大腸埃希菌ETT2毒力島ECs3703基因和HPI毒力島irp2基因雙重LAMP檢測(cè)方法的建立

蔡樹東，成大榮，朱善元，吳 雙*，左偉勇

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州 225300)

研究論文

大腸埃希菌ETT2毒力島ECs3703基因和HPI毒力島irp2基因雙重LAMP檢測(cè)方法的建立

蔡樹東1，成大榮1，朱善元2，吳 雙2*，左偉勇2

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇泰州 225300)

根據(jù)GenBank中大腸埃希菌ETT2毒力島保守基因ECs3703和HPI毒力島的保守基因irp2分別設(shè)計(jì)一套LAMP引物，在同一體系中進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)體系Mg2+、dNTP、內(nèi)引物及反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，建立了在60℃恒溫下對(duì)大腸埃希菌ETT2和HPI毒力島進(jìn)行同步檢測(cè)的LAMP方法，并進(jìn)行了特異性和靈敏性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，所建立的雙重LAMP檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)ETT2和HPI毒力島大腸埃希菌檢測(cè)限均可達(dá)到100 fg，比常規(guī)PCR靈敏度高100倍。利用該方法對(duì)8株非大腸埃希菌進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性。用該方法對(duì)采集的20份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，與雙重PCR檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)果顯示，該雙重LAMP方法可用于大腸埃希菌ETT2和HPI毒力島的同步快速檢測(cè)，可作為臨床疫病診斷的有效手段。

大腸埃希菌；ETT2毒力島；HPI毒力島；雙重LAMP

大腸埃希菌(Escherichiacoli)是人和動(dòng)物腸道中普遍存在的一類細(xì)菌。根據(jù)其致病性大致分為腸致病性大腸埃希菌(EPEC)、侵襲性大腸埃希菌(EIEC)、產(chǎn)毒素性大腸埃希菌(ETEC)、腸出血性大腸埃希菌(EHEC/STEC)和黏附性大腸埃希菌(EAEC)[1]。由大腸埃希菌引起的疾病給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了不可估量的損失，近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的各種毒力島使得大腸埃希菌的致病性更具復(fù)雜性，主要有ETT2毒力島和HPI毒力島等。

