晚期氧化蛋白終產(chǎn)物對破骨細胞分化的影響

莊景燊 朱思遠 黃玉圣 徐 平 陳建庭 鐘招明

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510515)

·基礎研究·

晚期氧化蛋白終產(chǎn)物對破骨細胞分化的影響

莊景燊 朱思遠 黃玉圣 徐 平 陳建庭 鐘招明

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院脊柱骨科，廣東 廣州 510515)

目的 探討晚期氧化蛋白終產(chǎn)物(AOPPs)對破骨細胞分化的影響。方法 體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓單核細胞，分為空白對照組、陰性對照組(RSA)、AOPPs組、陽性對照組(RANKL)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制劑組(AOPPs+夾竹桃麻素)，干預6 d后，通過抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色觀察TRAP陽性多核細胞，鬼筆環(huán)肽熒光染色觀察F肌動蛋白(F-actin)環(huán)，甲苯胺藍染色觀察骨磨片的骨吸收陷窩。此外，AOPPs刺激2 h后，通過DCFH-DA熒光探針法檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)生成。結(jié)果 AOPPs 及陽性對照組RANKL 均可誘導TRAP陽性多核細胞、F-actin環(huán)及骨吸收陷窩形成，并且AOPPs刺激后細胞ROS生成明顯增多。AOPPs所致以上效應均能被NADPH氧化酶抑制劑夾竹桃麻素阻斷。結(jié)論 AOPPs可誘導大鼠骨髓單核細胞向破骨細胞分化。

晚期氧化蛋白終產(chǎn)物；骨髓單核細胞；破骨細胞；分化

晚期氧化蛋白終產(chǎn)物(AOPPs)是體內(nèi)蛋白質(zhì)在氧化應激狀態(tài)下生成的一類雙酪氨酸蛋白質(zhì)交聯(lián)物〔1〕，不但是氧化應激的重要標志物，而且參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展〔2，3〕。前期研究發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者體內(nèi)AOPPs升高，血清AOPPs蓄積水平與腰椎骨密度呈負相關(guān)關(guān)系〔4〕；大鼠體內(nèi) AOPPs 蓄積水平與增齡性骨量丟失呈負相關(guān)關(guān)系〔5〕；AOPPs體內(nèi)干預可加速老齡大鼠骨量丟失、骨微結(jié)構(gòu)退化，增強氧化應激水平〔6〕；AOPPs體外干預可抑制成骨樣細胞增殖、降低成骨分化活性〔7〕。這些研究表明AOPPs可能是一類新的致病介質(zhì)，參與骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展。破骨細胞分化增加及骨吸收功能增強，易導致骨量丟失增加、加速骨代謝失衡。本研究擬通過體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓單核細胞，并用AOPPs刺激，觀察AOPPs對其向破骨細胞分化的影響，以期進一步闡明AOPPs在骨質(zhì)疏松中的致病機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大鼠血清白蛋白(RSA，Sigma)；次氯酸鈉(分析純,PanEra LifeScience)；冰醋酸(分析純，天津富宇精細化工有限公司)；氯胺-T(Sigma);2',7'-二氫二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA熒光探針，Sigma)；重組大鼠RANKL蛋白(RANKL，Abcam)；巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF,PeproTech)；胎牛血清(FBS，Sigma)；夾竹桃麻素(Apocynin，Sigma)；大鼠淋巴細胞分離液(Panera)；骨磨片(南方醫(yī)院骨與軟骨再生醫(yī)學實驗室饋贈)；激光共聚焦顯微鏡(日本歐林巴斯光學工業(yè)株式會社，F(xiàn)V10i)；酶標儀(美國MDS公司，M5)；倒置顯微鏡(德國Leica儀器股份有限公司，DM IL LED)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓單核細胞培養(yǎng) 取雄性4周齡SD大鼠，無菌條件下取出大鼠雙側(cè)股骨和脛骨；超凈臺中剔除骨組織周圍的軟組織，剪開干骺端，用5 ml無菌注射器抽取無血清α-MEM培養(yǎng)液反復柔沖骨髓腔4次，收集沖洗液以450 r/min離心15 min，棄上清，以80% 標準FBS α-MEM培養(yǎng)液懸浮沉淀，制成細胞濃度為 2×108～1×109/ml的單細胞懸液備用。先加入與骨髓單細胞懸液等量的分離液，用移液槍小心吸取骨髓單細胞懸液樣本加于分離液液面上，注意保持二者分界液面平穩(wěn)，450 r/min離心25 min。離心后，用移液槍小心吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細胞層到另一15 ml離心管中，向離心管中加入10 ml清洗液，輕柔混勻，250 r/min離心10 min。棄上清，重復清洗步驟2次。用含體積分數(shù)10%FBS、50 ng/ml M-CSF 的α-MEM培養(yǎng)液10 ml重懸單核細胞后接種于100 mm培養(yǎng)皿。

