補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎單核巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控作用*

田倩倩， 李艷花， 尉杰忠， 王曉慶， 張紅珍， 劉建春， 郭文娟， 劉春云， 楊春彥， 肖保國(guó)， 馬存根, △

(1山西中醫(yī)學(xué)院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西 太原 030024； 2大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009； 3復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025)

補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎單核巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控作用*

田倩倩1， 李艷花2， 尉杰忠2， 王曉慶1， 張紅珍1， 劉建春1， 郭文娟1， 劉春云2， 楊春彥1， 肖保國(guó)3， 馬存根1, 2△

(1山西中醫(yī)學(xué)院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學(xué)研究中心，山西 太原 030024；2大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 037009；3復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 200025)

目的： 探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯(BYHWD)治療實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的有效性及對(duì)單核巨噬細(xì)胞免疫調(diào)控的作用及機(jī)制。方法: 雌性C57BL/6小鼠用小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55肽段(MOG35-55)免疫制作慢性EAE模型，隨機(jī)分為生理鹽水處理組和BYHWD組。在免疫后第3天開(kāi)始分別予以生理鹽水和BYHWD灌胃，500 μL/d，持續(xù)觀察臨床癥狀和體質(zhì)量變化。免疫后17 d各組統(tǒng)一處死部分動(dòng)物，HE染色觀察炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，髓鞘染色觀察脊髓髓鞘脫失比例，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞M1型和M2型巨噬細(xì)胞表型；免疫熒光組織化學(xué)染色和Western blotting檢測(cè)脊髓巨噬細(xì)胞iNOS、TNF-α、arginase及IL-10的表達(dá)。結(jié)果: BYHWD推遲EAE起病，減輕EAE癥狀，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)脊髓的炎性浸潤(rùn)和髓鞘脫失，促進(jìn)脊髓及脾組織中M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型。結(jié)論: BYHWD干預(yù)可緩解EAE行為學(xué)和病理學(xué)的改變，其作用機(jī)制可能與其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化相關(guān)。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯； 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎； 巨噬細(xì)胞

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)的慢性自身免疫炎癥性疾病，以腦白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)髓鞘脫失、軸突變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主要病理特征[1]。目前因有效性低、嚴(yán)重的慢性毒性以及較高的處理成本等毒副作用的影響，MS仍缺乏有效的治療方法[2]。中藥是多種天然藥物成分的復(fù)合體，以多靶點(diǎn)、多途徑、整體調(diào)節(jié)、協(xié)同作用強(qiáng)、毒副作用小為特點(diǎn)，能有效改善患者臨床癥狀，延緩疾病進(jìn)程，調(diào)節(jié)免疫功能，彌補(bǔ)西醫(yī)的不足[3]。

實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是目前國(guó)際公認(rèn)的研究MS的動(dòng)物模型。近年來(lái)，祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)MS及EAE進(jìn)行積極的理論與實(shí)踐探索認(rèn)為[4]，本虛標(biāo)實(shí)是本病的主要特征，肝腎陰虛、脾腎陽(yáng)虛為本虛,痰、血瘀、濕、熱合而為標(biāo)實(shí)。其中，氣虛血瘀證作為MS的常見(jiàn)證型之一，益氣活血能明顯改善臨床癥狀，降低致殘率，提高生活質(zhì)量。

補(bǔ)陽(yáng)還五湯(Buyang-Huanwu decoction，BYHWD)作為中醫(yī)臨床常用方劑，源自清代著名醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，由生黃芪4兩、當(dāng)歸尾2錢(qián)、赤芍1.5錢(qián)、川芎1錢(qián)、地龍1錢(qián)、桃仁1錢(qián)和紅花1錢(qián)組成，具有益氣養(yǎng)血、活血通絡(luò)之功效。藥理研究發(fā)現(xiàn)BYHWD可改善微循環(huán)、血液流變學(xué)和血流動(dòng)力學(xué)，抗炎抗氧化，調(diào)節(jié)免疫，還具有神經(jīng)保護(hù)作用[5]。本研究應(yīng)用BYHWD對(duì)EAE小鼠進(jìn)行干預(yù)，探討B(tài)YHWD對(duì)EAE小鼠單核巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8～10周齡C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自北京維通利華公司，經(jīng)山西大同大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)遵守國(guó)際動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)指導(dǎo)方針。實(shí)驗(yàn)前小鼠在無(wú)病原菌動(dòng)物房清潔級(jí)飼養(yǎng)(25 ℃左右)，12 h明暗交替，相對(duì)濕度40%～60%，自由飲食喂養(yǎng)1周。