ETT2毒力島全稱為大腸埃希菌3型分泌系統(tǒng)2(E.colitype three secretion system 2，ETT2)毒力島，大小約29.9 kb。德國(guó)學(xué)者Prager R等對(duì)豬源大腸埃希菌ETT2毒力島進(jìn)行了檢測(cè)和序列分析，初步揭示了ETT2毒力島的遺傳與進(jìn)化，并揭示可能與豬源大腸埃希菌的致病性密切相關(guān)。HPI毒力島全稱為耶爾森菌強(qiáng)毒力島(high pathogenicity island，HPI)，大小約為35 kb，最早發(fā)現(xiàn)于耶爾森菌屬，與小鼠致死表型密切相關(guān)，被命名為強(qiáng)毒力島。Schubert S首次報(bào)道在人源致瀉性大腸埃希菌中，除腸出血性大腸埃希菌外，均不同程度地?cái)y帶耶爾森菌HPI毒力島相關(guān)基因，其中ETEC中有93%，EIEC中有27%，EPEC和ETEC中發(fā)現(xiàn)有5%的HPI的存在，且其irp2和fyuA基因與耶爾森菌幾乎相同，這提示了HPI毒力島可在鼠疫耶爾森菌和致病性大腸埃希菌之間水平傳播[2]。因此，建立一種快速、高效、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法是大腸埃希菌臨床檢測(cè)的迫切需要。目前用于大腸埃希菌的檢測(cè)方法有傳統(tǒng)方法和基因方法。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜，已不能滿足基層和臨床中及時(shí)、靈敏、快速檢測(cè)的要求，不利于疾病的防控；基因檢測(cè)技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)，已成為病原檢測(cè)的重要技術(shù)之一，主要包括常規(guī)PCR、套式PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等，但該技術(shù)需要依靠昂貴的PCR儀器設(shè)備，不利于基層推廣應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(cloop-mediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)是由Notomi T等[3]于2000年研發(fā)的一種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、擴(kuò)增效率高而且產(chǎn)物檢測(cè)簡(jiǎn)便，目前已廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)、動(dòng)物胚胎性別鑒定、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)及腫瘤基因檢測(cè)等領(lǐng)域。近年來(lái)，不少學(xué)者利用該技術(shù)的多重檢測(cè)方法進(jìn)行同種病原多種基因的快速檢測(cè)和多種不同病原的初篩快速檢測(cè)。本研究選擇大腸埃希菌ETT2毒力島ECs3703基因和HPI毒力島irp2基因序列為保守基因，分別設(shè)計(jì)LAMP引物，建立了大腸埃希菌2種毒力島的雙重LAMP檢測(cè)方法，希望能有效提高大腸埃希菌檢測(cè)效率，節(jié)約檢測(cè)成本，為基層和現(xiàn)場(chǎng)病原檢測(cè)提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 ETT2毒力島大腸埃希菌、HPI毒力島大腸埃希菌、葡萄球菌、巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、鴨疫里默菌、變形桿菌、鏈球菌、沙門菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌均由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離保存。1.1.2 主要試劑與儀器 dNTP Mixture和DNA Marker DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；MgCl2和Bst DNA 聚合酶，New England Biolabs公司產(chǎn)品；SYBR Green I，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品。PCR擴(kuò)增儀，LAMP擴(kuò)增儀，水浴鍋，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 以ECs3703基因作為ETT2毒力島的檢測(cè)標(biāo)志基因，irp2基因作為HPI毒力島的檢測(cè)標(biāo)志基因。下載GenBank中發(fā)表的ECs3703序列和irp2序列，用MegAlign軟件分別對(duì)兩種基因組序列進(jìn)行對(duì)比分析，分別選擇各自的保守序列，運(yùn)用引物在線設(shè)計(jì)軟件PrimerExplorer V4進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行篩選。引物序列見(jiàn)表1。

表1 雙重LAMP中所用到的引物

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的制備 將細(xì)菌分別接種于TSB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)6 h～8 h，取1 mL細(xì)菌培養(yǎng)物于1.5 mL指形管中，在4℃以12 000 r/min離心5 min，棄去上清。將沉淀重懸于100 μL滅菌的超純水中，用漩渦混合器混勻后。采用熱煮沸法分別制備各個(gè)細(xì)菌的DNA模板。

1.2.3 雙重LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化 以ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌混合DNA為模板，主要對(duì)體系中Mg2+、dNTP、內(nèi)引物及反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。鎂離子濃度設(shè)置為0.5、1、1.5、2、2.5、3 mmol/L；dNTP濃度設(shè)置為0.8、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L；內(nèi)引物濃度設(shè)置為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 μmol/L；多次重復(fù)試驗(yàn)后根據(jù)擴(kuò)增效果確定各組分最佳濃度。反應(yīng)溫度設(shè)置為60、61、62、63、64、65℃；反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為15、30、45、60、75、90 min；同樣多次重復(fù)試驗(yàn)確定最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間。

1.2.4 雙重LAMP特異性試驗(yàn) 以葡萄球菌、巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、鴨疫里默菌、變形桿菌、鏈球菌、沙門菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌為檢測(cè)對(duì)象，同時(shí)以ETT2大腸埃希菌、HPI大腸埃希菌及ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌混合樣品為陽(yáng)性對(duì)照，以超純水為陰性對(duì)照，采用本研究所建立的雙重LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證雙重LAMP方法的特異性。

1.2.5 雙重LAMP靈敏性試驗(yàn) 測(cè)定試驗(yàn)菌株ETT2和HPI大腸埃希菌的DNA濃度，分別以超純水10倍倍比稀釋，各菌株每個(gè)梯度取 2 μL加入反應(yīng)體系，使得體系中ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌DNA量均為1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg，以超純水為陰性對(duì)照，分別利用雙重LAMP方法和雙重PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)電泳結(jié)果對(duì)兩者靈敏度進(jìn)行評(píng)估。

