穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A基因的肌萎縮側(cè)索硬化細(xì)胞模型的建立

李學(xué)松 王愛華 蘇全平 王 龍 陸玉成 于繼徐，4

(臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 臨沂 276000)

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A基因的肌萎縮側(cè)索硬化細(xì)胞模型的建立

李學(xué)松1王愛華2蘇全平3王 龍3陸玉成3于繼徐3，4

(臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 臨沂 276000)

目的 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A真核表達(dá)載體肌萎縮側(cè)索硬化細(xì)胞模型。方法 進(jìn)行NSC-34細(xì)胞的培養(yǎng)，利用脂質(zhì)體方法把已經(jīng)構(gòu)建好的pcDNA3.1(-)、hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)和hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至NSC-34細(xì)胞系中，再通過G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)hSOD1基因的NSC-34細(xì)胞系；以RT-PCR法鑒定轉(zhuǎn)染后hSOD1在NSC34細(xì)胞系中的表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 質(zhì)粒的細(xì)胞與正常NSC-34細(xì)胞相比，胞體變圓，突起減少，且軸突變短。而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)和hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的細(xì)胞較正常NSC-34細(xì)胞無明顯變化。RT-PCR法鑒定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)和hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的細(xì)胞中hSOD1基因表達(dá)為陽性，而正常NSC-34細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的對照組為陰性。結(jié)論 成功獲得可穩(wěn)定表達(dá)hSOD1-G93A基因的肌萎縮側(cè)索硬化細(xì)胞模型。

hSOD1-G93A基因；肌萎縮側(cè)索硬化；細(xì)胞模型

肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)以大腦運(yùn)動皮層、腦干運(yùn)動神經(jīng)核和脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元丟失為特征〔1～3〕。目前該病發(fā)病機(jī)制尚不明確。至今尚無有效的治療方法阻止該病的進(jìn)展，該病確診后平均生存3～5年〔4，5〕。因此，建立合適的疾病模型對于研究ALS的發(fā)病機(jī)制和治療方法具有重要的意義。研究表明，20%家族性ALS(fALS)和少數(shù)散發(fā)性ALS是由于銅/鋅超氧化物歧化酶(SOD1)基因突變所致〔6～8〕。SOD1是一種重要的氧自由基清除劑，可以保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷〔9〕。Rosen等〔10〕發(fā)現(xiàn)fALS與SOD1基因突變有關(guān)，SOD1-G93A基因是SOD1基因序列中第281位的G突變?yōu)镃，引起蛋白序列中第93位的甘氨酸(G)突變?yōu)楸彼?A)。我們前期已經(jīng)應(yīng)用重疊區(qū)擴(kuò)增基因拼接法構(gòu)建含點(diǎn)突變的hSOD1-G93A基因的真核表達(dá)載體〔11〕。本研究建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 真核表達(dá)載體的ALS細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 鼠運(yùn)動元樣細(xì)胞系(NSC-34)由河北醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)病學(xué)實(shí)驗(yàn)室惠贈；pcDNA3.1(-)、hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)、hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒和DH5α本實(shí)驗(yàn)室保存；綠色體系和反轉(zhuǎn)試劑盒購自美國Fermentas公司；限制性內(nèi)切酶購自美國NEB公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000、Trizol試劑和G418購自美國Invitrogen公司；cDNA第一鏈合成試劑盒(Fermentas)；DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；SMI-32一抗購自美國Covance公司；免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 NSC-34細(xì)胞的培養(yǎng) 將NSC-34細(xì)胞從液氮中取出，置于37℃水浴箱中迅速融化，然后轉(zhuǎn)移至離心管中，加入5 ml含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，混勻，接種于25 cm2玻璃培養(yǎng)瓶中。將培養(yǎng)瓶蓋旋至半松狀態(tài)，置于37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3天更換一次培養(yǎng)液。