1.2.2 骨髓單核細胞鑒定 接種后3 d的原代骨髓單核細胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化下來，計數(shù)調(diào)整細胞密度為106個/ml，離心以去除培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細胞2次后加入100 μl PBS重懸，并標記為1、2管。1管為陰性對照，2管加入2 μl CD14直標熒光抗體，冰上靜置反應30 min。離心后加入PBS清洗1次，每管加入400 μl的2%多聚甲醛，轉(zhuǎn)移到流式管后上機檢測。

1.2.3 AOPPs體外制備 根據(jù)前期報道的體外制備AOPPs的方法〔8〕，將RSA(20 mg/ml)與40 mmol/L的次氯酸等體積混合，室溫下放置反應30 min，制備出來的RSA與次氯酸摩爾比為1/70。制備的AOPPs在無內(nèi)毒素PBS 中透析24 h，以除去游離的次氯酸。用 0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后4℃保存。20 mg/ml RSA與PBS等體積混合，作為對照組。采用氯胺-T法測量制備的AOPPs濃度：AOPPs與PBS按1∶5稀釋，氯胺-T同法稀釋RSA與PBS混合物作空白對照，加入1.16 mmol/L碘化鉀(KI)10 ml及乙酸20 ml后立刻在340 nm處檢測吸收值，AOPPs濃度以氯胺-T含量表示(μg/ml)。

1.2.4 細胞干預條件 為了觀察AOPPs誘導破骨細胞分化的作用，取對數(shù)生長期骨髓單核細胞接種于96孔板中，4 000個細胞/孔。過夜預培養(yǎng)(37℃、5%CO2)后，分別設置為空白對照組，RSA組(100 μg/ml)，陽性對照組(RANKL，50 ng/ml)，AOPPs刺激組(100 μg/ml)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制劑組(AOPPs 100 μg/ml+夾竹桃麻素100 μmol/L)，每組設置3個復孔。每2 d換一次液，持續(xù)誘導6 d。

為了觀察AOPPs對細胞內(nèi)活性氧(ROS)生成的影響，取對數(shù)生長期骨髓單核細胞接種于96孔板中，4 000個細胞/孔。過夜預培養(yǎng)(37℃、5%CO2)后，分別設置空白對照組、RSA組(100 μg/ml)、AOPPs 50 μg/ml刺激組、AOPPs 100 μg/ml刺激組、AOPPs 150 μg/ml刺激組、NADPH氧化酶抑制劑組(AOPPs 100 μg/ml +夾竹桃麻素100 μmol/L)，每組設置3個復孔，刺激2 h后測量ROS生成。

1.2.5 抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色 TRAP是破骨細胞的特異性標志酶，TRAP染色是鑒定破骨細胞的常用方法之一〔8〕。TRAP染色液的配制：取0.5 ml快速石榴石型堿溶液與0.5 ml亞硝酸鹽溶液，輕輕混勻30 s，室溫靜置2 min。取預熱(37℃)去離子水45 ml，分別加入上述混合溶液，0.5 ml萘酚 AS-BI磷酸溶液(Naphthol AS-BI Phosphate Solution)，2.0 ml醋酸鹽溶液，1.0 ml酒石酸鹽溶液混合備用。

骨髓單核細胞被誘導6 d后，細胞經(jīng)PBS洗3次，加入4%多聚甲醛室溫固定30 min，棄多聚甲醛，預熱(37℃)去離子水洗細胞3遍。將配制好的TRAP染液加入細胞中，水浴(37℃)避光孵育60 min，去離子水徹底清洗后蘇木素復染2 min，堿性自來水沖洗至出現(xiàn)藍色的細胞核。TRAP染色陽性多核細胞為胞質(zhì)呈大量酒紅色顆粒，細胞大小不一，有許多細長的偽足樣突起，細胞形態(tài)呈油煎蛋形等多邊形，胞核多，細胞核>3個為破骨細胞。

