半島和南亞大陸等地流行[7-9]。2007年7月小反芻獸疫首次由境外傳入我國西藏阿里地區(qū)，疫情很快被控制。2013年11月底，小反芻獸疫再次傳入我國，疫情波及多個省份。2015年4月農(nóng)業(yè)部制定發(fā)布了《全國小反芻獸疫消滅計劃(2016-2020年)》，提出了到2020年，力爭全國達到小反芻獸疫非免疫無疫區(qū)標準。疫病的控制和消滅，離不開有效的疫苗和快速敏感的檢測手段作為技術支撐。因此，加大快速有效、價格低廉的診斷檢測試劑的研發(fā)力度，加快推動相關產(chǎn)品上市，能夠為我國的全國小反芻獸疫消滅計劃的實施提供有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

pET30a融合表達載體，Novagen公司產(chǎn)品；表達菌BL21(DE3)，北京全式金生物技術有限公司產(chǎn)品； 限制性內(nèi)切酶MluⅠ和XhoⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker DL2 000、SDS、IPTG、TaqPCR Master Mix，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖、DNA Extraction Kit、DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校本┤浇鹕锛夹g有限公司產(chǎn)品；融合蛋白目的基因合成由華大基因生物科技有限公司完成；預染蛋白Marker，F(xiàn)ermentas公司產(chǎn)品；競爭ELISA試劑盒，法國IDVET公司；陰性與陽性樣本血清由中國動物疫病預防控制中心草食動物與人畜共患病室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計 根據(jù)PPRV-N基因序列設計1對引物，并分別在引物的5′端添加MluⅠ和3′端添加XhoⅠ酶切位點，用于目的片段的擴增。

上游引物PPRV-NF:ggatccATGGCAACCTTACTGAAAAGTCTG

下游引物PPRV-NR:ctcgagTCAACCCAGCAGGTCTTTGTCGT

1.2.2 小反芻獸疫原核高效可溶性融合表達載體pET30a-N的構建及鑒定 將pET30a載體進行MluⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切體系為40 μL：10×酶切緩沖液4 μL，MluⅠ和XhoⅠ各1 μL，載體24 μL，去離子水8 μL，酶切產(chǎn)物經(jīng)過10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后用膠回收試劑盒回收。然后將酶切好的載體與擴增后的N編碼基因序列進行連接，構建10 μL的連接體系。其中，N編碼基因片段5.5 μL，pET30a載體1.5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，T4 DNA連接緩沖液2 μL。輕敲管壁，上下顛倒混勻之后瞬時離心，放22℃連接儀中連接4 h。將重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定及測序分析，將測序鑒定為陽性的質(zhì)粒命名為pET30a-N。

1.2.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 將pET30a-N連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進BL21(DE3)細胞中。無菌條件下，取適量BL21菌液加到LB(Kan+)固體培養(yǎng)基平板上，將菌液涂布均勻，待菌液完全吸收后，做好標記，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)16 h。挑取單克隆菌落分別進行菌液鑒定、酶切鑒定、菌液測序，確定N片段轉(zhuǎn)化進pET30a載體中。

1.2.4 重組蛋白可溶性誘導表達條件的建立 將上述鑒定的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)菌E.coli1.BL21(DE3)中，挑取陽性克隆，37℃培養(yǎng)過夜。將菌液以1∶100接種于含卡那霉素(50 μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)至OD值為0.4～0.6時，取出l mL未誘導的菌液作為對照，其余液體中加入異丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)誘導蛋白的表達。經(jīng)過對溫度、時間、IPTG濃度等條件進行優(yōu)化，最終確定蛋白高效可溶性誘導表達條件為：0.75 mmol/L的IPTG濃度，過夜誘導13 h大量表達后，4℃、8000 r/min離心30 min收集菌體。經(jīng)過高壓大規(guī)模破碎菌體后，4℃條件下16 000 r/min離心30 min收集上清。

1.2.5 細菌蛋白表達形式的分析與鑒定 取 IPTG 誘導表達13 h后的菌液用于蛋白表達形式分析。具體步驟為，取1 mL誘導后的重組菌液置于1.5 mL離心管中，做好標記，4℃條件下8000 r/min 離心30 min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入1 mL PBS重懸沉淀，8000 r/min 離心5 min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200 μL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再黏稠。于4℃離心機中16 000 r/min 離心30 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，向剩余的沉淀中加入50 μL PBS重懸沉淀。向上清和沉淀中加入10 μL 5×SDS-PAGE loading buffe，充分混勻后，置沸水浴中煮沸5 min，待樣品冷卻后，用微型離心機瞬離。取6 μL用于SDS-PAGE電泳分析。