1.3 NSC-34細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和篩選培養(yǎng) 將處于對數(shù)生長期的NSC-34細(xì)胞以每孔4×104密度接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h〔12〕。在細(xì)胞達(dá)到50%～70%融合時(shí)，用脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000介導(dǎo)pcDNA3.1(-)、hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)和hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSC-34細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前1 h先將細(xì)胞培養(yǎng)液更換成無血清DMEM培養(yǎng)液。然后準(zhǔn)備以下2種溶液，A液：4 mg質(zhì)粒DNA溶于150 ml無血清DMEM培養(yǎng)液中；B液：10 ml脂質(zhì)體溶于150 ml無血清DMEM培養(yǎng)液中。將A液與B液分別于室溫靜置5 min，混勻后再室溫孵育20 min，加入DMEM培養(yǎng)液中。培養(yǎng)4～6 h后，更換為含血清DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，次日加入400 mg/L的G418進(jìn)行選擇培養(yǎng)，1 w后G418濃度降為200 mg/L維持篩選〔12〕。2 w后，分離陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，然后再用600 mg/L的G418持續(xù)篩選2 w，收集最終的陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，備用。

1.4 細(xì)胞免疫組化 將細(xì)胞消化、離心重懸后，按2×104/ml的密度將細(xì)胞接種于6孔板上進(jìn)行細(xì)胞爬片，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后取出，4%多聚甲醛固定40 min，1%TritonX-100浸透20 min，3%H2O2孵育10 min，然后滴加封閉血清工作液孵育15 min，阻斷非特異性染色，用稀釋好的一抗4℃過夜。次日加生物素標(biāo)記的IgG(1∶1 500)，37℃孵育15 min，鏈霉親和素-HRP工作液37℃孵育15 min，DAB顯色1～10 min，梯度酒精脫水、二甲苯透明、明膠樹脂封片。用PBS替代一抗作為陰性對照。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 RT-PCR法鑒定轉(zhuǎn)染hSOD1細(xì)胞的mRNA 應(yīng)用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞總RNA，取2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。cDNA第一鏈的合成是根據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒說明書推薦步驟操作完成，產(chǎn)物于-20℃保存。采用25 μl的PCR擴(kuò)增體系，包括：綠色體系12.5 μl、上下游引物各0.5 μl、樣本cDNA模板0.5 μl和無菌超純水10.5 μl。人SOD1(hSOD1)引物序列：上游5′-CGTTTAAACGGGCCCTCTAGAGCCGCCACCATGGCGACG AAGGCCGTGTGCG-3′，下游5′-CAGCGGTTTAAACTTAAGCTTTTAGTGATGGTGGTGATGGTG-3′。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃30 s，循環(huán)30次，72℃延伸10 min，4℃終止。鼠SOD1引物序列：上游5′-ATCGGCAGGGAACCATCCACTT-3′，下游5′-ATCGTGCCCAGGTCTCCAACAT-3′。反應(yīng)條件為：預(yù)變性94℃ 5 min；進(jìn)入循環(huán)94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min，循環(huán)30次，72℃延伸10 min，4℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴(kuò)增出目的基因片段，每個(gè)樣本重復(fù)3遍。

2 結(jié) 果

2.1 NSC-34細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選后細(xì)胞形態(tài)學(xué) 轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 質(zhì)粒的細(xì)胞與正常NSC-34細(xì)胞相比，胞體變圓，突起減少，且軸突變短。而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(-)和hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的細(xì)胞較正常NSC-34細(xì)胞無明顯變化。見圖1。

Normal：正常NSC-34細(xì)胞；Empty：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)的NSC-34細(xì)胞；hSOD1-WT：轉(zhuǎn)染hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞；hSOD1-G93A：轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞圖1 NSC-34細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選后細(xì)胞形態(tài)學(xué)(×200)

