低表達(dá)miR-21對苦參堿誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響*

羅耀玲， 黃鈾新， 賴 平， 張敏鴻

(1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心， 2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科, 3贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

低表達(dá)miR-21對苦參堿誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響*

羅耀玲1， 黃鈾新2， 賴 平3， 張敏鴻1

(1贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，2贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,3贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

目的： 探討miR-21低表達(dá)能否增強(qiáng)苦參堿(matrine，MAT)對肝癌細(xì)胞的促凋亡作用。方法: 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測不同濃度MAT作用HepG2細(xì)胞后miR-21的表達(dá)情況。流式細(xì)胞術(shù)檢測miR-21低表達(dá)對MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響；RT-qPCR和Western blot檢測miR-21低表達(dá)對MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中Bcl-2和Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果: miR-21表達(dá)量隨MAT作用濃度的增加而增加；miR-21低表達(dá)可促進(jìn)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)Bax mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)，而抑制Bcl-2 mRNA和蛋白的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論: miR-21低表達(dá)可通過抑制Bcl-2和促進(jìn)Bax的表達(dá)來增強(qiáng)MAT誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡。

miR-21； 苦參堿； HepG2細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是危害我國居民健康的主要惡性腫瘤之一，每年新發(fā)病例超過 40 萬，且發(fā)病仍呈上升趨勢[1]，目前仍未有滿意的治療方法。近年來，從中藥中提取的抗癌藥物因其抗腫瘤作用確切，副作用小而受到國內(nèi)外研究的關(guān)注?？鄥A(matrine，MAT)是傳統(tǒng)中藥苦參的有效成分，具有多方面的腫瘤抗性機(jī)制，主要包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等[2-3]。

肝癌的微小RNA(microRNA，miRNA，miR)調(diào)控機(jī)制表明，miRNA既可直接參與細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，也可通過調(diào)節(jié)癌基因和(或)抑癌基因來參與HCC的發(fā)生[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA 亦參與到中藥抗腫瘤作用過程中[5-6]，但其作用方式和機(jī)制還不是很清楚。本課題組在研究苦參堿誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡時發(fā)現(xiàn)，苦參堿可致miR-21表達(dá)上調(diào)。由此推測，miR-21可能參與了苦參堿誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。本研究將驗證這一推測并初步探討miR-21參與調(diào)控苦參堿誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 試劑

苦參堿(索萊寶);化學(xué)合成修飾的miR-21抑制物(inhibitor, In)片段(In-miR-21)及其陰性對照(negative control, NC)片段由上海吉瑪合成；Lipofectamine 2000(Invitrogen)；細(xì)胞周期凋亡檢測試劑盒(BD)；TRIzol試劑(北京雷根)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(上海吉瑪)；抗β-actin、Bcl-2、Bax和IgG抗體(中杉金橋)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人肝癌細(xì)胞系HepG2(本室保存)培養(yǎng)于含10%胎牛血清(四季青)的RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco)中，所有實驗用細(xì)胞均處于對數(shù)生長期，存活率大于95%。細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前1 d接種，待密度達(dá)50%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗，采用Lipofectamine 2000將In-miR-21及NC轉(zhuǎn)入HepG2細(xì)胞中，4 h換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，具體操作按照說明書進(jìn)行。并通過RT-qPCR驗證轉(zhuǎn)染效果。

2.2 RT-qPCR檢測miR-21在不同濃度苦參堿作用的HepG2細(xì)胞中的表達(dá) 取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)消化后按每孔2×105個接種于6孔培養(yǎng)板，第2天棄培養(yǎng)液，分別加入含新鮮配制的終濃度為0、0.25、0.5、0.75和1 g/L苦參堿的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，采用TRIzol提取總RNA，為了提到小RNA,加入異丙醇后-70 ℃放置過夜；以miR-21和U6的逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR。逆轉(zhuǎn)錄引物以及miR-21的PCR引物均由上海吉瑪合成。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min; 95 ℃ 12 s, 62 ℃ 40 s，40個循環(huán)。所有樣本均做3個復(fù)孔，并設(shè)陰、陽性對照組。以U6為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)采用相對定量法，以2-ΔΔCt法來進(jìn)行分析。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞，按每孔2×105個接種于6孔培養(yǎng)板，第2天轉(zhuǎn)染，分未轉(zhuǎn)染(non-transfection, NT)組、陰性片段轉(zhuǎn)染組(NC組)及miR-21 inhibitor轉(zhuǎn)染組(In-miR-21組)；于轉(zhuǎn)染5 h后棄培養(yǎng)液，并加入含新鮮配制的終濃度為0.75 g/L苦參堿(增殖抑制率為40%)的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集各孔細(xì)胞(死細(xì)胞與活細(xì)胞都收集)，PBS洗2遍，然后用1×Annexin結(jié)合液調(diào)整濃度至1×109/L，從中取100 μL加5 μL Annexin V和5 μL PI(100 mg/L)，室溫避光作用15 min，加入400 μL 1×Annexin結(jié)合液，上流式細(xì)胞儀檢測。