1.2.6 可溶性重組蛋白的AKTA系統(tǒng)高效純化方法 高壓破菌后，4℃、16000 r/min離心30 min，棄沉淀，保留上清。上清用0.22 μm濾膜過濾后上樣至預先用20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 8.0的溶液平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機器上，分別用10個柱體積的20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 8.0的溶液與20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑pH 8.0的溶液清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機器上監(jiān)測蛋白峰。用20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑pH 8.0的溶液沖洗鎳柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品。

1.2.7 間接ELISA反應條件的建立與優(yōu)化 采用棋盤方陣滴定法確定蛋白最適包被濃度和最佳血清稀釋度，以不同濃度的BSA封閉酶標板確定最佳封閉液濃度，確定血清和酶標二抗最佳工作時間，優(yōu)化酶標二抗工作濃度，判定標準為：陽性血清與陰性血清的OD 450 nm比值(P/N)最大的孔所對應的反應條件為ELISA方法的最佳反應條件。

1.2.9 特異性試驗 利用建立的間接ELISA方法對羊布魯菌病、結(jié)核病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病、副結(jié)核病和口蹄疫陽性血清進行檢測，觀察與其他疾病有無交叉反應。

1.2.10 敏感性試驗 將已知的小反芻獸疫陽性血清進行倍比稀釋，采用建立的間接ELISA 方法進行檢測，同時采用IDVET抗體檢測試劑盒做對比，得出陽性臨界值時的最大稀釋度。

1.2.11 重復性試驗 采用建立的間接ELISA方法對10份羊血清在同批次板和不同批次板上分別進行檢測，平行測定5次，計算批內(nèi)、批間變異系數(shù)(CV)。

1.2.12 符合性試驗 采用建立的間接ELISA方法與IDVET公司生產(chǎn)的小反芻獸疫競爭法抗體診斷試劑盒對送檢的480份血清進行檢測，計算其符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

使用MluⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒pET30a-N進行雙酶切鑒定。結(jié)果表明，酶切產(chǎn)物于1 725 bp處出現(xiàn)一條明顯的條帶，說明目的片段成功地克隆至pET30a載體中(圖1)。

2.2 誘導表達產(chǎn)物的鑒定

將誘導后的菌體制樣后進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明在63 ku處出現(xiàn)1條明顯的條帶(圖2)，與預期結(jié)果相符，表明成功地獲得重組蛋白pET30a-N。

M.DNA標準；1.pET30a-N質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物; 2.質(zhì)粒鑒定

M.DNA Marker; 1.Products of plasmid pET30a-N digested byMluⅠ andXhoⅠ; 2.Identification of recombinant plasmid

圖1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定圖譜

Fig.1 The map of recombinant plasmid identification

M.DNA標準；1.陰性對照；2～5.陽性克隆菌的蛋白預表達驗證；6.陽性克隆誘導后的全菌；7.細菌破碎后的上清；8.細菌破碎后的沉淀

M.DNA Marker；1.Negative；2-5.Preexpressions of proteins；6.Positive bacteria clones；7.Bacterial supernatant after crushing；8.Bacterial precipitate after breaking

圖2 重組蛋白的SDS-PAGE分析

Fig.2 SDS-PAGE analysis of recombinant protein pET30a-N

2.3 細菌蛋白表達形式的分析與鑒定

通過SDS-PAGE鑒定重組蛋白的表達形式，結(jié)果融合蛋白均為可溶性表達。結(jié)果表明，本試驗應用pET30a構建的pET30a-N載體，經(jīng)過可溶性誘導表達條件的不斷優(yōu)化，表達的可溶性重組蛋白占總蛋白的比例非常高。通過NanoDrop2000超微量分光光度計(ND2000)對得到的蛋白純度進行定量分析，并且結(jié)合蛋白灰度分析軟件分析蛋白含量，結(jié)果表明本研究表達的小反芻獸疫N重組蛋白95%以上可溶。

2.4 可溶性蛋白的AKTA系統(tǒng)高效純化

將鎳柱接入AKTA系統(tǒng)上，分別用10個柱體積的20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH 8.0的溶液與20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L咪唑pH 8.0的溶液清洗鎳柱中的雜質(zhì)蛋白，并在AKTA機器上監(jiān)測蛋白峰。用20 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、300 mmol/L咪唑pH 8.0的溶液沖洗鎳柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現(xiàn)目的蛋白峰的洗脫樣品