2.2 RT-PCR鑒定結(jié)果 應(yīng)用人SOD1(hSOD1)引物進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示正常細(xì)胞組和轉(zhuǎn)染空載體細(xì)胞組未見陽性條帶，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)和hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞組可見陽性條帶(圖2)。應(yīng)用鼠SOD1(mSOD1)引物進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示四組都出現(xiàn)了mSOD1基因的陽性條帶(圖2)。因此可以證明hSOD1基因成功轉(zhuǎn)入NSC3-4細(xì)胞系中。

M：DNA2 000 bp ladder Marker；1：正常NSC-34細(xì)胞；2：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3.1(-)的NSC-34細(xì)胞；3：轉(zhuǎn)染hSOD1-WT-pcDNA3.1(-)質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞；4：轉(zhuǎn)染hSOD1-G93A-pcDNA3.1(-) 質(zhì)粒的NSC-34細(xì)胞，下圖同圖2 hSOD1及mSOD1引物RT-PCR結(jié)果

3 討 論

目前ALS發(fā)病機(jī)制尚不明確，并且無有效的治療方法，因此建立良好的疾病模型對于本病的研究具有重要的意義。在許多ALS家系中發(fā)現(xiàn)SOD1基因突變〔13〕，約20%的 ALS與SOD1基因突變有關(guān)〔6～8〕。研究發(fā)現(xiàn)在ALS腦脊液和組織中氧自由基和異常自由基代謝產(chǎn)物增多，推測由于SOD1基因突變將導(dǎo)致抗氧化能力喪失，機(jī)體對自由基解毒能力下降〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)在SOD1突變的動物脊髓中，抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合有突變SOD1陽性的成分，而在肝臟中則未發(fā)現(xiàn)類似的表現(xiàn)，提示突變的SOD1可能通過促進(jìn)凋亡導(dǎo)致運(yùn)動神經(jīng)元死亡〔15〕。突變產(chǎn)生的SOD1蛋白具有獲得性毒性功能，損傷神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，加劇細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)，SOD1基因突變產(chǎn)生的SOD1蛋白異常折疊而形成蛋白質(zhì)的異常聚集可能啟動ALS的發(fā)生〔16，17〕。NSC-34細(xì)胞是一種雜交細(xì)胞系，由富有運(yùn)動神經(jīng)元的胎鼠脊髓細(xì)胞和小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞融合而成。NSC-34細(xì)胞具有許多運(yùn)動神經(jīng)元特性，例如具有膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶性質(zhì)，具有乙酰膽堿合成特性，具有貯存和釋放神經(jīng)纖絲三聯(lián)體蛋白質(zhì)的特性。因此，NSC-34細(xì)胞作為運(yùn)動神經(jīng)元樣細(xì)胞多用于研究神經(jīng)毒性方面的模型。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)熟練培養(yǎng)和貯存NSC-34細(xì)胞系。

本研究顯示hSOD1基因成功轉(zhuǎn)入NSC3-4細(xì)胞系中，從而獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hSOD1基因的ALS細(xì)胞模型。細(xì)胞模型干擾因素較少，對于研究疾病的發(fā)病機(jī)制，以及藥物作用機(jī)制具有較大的優(yōu)勢。本研究成功獲得了可穩(wěn)定表達(dá)人SOD1基因的NSC34細(xì)胞系，為進(jìn)一步系統(tǒng)研究ALS發(fā)病機(jī)制和治療方法奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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〔2015-09-25修回〕

(編輯 曹夢園)

山東省自然科學(xué)基金(ZR2010HM041)；山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目專項(xiàng)資金(201102004)

于繼徐(1974-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)變性病研究。

李學(xué)松(1967-)，男，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事腦血管病、神經(jīng)系統(tǒng)變性病等。

R741.02

A

1005-9202(2017)03-0569-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.019

1 臨沂衛(wèi)生學(xué)校 2 臨沂市人民醫(yī)院消化內(nèi)科

3 臨沂市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室 4 臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科