2.4 RT-qPCR檢測不同處理組中Bcl-2和Bax的 mRNA表達(dá) 采用TRIzol提取不同處理組細(xì)胞中的總RNA。Bcl-2的上游引物為5’-GGAGAGGGTCACAAATCCTAAA-3’，下游引物為5’-TGCCACAGA GTTATTCCATCAA-3’；Bax的上游引物為5’-ATGGGCTGG ACATTGGACT-3’，下游引物為5’-GGGCAGAAGGCACTAATCAAG-3’；β-actin的上游引物為5’-TATCCAGGCTGTGCTATCCC-3’，下游引物為5’-CCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3’。PCR條件和數(shù)據(jù)分析同2.2。

2.5 Western blot檢測不同處理組中Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)水平 用蛋白裂解液冰上裂解各組細(xì)胞30 min，然后12 000 r/min離心5 min，上清即為總蛋白。用BCA定量試劑盒定量后進(jìn)行SDS-PAGE(各組總蛋白上樣量均為30 μg)分離蛋白并電轉(zhuǎn)PVDF膜，通過封閉液封閉、Ⅰ 抗孵育、洗滌膜、Ⅱ 抗孵育、洗滌膜的過程，最后ECL顯影，Bio-Rad凝膠成像儀上拍照，并做灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

將所得實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多個樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-21在In-miR-21轉(zhuǎn)染組與非轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)比較

RT-qPCR結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)染組和陰性對照轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染了miR-21抑制劑的組中miR-21的表達(dá)量明顯降低(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The relative expression levels of miR-21 in the HepG2 cells transfected with In-miR-21. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsNT or NC.

圖1 miR-21在非轉(zhuǎn)染組、陰性轉(zhuǎn)染組和In-miR-21轉(zhuǎn)染組中的相對表達(dá)量

2 miR-21在不同濃度苦參堿作用的HepG2細(xì)胞中的表達(dá)比較

RT-qPCR結(jié)果表明，苦參堿作用HepG2細(xì)胞24 h后，隨著苦參堿濃度的增加，miR-21的表達(dá)亦不斷增加，當(dāng)苦參堿濃度達(dá)到0.75 g/L以上時，與未加藥組相比，miR-21的表達(dá)顯著增加(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The relative expression of miR-21 in the HepG2 cells treated with different concentrations of matrine. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 g/L group.

圖2 miR-21在不同濃度苦參堿作用中的相對表達(dá)量

3 In-miR-21促進(jìn)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

miR-21是癌基因，可抑制細(xì)胞凋亡。為了了解低表達(dá)miR-21能否促進(jìn)MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，我們采用Annexin V/PI雙染法檢測In-miR-21對MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。定量分析凋亡百分比結(jié)果顯示MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率與對照組相比明顯增高(P<0.01)，與MAT處理的NC組相比無差異;In-miR-21與MAT共同處理后，細(xì)胞凋亡百分比明顯升高(P<0.05)，見圖3。這說明低表達(dá)miR-21可協(xié)同MAT促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

4 In-miR-21對MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響

為了探討miR-21低表達(dá)后促進(jìn)苦參堿誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的機(jī)制，利用RT-qPCR檢查Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示NT+MAT組、NC+MAT組和In-miR-21+MAT組與NT組相比，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平均降低(P<0.05)，而Bax的mRNA表達(dá)水平均升高(P<0.05)；In-miR-21+MAT組與NC+MAT組相比，Bcl-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，而Bax的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01), 見圖4。

5 In-miR-21對MAT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中Bcl-2和Bax蛋白的影響

灰度值統(tǒng)計分析結(jié)果表明各處理組與NT組相比，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平均降低(P<0.05)，而Bax蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)；In-miR-21+MAT組與NC+MAT組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)，而Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，見圖5。

Figure 3.In-miR-21 promoted MAT-induced HepG2 cell apoptosis. Mean±SD.n=3.◆P<0.05vsNT;*P<0.05vsNC+MAT.

圖3 In-miR-21促進(jìn)MAT誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡

Figure 4.The effect of In-miR-21 on the mRNA expression of Bcl-2 and Bax in the HepG2 cells detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNT;##P<0.01vsNC+MAT.

圖4 In-miR-21對MAT誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞 Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響

Figure 5.The effect of In-miR-21 on the protein expression of Bcl-2 and Bax in the HepG2 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsNT;##P<0.01vsNC+MAT.