2.5 間接ELISA方法的建立與優(yōu)化

將重組蛋白梯度稀釋后包被酶標板，采用棋盤方陣滴定法確定重組蛋白N的包被量和血清稀釋度；并在抗原最佳包被濃度和血清稀釋度基礎上優(yōu)化ELISA 檢測條件。結(jié)果如表1 所示，pET30a-N的質(zhì)量濃度為5 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶200時，P/N值最大，因此確定抗原的最佳包被濃度為5 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶200。同時本試驗確定HRP標記的兔抗山羊IgG 按1∶20 000的比例稀釋，37℃作用1 h，加入TMB顯色液8 min后OD值最佳。

2.6 ELISA 陰陽性臨界值確定

2.7 特異性試驗

采用建立的間接ELISA方法對幾種羊源的病原(羊布病、結(jié)核病、產(chǎn)氣莢膜梭菌病、副結(jié)核病和口蹄疫)陽性血清進行檢測，其OD 450 nm值分別為0.072、0.157、0.089、0.164、0.115，均小于臨界值0.325，表明重組蛋白pET30a-N與羊布病、結(jié)核病、產(chǎn)期莢膜梭菌病、副結(jié)核病和口蹄疫陽性血清均無交叉反應，該間接ELISA方法具有良好的特異性。

2.8 敏感性試驗

將小反芻獸疫陽性血清從1∶25開始進行倍比稀釋，采用重組蛋白pET30a-N作為包被抗原進行檢測，稀釋度為1∶25 600 時仍呈陽性，表明該方法敏感性較好。

2.9 重復性試驗

以不同效價血清稀釋200倍后做平行重復ELISA檢測，結(jié)果顯示，批內(nèi)重復變異系數(shù)在2%～7%之間，批間重復變異系數(shù)小于9 %(表2)。結(jié)果表明，建立的間接ELISA檢測方法具有良好的重復性。

2.10 符合性試驗

采用本試驗建立的間接ELISA檢測方法和法國IDVET的小反芻獸疫抗體診斷試劑盒對實驗室保存的480份血清進行檢測，其中使用該方法檢測陽性率為23.76 %；法國IDVET公司生產(chǎn)的診斷試劑盒檢測陽性率為22.15 %，總符合率為98.33%。

表1 ELISA檢測方法的反應條件優(yōu)化

表2 間接ELISA重復性試驗

3 討論

PPRV基因組共編碼6種結(jié)構蛋白，即核蛋白(N)、磷蛋白(P)、多聚酶大蛋白(L)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)和血凝素蛋白(H)[10]。其中，N蛋白由N基因翻譯，其ORF編碼的蛋白含有525個氨基酸，估計分子質(zhì)量為58 ku。該蛋白是目前已知的PPRV中含量最豐富和免疫原性最強的病毒蛋白。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)N蛋白主要作用是保護病毒免受核糖核酸酶1的降解，并與RNA結(jié)合參與病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程[11]。N蛋白的抗原性穩(wěn)定，在病毒感染的動物血清中針對N蛋白的抗體占主導地位，是一個很好的作為診斷抗原的靶基因。但是，多數(shù)研究表達的小反芻獸疫N蛋白表達產(chǎn)物通常以不溶性的包涵體形式存在，具有可溶性的活性蛋白表達的報道較少[12]。包涵體蛋白的表達由于存在表達量不足以及空間結(jié)構存在錯誤折疊，不能形成高級蛋白結(jié)構與天然空間構象表位，導致其作為診斷抗原不能形成很好的免疫空間表位。同時，包涵體中的表達產(chǎn)物不具有生物學活性，因而需要進行變性與復性處理。蛋白的變性與復性是一個極其復雜的過程，不同蛋白的復性條件各異，復性率往往很難提高。這是限制其應用的主要制約因素。采用可溶性表達方式可很好的克服這一問題。如何通過條件優(yōu)化，在大腸埃希菌中獲得表達量高并且可溶性好的蛋白，是本領域研究的熱點。本研究通過優(yōu)化密碼子、優(yōu)化表達條件等多個環(huán)節(jié)進行反復探索，成功地在大腸埃希菌中獲得了可溶性高表達抗原。大腸埃希菌白表達水平高，生產(chǎn)成本低，利用大腸埃希菌獲得高表達的活性蛋白，為進一步開發(fā)商品化試劑盒奠定了一定的基礎。