2 實(shí)驗(yàn)藥物

藥物補(bǔ)陽(yáng)還五湯按王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》原方，由生黃芪120 g、當(dāng)歸尾6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、地龍3 g、桃仁3 g和紅花3 g組成。藥材購(gòu)自太原同仁堂藥店，并由山西中醫(yī)學(xué)院專(zhuān)家鑒定合格。以上藥物加水浸泡2 h，加10倍量水(約1 500 mL)，煎煮2次，第1次60 min，第2次30 min，過(guò)濾，2次濾液合并，靜置過(guò)夜；次日將藥液離心(1 500 r/min、5 min),取上清濃縮至80～100 mL，相當(dāng)于生藥2 kg/L，置冷，4 ℃冷藏備用。

3 主要試劑和儀器

小鼠髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白35-55肽段(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55，MOG35-55)由上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)購(gòu)自Alexis；完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)購(gòu)自Sigma；結(jié)核分枝桿菌(tuberculosis bacilli，TB)、Flour-488-CD11b、PE-CD16/32和PE-CD206購(gòu)自Becton Dickinson；β-actinⅠ抗購(gòu)自CST；CD68Ⅰ抗購(gòu)自eBioscience；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)購(gòu)自ENZO；精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1)購(gòu)自BD;腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)購(gòu)自PeproTech；白細(xì)胞介素10 (interleukin-10，IL-10)購(gòu)自eBioscience；HRP標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗小鼠、山羊抗大鼠Ⅱ抗及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。凝膠成像分析儀購(gòu)自Bio-Rad；熒光顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus；冰凍切片機(jī)購(gòu)自Leica；流式細(xì)胞儀為BD FACS Calibur產(chǎn)品。

4 主要方法

4.1 EAE模型建立及分組 42只8～10周齡雌性C57BL/6小鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表按平均體質(zhì)量隨機(jī)分為EAE對(duì)照組、補(bǔ)陽(yáng)還五湯組，每組各21只。MOG35-55溶解于生理鹽水中，百日咳毒素溶于完全弗氏佐劑；采用針管混合器將等體積2種溶液充分混合，制成油包水樣乳白色混懸液，靜置后無(wú)分層為合格。在脊柱背側(cè)中線兩側(cè)，分4點(diǎn)皮下注射(每只0.1 mL)。在免疫當(dāng)日和48 h后，各組小鼠每只分別每次腹腔注射PTX 300 ng。

4.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)所建動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù) EAE小鼠分為生理鹽水對(duì)照組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組。從免疫后第3天開(kāi)始灌胃給藥，EAE對(duì)照組予以生理鹽水，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組每只給予補(bǔ)陽(yáng)還五湯500 μL(按平均體重20 g計(jì)算，相當(dāng)于35.60～44.53 g/kg)。每日給藥1次，每組12只動(dòng)物持續(xù)給藥至免疫后28 d，9只動(dòng)物于免疫后第17天處死。

4.3 行為學(xué)觀察及標(biāo)本采集 給藥期間持續(xù)觀察動(dòng)物的癥狀與體質(zhì)量。采用國(guó)際通用的5分評(píng)分制對(duì)小鼠進(jìn)行臨床癥狀評(píng)分：無(wú)任何臨床癥狀為0分；尾部張力消失，可見(jiàn)輕度步態(tài)笨拙為1分；一側(cè)后下肢無(wú)力，被動(dòng)翻身后可以恢復(fù)為2分；雙后肢癱瘓，被動(dòng)翻身后不能恢復(fù)，但給予刺激后可以挪動(dòng)為3分；雙側(cè)后肢癱瘓伴前肢癱瘓為4分；瀕死狀態(tài)或死亡為5分。癥狀介于兩者評(píng)分之間者以±0.5分計(jì)。