圖5 In-miR-21對MAT誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

討 論

肝癌的治療目前仍然是以手術(shù)、放療和化療為主，總的5年生存率不高，且預(yù)后差。為此，人們不斷尋找各種新的治療方法，如干細(xì)胞療法[7]、生物免疫療法[8]、基因(包括miRNA)干預(yù)[9-10]、中藥療法等。近年來研究表明中藥可通過多種機(jī)制來影響腫瘤的生長、代謝過程，還可以對機(jī)體免疫力、內(nèi)分泌等進(jìn)行調(diào)控；起到了抑制腫瘤生長，減輕化療藥物的毒副作用，提高機(jī)體的免疫力的作用，從而提高腫瘤患者的生存周期和質(zhì)量[11-13]。本課題組研究的苦參堿對肝癌亦具有較好的抗瘤效果，0.75 g/L苦參堿對HepG2細(xì)胞的增殖抑制率為40%(MTT實驗得出,本文未列出該結(jié)果)。

miRNA是一種長度為 18～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶基因的 3’端不完全或完全配對，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)的作用。miR-21是第1個在人類基因組中發(fā)現(xiàn)的 miRNA，位于17q23.2；是唯一在所有惡性腫瘤中高表達(dá)的 miRNA，被公認(rèn)為一個致癌性小RNA[14]。眾多研究表明miR-21的表達(dá)增加會抑制細(xì)胞的凋亡而促進(jìn)細(xì)胞增殖[15-16]。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA 亦參與到中藥抗腫瘤作用過程中，如Zhang等[5]發(fā)現(xiàn)在人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中miR-21可通過下調(diào)PTEN抑制姜黃素的抗癌活性。PTEN是抑癌基因，已證實是miR-21的下游靶基因；當(dāng)miR-21表達(dá)升高可降低PTEN的表達(dá)，使得PTEN/AKT信號通路持續(xù)活化，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，減少凋亡。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21在苦參堿抗凋亡過程中隨苦參堿作用濃度的增加而表達(dá)增加。由此課題組猜想，降低miR-21的表達(dá)，能否增加苦參堿的抗凋亡作用呢？Annexin V/ PI流式結(jié)果表明，當(dāng)降低HepG2細(xì)胞中miR-21的量時，與對照組相比，苦參堿抗凋亡的作用增強(qiáng)。

細(xì)胞凋亡是基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡過程。它涉及一系列基因的激活、表達(dá)和調(diào)控，尤其是對促凋亡基因和抑凋亡基因的調(diào)控。Bax是最常見的促凋亡基因，Bcl-2是最常見的抑凋亡基因，Bcl-2/Bax比率是啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”[17]。亦有研究表明Bcl-2是miR-21的一個靶基因[18]，因此本實驗選用它們作為細(xì)胞凋亡機(jī)制的初步研究。RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果表明miR-21低表達(dá)后，可促進(jìn)苦參堿作用組中Bax mRNA和蛋白水平的表達(dá)，而抑制Bcl-2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)?？梢娂?xì)胞中miR-21表達(dá)降低，可增加苦參堿誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡作用。

目前，miRNA在中藥抗腫瘤中的作用研究較少，miRNA在其中的調(diào)控機(jī)制亦不是很清楚。本課題的初步研究發(fā)現(xiàn)，miR-21參與了苦參堿抗腫瘤凋亡過程，過表達(dá)miR-21可抑制凋亡，而降低miR-21的表達(dá)則可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過本實驗，將為中藥的miRNA調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)，同時也為中藥與miRNA聯(lián)合治療提供實驗依據(jù)。

[1] 張思維， 鄭榮壽， 李 霓， 等. 中國肝癌發(fā)病的趨勢分析和預(yù)測[J]. 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 46(7):587-592.

[2] Zhou H, Xu MY, Gao Y, et al. Matrine induces caspase-independent program cell death in hepatocellular carcinoma through Bid-mediated nuclear translocation of apoptosis inducing factor[J]. Mol Cancer, 2014, 13:59.

[3] 朱丹丹， 姚樹坤， 閆建國， 等. 苦參堿對人類肝癌細(xì)胞 HepG2 增殖, 細(xì)胞周期及凋亡的影響[J]. 腫瘤研究與臨床, 2010, 22(11):745-747.

[4] Callegari E, Gramantieri L, Domenicali M, et al. MicroRNAs in liver cancer: a model for investigating pathogenesis and novel therapeutic approaches[J]. Cell Death Differ, 2015, 22(1):46-57.

[5] Zhang W, Bai W, Zhang W, et al. MiR-21 suppresses the anticancer activities of curcumin by targeting PTEN gene in human non-small cell lung cancer A549 cells[J]. Clin Transl Oncol, 2014, 16(8):708-713.