1.2.6 雙重LAMP可視化檢測(cè) 按照優(yōu)化的條件配置好體系后，取1 μL SYBR Green Ⅰ 染料，反應(yīng)前滴加在反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)，小心操作以免將染料掉入反應(yīng)液，反應(yīng)結(jié)束后倒置反應(yīng)管將染料和反應(yīng)液混勻，通過(guò)顏色變化確定反應(yīng)是否發(fā)生。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 利用建立的雙重LAMP對(duì)采集的20份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種檢測(cè)方法的相符性。

2 結(jié)果

2.1 雙重LAMP反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果 通過(guò)對(duì)雙重LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化，最終確定LAMP反應(yīng)體系為：10×ThermoPol緩沖液2.5 μL，25 mmol/L MgCl21 μL，10 mmol/L dNTP 4 μL，10 μmol/L外引物 ECs3703 F3/B3各0.5 μL，10 μmol/L內(nèi)引物ECs3703 FIP/BIP各2.5 μL，10 μmol/L外引物 irp2 F3/B3各0.5 μL，10 μmol/L內(nèi)引物irp2 FIP/BIP各2.5 μL，8 U/μL Bst DNA聚合酶1 μL，ETT2大腸埃希菌DNA 2 μL，HPI大腸埃希菌DNA 2 μL，ddH2O 0.5 μL(圖1、圖2和圖3)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～6.0.5 mmol/L、1 mmol/L、1.5 mmol/L、2 mmol/L、2.5 mmol/L、3 mmol/L；7.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.0.5 mmol/L，1 mmol/L，1.5 mmol/L，2 mmol/L，2.5 mmol/L，3 mmol/L；7.Negative control

圖1 氯化鎂的優(yōu)化

Fig.1 Result of the optimization of MgCl2

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000; 1～6.0.8 mmol/L、1 mmol/L、1.2 mmol/L、1.4 mmol/L、1.6 mmol/L、1.8 mmol/L；7.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.0.8 mmol/L，1 mmol/L，1.2 mmol/L，1.4 mmol/L，1.6 mmol/L，1.8 mmol/L；7.Negative control

圖2 dNTP的優(yōu)化

Fig.2 The optimization of dNTP

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000 ; 1～6.0.1 μmol/L、0.2μmol/L、0.4 μmol/L、0.6 μmol/L、0.8 μmol/L、1 μmol/L；7.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.0.1 μmol/L，0.2 μmol/L，0.4 μmol/L，0.6 μmol/L，0.8 μmol/L，1 μmol/L；7.Negative control

圖3 內(nèi)引物的優(yōu)化

Fig.3 The optimization of inter primer

2.1.2 反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果 通過(guò)對(duì)反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化，最終確定最佳溫度為60℃(圖4)，最佳反應(yīng)時(shí)間為75 min(圖5)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1～6.60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃；7.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.60℃，61℃，62℃，63℃，64℃，65℃；7.Negative control

圖4 溫度的優(yōu)化

Fig.4 The optimization of temperature

M.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1～6.15 min、30 min、45 min、60 min、75 min、90 min；7.陰性對(duì)照

M.DNA Marker DL 2 000; 1-6.15 min，30 min，45 min，60 min，75 min，90 min；7.Negative control

圖5 時(shí)間的優(yōu)化

Fig.5 The optimization of time

2.2 雙重LAMP特異性檢測(cè)結(jié)果

由圖6特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)含有ETT2毒力島的大腸埃希菌、HPI毒力島的大腸埃希菌及ETT2和HPI大腸埃希菌混合樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而其他8種非大腸埃希菌均顯示陰性，說(shuō)明本方法特異性良好，可有效檢測(cè)含有ETT2和HPI毒力島的大腸埃希菌，而不與其他細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.3 雙重LAMP靈敏性檢測(cè)結(jié)果