免疫后17 d，采用0.3%戊巴比妥鈉每只0.2 mL腹腔注射麻醉后取脾臟，制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液；用生理鹽水進(jìn)行心臟灌注，至肝臟發(fā)白，各組5只動(dòng)物快速冰上解剖脊髓組織，勻漿后提取蛋白，定量后采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)iNOS、Arg-1、TNF-α和IL-10(抗體均以1∶1 000稀釋)的蛋白水平；各組其余4只動(dòng)物用4%多聚甲醛灌流進(jìn)行體內(nèi)組織固定，然后分離脊髓，OCT包埋劑包埋，于液氮中冷凍，做厚度為10 μm的冰凍切片，進(jìn)行髓鞘、HE及免疫組化染色。

4.4 髓鞘染色 取脊髓切片于95%乙醇中浸泡15 min，浸于Luxol固藍(lán)(Luxol fast blue, LFB)液中，57 ℃孵育24 h，于95%乙醇溶液浸洗10 min，去離子水浸洗5 min，0.05%碳酸鋰快速浸洗10 s，70%乙醇分化至灰質(zhì)與白質(zhì)能夠清晰辨別，去離子水浸洗5 min，梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹(shù)膠封片，光鏡下觀察。

4.5 HE染色 將脊髓切片水中浸泡2 min，蘇木精染色4 min，快速水洗，0.5%鹽酸乙醇分化15 s,0.5%伊紅30 s，快速水洗，梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹(shù)膠封片,光鏡下觀察。

4.6 免疫組化實(shí)驗(yàn) 脊髓的冰凍切片置于濕盒中1% PBS沖洗 5 min、3次；敷Ⅰ抗CD68、iNOS、Arg-1、TNF-α和IL-10(1∶1 000)后4 ℃過(guò)夜；1% PBS沖洗每次5 min×3次；敷育相對(duì)應(yīng)的熒光Ⅱ抗(1∶10 000)，避光放置2 h； 1% PBS沖洗3次；甘油封片，鏡檢。

4.7 Western blotting實(shí)驗(yàn) 用組織裂解液在4 ℃條件下充分裂解脊髓組織蛋白，并用BCA法測(cè)定蛋白含量。制備蛋白上樣緩沖液樣品，用10% SDS-PAGE分離蛋白。電泳完畢后，將分離好的蛋白凝膠用濕式轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜(穩(wěn)流220 mA，2 h)，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗iNOS、Arg-1、TNF-α、IL-10(1∶1 000)及抗β-actin(1∶10 000)的抗體，4 ℃過(guò)夜；次日洗滌后孵育相對(duì)應(yīng)的HRP偶聯(lián)Ⅱ抗(1∶10 000)室溫2 h。洗膜后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，用Bio-Rad凝膠成像分析儀檢測(cè)條帶，Image Lab 3.0軟件進(jìn)行灰度值比較，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

4.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾細(xì)胞的M1型和M2型巨噬細(xì)胞表型 小鼠脾細(xì)胞懸于50 μL 1% BSA-PBS緩沖液中，分別加1 μL Flour-488-CD11b、PE-CD16/32和PE-CD206抗體，室溫避光20 min。PBS洗2次各加500 μL PBS，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩兩比較使用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 BYHWD緩解EAE小鼠發(fā)病程度

8周齡C57BL/6小鼠被免疫后，在免疫后第3天給予BYHWD灌胃治療，臨床觀察癥狀評(píng)分及體重直到第28天。EAE對(duì)照組小鼠自免疫后第10天起逐步發(fā)病。觀察到小鼠精神萎靡不振、食欲減退、體重減輕及皮毛不光整，尾部及四肢肌力下降甚至出現(xiàn)癱瘓，臨床癥狀評(píng)分最高可達(dá)4.5分。與EAE對(duì)照組相比，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組起病時(shí)間明顯推遲(P<0.01)，臨床癥狀評(píng)分明顯降低,見(jiàn)圖1A。同時(shí)，隨著臨床癥狀評(píng)分的加重，EAE對(duì)照組小鼠的體重呈明顯下降趨勢(shì)，而補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療組小鼠體重下降不明顯，見(jiàn)圖1B。

Figure 1.BYHWD delayed the onset of EAE and attenuated the severity of EAE. A: clinical score; B: body weight. Mean±SD.n=21.**P<0.01vsEAE．