[6] Catuogno S, Cerchia L, Romano G, et al. miR 34c may protect lung cancer cells from paclitaxel-induced apoptosis[J]. Oncogene, 2012, 32(3):341-351.

[7] Gjorgieva D, Zaidman N, Bosnakovski D. Mesenchymal stem cells for anti-cancer drug delivery[J]. Recent Pat Anticancer Drug Discov, 2013, 8(3):310-318.

[8] Sawada Y, Yoshikawa T, Shimomura M, et al. Programmed death-1 blockade enhances the antitumor effects of peptide vaccine-induced peptide-specific cytotoxic T lymphocytes[J]. Int J Oncol, 2015, 46(1):28-36.

[9] Kim HS, Lee KS, Bae HJ, et al. MicroRNA-31 functions as a tumor suppressor by regulating cell cycle and epithe-lial-mesenchymal transition regulatory proteins inliver cancer[J]. Oncotarget, 2015, 6(10):8089-8102.

[10]胡建軍， 鄭華榮， 鄭耀紅. miR-363下調(diào)HepG2細(xì)胞Mcl-1蛋白的表達(dá)并誘導(dǎo)其凋亡[J]. 中國病理生理雜志, 2015, 31(7):1329-1333.

[11]陳 穎， 茅蕾蕾， 胡碧原， 等. 銀杏外種皮提取物聯(lián)合順鉑對S180荷瘤小鼠抗腫瘤增效減毒作用[J]. 中國新藥雜志, 2014, 23(13):1569-1573.

[12]Emadi A, Jones RJ, Brodsky RA. Cyclophosphamide and cancer: golden anniversary[J]. Nat Rev Clin Oncol, 2009, 6(11):638-647.

[13]海廣范， 牛秉軒， 李品品， 等. Nodosin對HepG2細(xì)胞株的增殖抑制作用及對Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(10):1879-1882.

[14]Tong AW, Nemunaitis J. Modulation of miRNA activity in human cancer: a new paradigm for cancer gene therapy[J]. Cancer Gene Ther, 2008, 15(6):341-355.

[15]Xu LF, Wu ZP, Chen Y, et al. MicroRNA-21 (miR-21) regulates cellular proliferation, invasion, migration, and apoptosis by targeting PTEN, RECK and Bcl-2 in lung squamous carcinoma, Gejiu city, China[J]. PLoS One, 2014, 9(8):e103698.

[16]Li X, Xin S, He Z, et al. MicroRNA-21 (miR-21) post-transcriptionally downregulates tumor suppressor PDCD4 and promotes cell transformation, proliferation, and metastasis in renal cell carcinoma[J]. Cell Physiol Biochem, 2014, 33(6):1631-1642.

[17]王衛(wèi)東， 陳正堂. Bcl-2/Bax比率與細(xì)胞“命運”[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2007, 14(4):393-396.

[18]Buscaglia LE, Li Y. Apotosis and the target genes of microRNA-21[J]. Chin J Cancer, 2011, 30(6):371-380.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of low expression of miR-21 on apoptosis of HepG2 cells induced by matrine

LUO Yao-ling1, HUANG You-xin2, LAI Ping3, ZHANG Min-hong1

(1ResearchCenterofClinicalMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,2DepartmentofNuclearMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofGannanMedicalUniversity,3GannanMedicalUniversity,Ganzhou341000,China.E-mail: 15970794928@163.com)

AIM: To explore whether miR-21 low expression enhances the effect of matrine (MAT) on the apoptosis of hepatocellular carcinoma cells.METHODS: Real-time fluorescence quantitative PCR (RT-qPCR) was used to detect the expression of miR-21 in the HepG2 cells treated with different concentrations of MAT. The effect of miR-21 on MAT-induced HepG2 cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The mRNA and protein expression of Bcl-2 and Bax in the HepG2 cells treated with MAT was determined by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: The expression of miR-21 increased with the increasing concentration of MAT. Low expression of miR-21 promoted MAT-induced apoptosis, and enhanced the expression of Bax at mRNA and protein levels (P<0.05), while inhibited the expression of Bcl-2 at mRNA and protein levels (P<0.05). CONCLUSION: Low expression of miR-21 enhances MAT-induced HepG2 cell apoptosis by inhibiting the expression of Bcl-2 and promoting Bax expression.

miR-21; Matrine; HepG2 cells; Apoptosis

1000- 4718(2017)02- 0284- 05

2016- 09- 12

2016- 11- 05

贛南醫(yī)學(xué)院校級課題 (No. YB201402)

R730.20； R730.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.015

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△通訊作者 Tel： 0797-8283981； E-mail: 15970794928@163.com