近年來，針對小反芻獸疫診斷技術的研究較多。目前市場上銷售的用于檢測PPRV抗體的試劑盒主要為國外進口，價格昂貴，給基層小反芻獸疫檢測和監(jiān)測工作的開展帶來一定的困難。本研究以高濃度可溶性的N蛋白作為包被抗原，所優(yōu)化建立的間接ELISA 檢測方法具有良好的特異性、敏感性與重復性，與其他幾種羊源疾病的陽性血清無任何交叉反應。取陽性值較高的羊血清進行稀釋后測定OD450 nm值，同時與法國IDVET公司生產(chǎn)的抗體檢測試劑盒做對比符合率達到98.33%，結(jié)果顯示該方法具有較好的敏感性和重復性。 結(jié)果表明本研究建立的間接ELISA方法可以很好地用于小反芻獸疫的臨床診斷。本研究基于大腸埃希菌表達系統(tǒng)表達的可溶性高表達的N蛋白，并依次建立的ELISA方法具有較高的特異性和靈敏性，進一步可完善成為成熟的產(chǎn)品，用于基層小反芻獸疫疫苗免疫效果監(jiān)測等實際工作中，具有較強的應用價值和應用前景。

[1] 王 華,吳曉東,包靜月.我國小反芻獸疫現(xiàn)狀與防控策略[J].動物醫(yī)學進展,2015,36(6):142-155.

[2] Baron M D,Diallo A,Lancelot R.Peste des petits ruminants virus [J].Adv Virus Res,2016,95(3):1-42.

[3] Boussini H,Chitsungo E,Bodjo S C.First report and characterization of peste des petits ruminants virus in Liberia,West Africa[J].Trop Anim Health Prod,2016,6:17.

[4] Aziz-Ul-Rahman,Abubakar M,Rasool M H.Evaluation of risk factors for peste des petits ruminants virus in sheep and goats at the wildlife-livestock interface in punjab province,pakistan [J].Biomed Res Int,2016,7826245. doi: 10.1155/2016/7826245.

[5] 劉玉洪,徐自忠,花群義.小反當獸疫病毒分子生物學研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2006,27(12):1-6.

[6] Li L,Wu X,Liu F．Rapid detection of lineage Ⅳ peste des petits ruminants virus by real-time RT-PCR[J].J Virol Methods,2016,148(1):131-133.

[7] 趙 剛.小反芻獸疫的流行動態(tài)及疫苗的研究進展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2014(3):52-55.

[8] 李繼東,蒙學蓮,朱學亮.小反芻獸疫病毒H基因或F基因重組山羊痘病毒活載體疫苗的研究[J].中國獸醫(yī)科學,2015(2):111-117.

[9] Sharma K K,Kshirsagar D P,Kalyani I H.Diagnosis of peste des petits ruminants infection in small ruminants through in-house developed Indirect ELISA:Practical considerations [J].V Vet World,2015,8(4):443-448.

[10] Wu X,Liu F,Li L.Diagnosis of peste des petits ruminants infection in small ruminants through in-house developed Indirect ELISA:Practical considerations [J].Virus Genes,2016,52(3):422-427

[11] Holzer B,Hodgson S,Logan N.Protection of cattle against rinderpest by vaccination with wild-type but not attenuated strains of peste des petits ruminants virus.[J].J Virol,2016,90(10):5152-5162.

[12] Taylor W.The global eradication of peste des petits ruminants (PPR) within 15 years-is this a pipe dream? [J].Trop Anim Health Prod,2016,48(3):559-567.

Prokaryotic Expression of N Protein of Peste des Petits Ruminants Virus and Development of Indirect ELISA

SUN Yu,ZHAO Bo-lin,WANG Xiao-ying,DONG Hao,ZHAI Xin-yan,QU Ping, HU Dong-mei,YANG Tian-yi,SHI Hui,SONG Xiao-hui

(ChinaAnimalDiseaseControlCenter,Beijing，102600,China)

Peste des petits ruminants virus (PPRV) N protein is the major structural protein of virus particles,and it is the main target protein in the diagnosis of PPRV.To establish the expression and purification methods for efficient soluble PPRV N protein and indirect ELISA method for diagnosis of PPRV based on N,this study got a high expression of soluble N protein inEscherichiacoliexpression system through optimization of codon and expression conditions,and established an indirect ELISA detection method based on N protein.The results showed that the assay was specific and repeatable.Furthermore,a total of 480 clinical serum samples were detected by this assay and the agreement was 98.33% with commercial ELISA Kit (IDVET).This study laid the foundation for the further development of kit for detection of PPRV antibody.

Peste des petits ruminants; N active protein; soluble expression and purification; indirect ELISA

2016-03-03

國家重點計劃研發(fā)項目(2016YFD0500901)

孫 雨(1983-)，男，山東高密人，獸醫(yī)師，博士，主要從事人畜共患病預防控制研究。*通訊作者

S852.659.5

A

1007-5038(2017)01-0006-05