圖1 BYHWD緩解EAE小鼠臨床癥狀和體重丟失

2 BYHWD減少脊髓白質(zhì)髓鞘脫失

LFB染色顯示EAE對(duì)照組脊髓白質(zhì)出現(xiàn)大面積髓鞘脫失，而B(niǎo)YHWD組髓鞘脫失面積明顯減少。EAE對(duì)照組髓鞘脫失與白質(zhì)面積比值為(45.98±10.96)%，BYHWD組為(1.88±0.66)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The demyelination in the spinal cord of the mice in EAE group and BYHWD group with Luxol fast blue staining. The pixel area (%) of demyelination in white matter was calculated by Image-Pro Plus software. 1: the demyelinating area of spinal cord in EAE group; 2: the demyelinating area of spinal cord in BYHWD group. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsEAE group．

圖2 EAE組和BYHWD組小鼠的脊髓脫髓鞘

3 BYHWD抑制脊髓組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)

大量巨噬細(xì)胞侵入中樞在EAE和MS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色，因此，本課題利用HE染色和CD68免疫熒光染色分析了脊髓組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。結(jié)果顯示：臨床癥狀較重的EAE對(duì)照小鼠脊髓白質(zhì)區(qū)呈現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，尤以腰膨大處炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯，HE染色結(jié)果顯示EAE對(duì)照組脊髓白質(zhì)區(qū)炎性浸潤(rùn)細(xì)胞占整個(gè)脊髓面積的比值為(1.43±0.46)%，BYHWD組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，僅為(0.45±0.43)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；與脊髓HE染色一致，免疫熒光染色EAE對(duì)照組脊髓白質(zhì)區(qū)域CD68+巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，而B(niǎo)YHWD明顯抑制CD68+巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

4 BYHWD促進(jìn)脊髓組織中M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型

巨噬細(xì)胞按照其表型和分泌的細(xì)胞因子功能可分為以分泌促炎因子為主、發(fā)揮促炎功能的M1型巨噬細(xì)胞及以降低炎性反應(yīng)、促進(jìn)組織修復(fù)為主的M2型巨噬細(xì)胞。免疫組化結(jié)果顯示，M1型巨噬細(xì)胞促炎因子iNOS和TNF-α在EAE組脊髓白質(zhì)區(qū)浸潤(rùn)明顯，成大片點(diǎn)狀分布；而在BYHWD組僅有零星陽(yáng)性浸潤(rùn)，與對(duì)照組相比數(shù)量明顯減少(P<0.05)。Arg-1和IL-10作為M2型巨噬細(xì)胞抑炎因子，它們的表達(dá)在BYHWD治療組的陽(yáng)性分布比較密集，與EAE對(duì)照組比較具有明顯差異(P<0.05)。脊髓Western blotting實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與免疫組化結(jié)果相一致，見(jiàn)圖4。

5 BYHWD使脾臟組織中巨噬細(xì)胞從M1型轉(zhuǎn)化為M2型

脾臟作為全身最大的外周免疫器官，是參與免疫反應(yīng)的重要基地。流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明，與EAE組相比，BYHWD也可抑制脾臟M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD16/32的表達(dá)(P<0.05)，使脾臟M2型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD206表達(dá)呈增高趨勢(shì)(P<0.05)；BYHWD組CD16/32與CD206表達(dá)比值明顯低于EAE對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)。同時(shí)對(duì)冰凍脾組織切片行免疫組化染色，結(jié)果顯示與脊髓組織染色結(jié)果一致，EAE小鼠經(jīng)BYHWD治療后，可顯著抑制iNOS的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)Arg-1的表達(dá)(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 3.BYHWD inhibited macrophage infiltration in spinal cord of EAE mice. A: HE staining, a number of inflammatory cells in whole spinal cord were calculated by Image-Pro Plus software; 1: posterior root of spinal cord; 2: lateral region of the white matter of the spinal cord. B: the expression of CD68 in the spinal cord of the mice in EAE group and BYHWD group. The number of CD68+cells in whole spinal cord were calculated by Image-Pro Plus software. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsEAE group.