以倍比稀釋的ETT2和HPI毒力島大腸埃希菌的DNA為模板，分別進(jìn)行雙重LAMP和雙重PCR靈敏性檢測(cè)，結(jié)果顯示見(jiàn)圖7和圖8。雙重LAMP方法靈敏性比雙重PCR高100倍。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1.陰性對(duì)照；2～12.分別為ETT2大腸埃希菌、HPI大腸埃希菌、ETT2和HPI大腸埃希菌的混合、葡萄球菌、巴氏桿菌、豬丹毒桿菌、鴨疫里默菌、變形桿菌、鏈球菌、沙門菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control；2-12.ETT2Escherichiacoli，HPIEscherichiacoli，ETT2 and HPIEscherichiacoli，Staphylococcus，Pasteurella，Erysipelas，Riemerellaanatipestifer，Proteus，Streptococcus，Salmonella，Clostridiumperfringens

圖6 雙重LAMP特異性試驗(yàn)

Fig.6 The specificity test of duplex LAMP

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1.陰性對(duì)照；2～8. 1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control；2-8.1 ng，100 pg，10 pg，1 pg，100 fg，10 fg，1 fg

圖7 雙重LAMP靈敏性試驗(yàn)

Fig.7 The sensitivity test of duplex LAMP

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1.陰性對(duì)照；2～8. 1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Negative control;2-8. 1 ng,100 pg,10 pg,1 pg,100 fg,10 fg,1 fg

圖8 雙重PCR靈敏性試驗(yàn)

Fig.8 The sensitivity test of duplex PCR

2.4 雙重LAMP可視化檢測(cè)結(jié)果

擴(kuò)增結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，將管蓋內(nèi)側(cè)的染料與擴(kuò)增產(chǎn)物混勻，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌的反應(yīng)管中反應(yīng)液顏色變?yōu)辄S色，而陰性對(duì)照仍然為橙色(圖9)。

1.陰性對(duì)照.2～4.分別為ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌的混合、ETT2大腸埃希菌、HPI大腸埃希菌

1.Negative control;2-4.ETT2 and HPIEscherichiacoli,ETT2Escherichiacoli,HPIEscherichiacoli

圖9 雙重LAMP可視化檢測(cè)

Fig.9 The visualization detection of duplex LAMP

2.5 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)采集的20個(gè)臨床樣品進(jìn)行雙重LAMP檢測(cè)，結(jié)果有7份為陽(yáng)性，然后利用常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有2份同時(shí)含有ETT2和HPI毒力島，有2份為含有ETT2毒力島的大腸埃希菌，有3份為含有HPI毒力島的大腸埃希菌。

3 討論

在基層和現(xiàn)場(chǎng)疫病病原檢測(cè)中，檢測(cè)速度和疫病的進(jìn)一步防控有著密切的關(guān)系，同時(shí)，檢測(cè)方法的簡(jiǎn)便性對(duì)于基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)也至關(guān)重要。但在基層由于試驗(yàn)條件的局限性，常常無(wú)法實(shí)現(xiàn)較為復(fù)雜的檢測(cè)。因此，建立一種快速簡(jiǎn)便、靈敏特異的方法對(duì)于基層和現(xiàn)場(chǎng)疫病檢測(cè)尤為重要。LAMP技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于病毒檢測(cè)、細(xì)菌檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、腫瘤檢測(cè)及胚胎性別鑒定[4-8]。而有關(guān)LAMP技術(shù)應(yīng)用的報(bào)道大部分都是單重LAMP檢測(cè)，近年來(lái)，為了滿足臨床疫病快速檢測(cè)的要求，人們逐漸向多重LAMP檢測(cè)的方向發(fā)展。袁向芬等[9]建立了豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的雙重RT-LAMP檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，該方法的靈敏度與熒光定量RT-PCR相當(dāng)，比常規(guī)RT-PCR高10倍。趙軍等[10]針對(duì)蠟樣芽胞桿菌和金黃色葡萄球菌的nhe、nuc基因設(shè)計(jì)了2套LAMP引物，并建立了檢測(cè)2種菌的二重LAMP檢測(cè)方法，結(jié)果表明，該二重LAMP檢測(cè)方法其靈敏度檢測(cè)限達(dá)10 fg/μL。陳兵等[11]建立了禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和傳染性法氏囊病病毒(IBDV)3種病毒的實(shí)時(shí)熒光多重反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(multiplex real-time revese transcription-LAMP,mRT-LAMP)檢測(cè)方法，結(jié)果表明，該mRT-LAMP檢測(cè)方法可對(duì)AIV、NDV、IBDV同時(shí)進(jìn)行篩選檢測(cè)，靈敏度可達(dá)到10個(gè)基因拷貝，與單項(xiàng)LAMP檢測(cè)的靈敏度相當(dāng)。