圖3 BYHWD抑制EAE小鼠脊髓組織中巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)

討 論

BYHWD是清代王清任所創(chuàng)氣虛血瘀理論的代表方劑，出自《醫(yī)林改錯(cuò)·卷下·癱痿論》[6]，方中重用生黃芪四兩為君藥補(bǔ)氣扶正以固本，桃仁、紅花各一錢(qián)、赤芍一錢(qián)半兼顧血瘀，歸尾二錢(qián)、川芎一錢(qián)養(yǎng)血行氣而不傷正，針對(duì)久病入絡(luò)加用地龍搜剔通絡(luò)[7]。藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，其有效成分黃芪甲苷、阿魏酸、芍藥苷、紅花黃色素、川芎嗪等[8]，具有抗炎抑炎、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)等作用[9-10]。

MS 是由髓鞘特異性CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)的、發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)的慢性炎性脫髓鞘自身免疫性疾病，臨床上以“萎證”居多。其確切病因尚不清楚，目前比較公認(rèn)的是在髓鞘的自身免疫、感染性因子、性別、環(huán)境因素和遺傳背景等多種因素作用下，自身免疫系統(tǒng)對(duì)CNS 進(jìn)行攻擊，導(dǎo)致髓鞘破壞，繼而造成對(duì)運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、視覺(jué)等的損傷[11]。由本文結(jié)果可以看出，BYHWD 的治療可以降低EAE 疾病的嚴(yán)重程度，延遲EAE 小鼠的發(fā)病時(shí)間；病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，BYHWD 治療后能夠顯著抑制脊髓白質(zhì)髓鞘脫失，促進(jìn)髓鞘再生。這顯示了BYHWD治療EAE 的良好效果。

巨噬細(xì)胞與EAE的發(fā)展有密切關(guān)系，它有抗原提呈能力，能分泌炎性細(xì)胞因子，參與髓鞘脫失和軸突的損傷。在已有的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，在EAE的發(fā)生發(fā)展中，巨噬細(xì)胞具有關(guān)鍵作用[12]。

巨噬細(xì)胞根據(jù)其功能分化為致炎性的M1 型巨噬細(xì)胞和抗炎性的M2 型巨噬細(xì)胞[13]。M1 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志有CD16/32、CD40、IL-12、iNOS 等，M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志為CD206、IL-10、Arg-1、CD14、CD23等[14-15]。M1/M2型巨噬細(xì)胞的平衡是炎性反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[16]。研究證實(shí)，M1/M2的失衡在EAE發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，表現(xiàn)為M1細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)介導(dǎo)炎性免疫反應(yīng)。如果抑制M1細(xì)胞，降低促炎細(xì)胞因子的分泌，或者促進(jìn)M2細(xì)胞的分化，則能緩解EAE發(fā)病嚴(yán)重程度[15]。TNF-α作為重要的細(xì)胞炎性因子在EAE 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，其升高水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[17]。在EAE 動(dòng)物模型中TNF-α表達(dá)增加，可以加重EAE的炎癥反應(yīng)癥狀，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致。郭小彬等[18]通過(guò)測(cè)定實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清TNF-α的表達(dá)，顯示EAE 癥狀隨著血清TNF-α的表達(dá)的增高而逐漸加重。在楊春彥等[19]、章培軍等[20]的實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)，在EAE的發(fā)展過(guò)程中，通過(guò)藥物可抑制促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的釋放，同時(shí)促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)來(lái)緩解臨床癥狀。這些均預(yù)示著巨噬細(xì)胞的極性轉(zhuǎn)化在EAE發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用。

Figure 4.BYHWD promoted the polarization of M1 macrophages into M2 in spinal cord tissue of EAE mice. The expression of iNOS, Arg-1, TNF-α and IL-10 in the spinal cord of EAE group and BYHWD group was measured by immunofluorescence (A, ×20) and Western blotting (B). Mean±SD.n=4～5.*P<0.05vsEAE group.

圖4 BYHWD促進(jìn)脊髓組織中M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型

我們之前的一系列研究也表明fasudil作為治療EAE的有效藥物之一，體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)可直接促進(jìn)M1炎癥型巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化[21]，并且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了其可使表達(dá)高氧化應(yīng)激產(chǎn)物和促炎癥因子的M1型巨噬細(xì)胞向抑制免疫炎癥反應(yīng)和促進(jìn)組織修復(fù)作用的M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化[22]。我們對(duì)新合成藥物WAR5的研究也發(fā)現(xiàn)，WAR5化合物與fasudil的作用機(jī)制具有相似性，即可誘導(dǎo)M1炎癥型巨噬細(xì)胞向M2抗炎型巨噬細(xì)胞分化[23]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)BYHWD干預(yù)EAE結(jié)果顯示其可抑制巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的iNOS、TNF-α及CD16/32，而增加抗炎型M2細(xì)胞Arg-1、IL-10和CD206的表達(dá)。這種細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化，可以顯著改善組織內(nèi)的炎癥微環(huán)境，減少對(duì)神經(jīng)組織的損傷，進(jìn)而改善臨床療效[24-25]。

Figure 5. BYHWD promoted the polarization of M1 macrophages into M2 in the spleen of EAE mice. A: the cells were stained with macrophage marker CD11b and M1/M2 markers， and the polarization of M1/M2 was analyzed using flow cytometry. Representative dot plots from 1 of 3 experiments with the similar results are showed. The results are expressed as the percentage of double positive cells in four-quadrant diagram. B: the expression of iNOS and Arg-1 in the spleen of the mice in EAE group and BYHWD group was measured by immunofluorescence. Mean±SD.n=4～5.*P<0.05vsEAE group.

圖5 BYHWD使脾臟組織中巨噬細(xì)胞從M1型轉(zhuǎn)化為M2型

綜上所述，BYHWD治療EAE可明顯改善臨床癥狀、抑制炎癥反應(yīng)，可能與其誘導(dǎo)炎癥性M1型巨噬細(xì)胞向抗炎性的M2表型轉(zhuǎn)化、從而抑制中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)有關(guān)。這也為MS的干預(yù)治療提供了新的途徑。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Immunoregulatory effect of Buyang-Huanwu decoction on monocyte-macrophages in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis

TIAN Qian-qian1, LI Yan-hua2,YU Jie-zhong2, WANG Xiao-qing1, ZHANG Hong-zhen1, LIU Jian-chun1, GUO Wen-juan1, LIU Chun-yun2, YANG Chun-yan1, XIAO Bao-guo3, MA Cun-gen1, 2

(1“2011”CollaborativeInnovationCenter/ResearchCenterofNeurobiology,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,China;2InstituteofBrainScience,DatongUniversity,Datong037009,China;3InstituteofNeurology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200025,China.E-mail:macungen2001@163.com)

AIM: To explore the therapeutic effect of Buyang-Huanwu decoction (BYHWD) on experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) and its immunoregulatory effect on monocyte-macrophages. METHODS: Chronic EAE was induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide fragment 35-55 (MOG35-55) in the female C57BL/6 mice, which were randomly divided into saline group and BYHWD group. On day 3 after immunization, the mice in BYHWD group were orally administrated with BYHWD, while normal saline was given to the control mice. The clinical score and body mass were recorded every other day. At day 17 after immunization, the mice were sacrificed and spinal cords were obtained for HE staining and myelin staining. The M1 and M2 macrophage phenotypes of splenic cells were detected by flow cytometry and immunofluorescence staining. The protein expression of iNOS, TNF-α, arginase and IL-10 in the spinal cord macrophages was determined by Western blotting. RESULTS: BYHWD delayed the onset of EAE, reduced the clinical scores of EAE, inhibited the inflammatory cell infiltration and demyelination in the spinal cord, and promoted the conversion of M1 macrophages into M2 phenotype in the spinal cord and spleen. CONCLUSION: BYHWD intervention attenuates the behavioral and pathological changes in the EAE mice, and its mechanism may be related to the macrophage conversion.

Buyang-Huanwu decoction; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Macrophage

1000- 4718(2017)02- 0200- 08

2016- 06- 27

2016- 10- 19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81473577)；山西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 2013011052-4)；山西省國(guó)際科技合作項(xiàng)目(No. 2013081058)；山西省回國(guó)留學(xué)人員重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目(2014-重點(diǎn)7)；山西中醫(yī)學(xué)院“2011”培育計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2011PY-1)

R363； R392

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.02.002

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