高特異性引物的設(shè)計(jì)是實(shí)現(xiàn)LAMP擴(kuò)增的關(guān)鍵，在多重LAMP反應(yīng)中，由于引物數(shù)量較多，使得反應(yīng)成分較為復(fù)雜，可能會(huì)引起競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，影響反應(yīng)的準(zhǔn)確性和靈敏性，為了降低這種作用，必須根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則更加合理地進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)與篩選。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)內(nèi)引物對(duì)LAMP擴(kuò)增影響較大，因此，在多重LAMP反應(yīng)中進(jìn)行內(nèi)引物濃度的優(yōu)化是必要的。

本研究建立了大腸埃希菌ETT2毒力島和HPI毒力島的雙重LAMP檢測(cè)方法，經(jīng)過(guò)優(yōu)化確定了最佳反應(yīng)條件為鎂離子濃度1 mmol/L，dNTP濃度1.6 mmol/L，內(nèi)引物濃度1 μmol/L，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間75 min。在此條件下雙重LAMP同時(shí)檢測(cè)ETT2大腸埃希菌和HPI大腸埃希菌DNA最低檢測(cè)限為100 fg。通過(guò)特異性試驗(yàn)表明所設(shè)計(jì)的兩套引物具有很好的特異性，擴(kuò)增結(jié)果可通過(guò)加入SYBR Green Ⅰ染料根據(jù)顏色變化判斷。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，本研究所建立的雙重LAMP檢測(cè)方法，具有耗時(shí)短，成本低廉，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，尤為適合基層和現(xiàn)場(chǎng)的疫病檢測(cè)。

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Establishment of Duplex Loop-mediated Isothermal Amplification for Detecting Genes ofEscherichiacoliETT2 and HPI Pathogenicity Islands

CAI Shu-dong1,CHENG Da-rong1,ZHU Shan-yuan2,WU Shuang2,ZUO Wei-yong2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，YangzhouUniversity，Yangzhou,Jiangsu,225009,China；2.JiangsuAgri-animalHusbandryVocationalCollege，JiangsuVeterinaryBio-pharmaceuticalKeyLaboratoryofHigh-techResearch，Taizhou,Jiangsu,225300,China)

Two sets of loop-mediated isothermal amplification(LAMP) primers were designed according to the conserved nucleic acid sequences ofEscherichiacoliETT2 and HPI pathogenicity island genes in GenBank.In the same system of LAMP,by optimizing the system of Mg2+,dNTP,inter primer and reaction temperature,time, the duplex LAMP was established for simultaneous detection ofEscherichiacoliETT2 and HPI pathogenicity islands under the constant temperature of 60℃,and the specificity and sensitivity were tested.In result,the sensitivity of the duplex LAMP is 100 times higher than that of conventional PCR.Using the duplex LAMP, 8 strains of nonEscherichiacolishowed negative results.A total of 20 clinical samples were tested by duplex LAMP and duplex PCR,the result is consistent.In conclusion,the duplex LAMP method can be used for the rapid detection ofEscherichiacoliETT2 and HPI pathogenicity islands,as an effective means for the diagnosis of clinical disease.

Escherichiacoli; ETT2 pathogenicity island;HPI pathogenicity island;duplex LAMP

2016-06-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31440083); 江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目——校企合作基金項(xiàng)目(201512806029H)

蔡樹東(1991-),男,甘肅武威人,碩士研究生,主要從事預(yù)防獸醫(yī)微生物學(xué)研究。*通訊作者

S852.612

A

1007-5038(2017)01-0001-05