1.2.6 羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色 F肌動蛋白(F-actin)環(huán)形成是成熟破骨細胞被激活發(fā)揮骨吸收功能的標志，羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色是判斷F-actin環(huán)形成的有效方法〔8〕。

取對數(shù)生長期骨髓單核細胞4×105個/皿接種于共聚焦皿中，誘導6 d后，棄培養(yǎng)基，預溫(37℃)PBS清洗細胞2次，5 min/次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗3次、10 min/次。5%Triton室溫透膜5 min，PBS清洗3次，10 min/次后每皿加入500 μl羅丹明-鬼筆環(huán)肽(Rhodamine Phalloidin) 室溫避光孵育30 min，PBS清洗3次，5 min/次。加500 μl DAPI染液染色10 min，PBS清洗3次，5 min/次，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.7 骨吸收染色 取對數(shù)生長期的骨髓單核細胞以4×104個/孔接種于預置骨磨片的48孔板中，過夜預培養(yǎng)(37℃、5%CO2)，待細胞貼壁后，設置空白對照組，RSA組(100 μg/ml)，陽性對照組(RANKL，50 ng/ml)，AOPPs刺激組(100 μg/ml)，NADPH氧化酶抑制劑組(AOPPs 100 μg/ml+夾竹桃麻素100 μmol/L)，每組設置3個復孔。誘導6 d后取出各組骨磨片，0.25%氫氧化銨超聲5 min/次×3次，經(jīng)梯度酒精(40%，70%，80%，90%，100%)脫水后自然晾干，預熱56℃ 0.5%甲苯胺藍染色10 min，去離子水清洗后光學顯微鏡下觀察骨吸收陷窩。

1.2.8 ROS生成檢測 取對數(shù)生長期骨髓單核細胞以4 000個/孔接種于96孔板中，過夜預培養(yǎng)(37℃、5%CO2)，待細胞貼壁后，分別設置空白對照組、RSA組(100 μg/ml)、AOPPs 50 μg/ml刺激組、AOPPs 100 μg/ml刺激組、AOPPs 150 μg/ml刺激組、NADPH氧化酶抑制劑組(AOPPs 100 μg/ml +夾竹桃麻素100 μmol/L)，預培養(yǎng)2 h，PBS輕柔徹底清洗細胞以除去牛血清，加入DCFH-DA熒光探針，37℃孵育30 min，用PBS清洗2次，熒光酶標儀激發(fā)光為488 nm，吸收光為525 nm檢測。

取對數(shù)生長期的骨髓單核細胞以4×105個/皿接種于共聚焦皿中，過夜預培養(yǎng)(37℃、5%CO2)，待細胞貼壁后，分別加入完全培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基+RSA，完全培養(yǎng)基+AOPPs，完全培養(yǎng)基+AOPPs+夾竹桃麻素，預培養(yǎng)2 h，PBS輕柔徹底清洗細胞以除去牛血清，加入DCFH-DA熒光探針，37℃30 min，用PBS清洗2次，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析和LSD法檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 骨髓單核細胞鑒定 CD14陽性細胞即為大鼠骨髓單核細胞，約占檢測細胞的50%。

2.2 AOPPs 誘導TRAP染色陽性多核細胞形成 誘導6 d后的骨髓單核細胞經(jīng)TRAP染色，倒置顯微鏡觀察，AOPPs組及RANKL陽性對照組均見TRAP染色陽性多核細胞形成，而空白對照組、RSA組及AOPPs +夾竹桃麻素組未見TRAP染色陽性多核細胞形成。見圖1。

2.3 AOPPs 誘導 F-actin環(huán)形成 誘導6 d后的骨髓單核細胞行羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察，AOPPs組及RANKL陽性對照組均見呈圓形或類圓形的F-actin環(huán)形成，而空白對照組、RSA組、AOPPs +夾竹桃麻素組中未見明顯的F-actin環(huán)。見圖2。

2.4 AOPPs增加骨吸收陷窩形成 骨吸收實驗表明，誘導6 d后，甲苯胺藍染色示RANKL組及AOPPs組的骨磨片上出現(xiàn)類圓形藍色骨吸收陷窩。相比之下，空白對照組、RSA組、AOPPs +夾竹桃麻素組中的骨磨片則無明顯骨吸收陷窩形成。見圖3。

圖1 AOPPs 誘導骨髓單核細胞向TRAP陽性多核細胞形成

圖2 AOPPs 誘導F-actin環(huán)形成(箭頭標示)

圖3 AOPPs增加骨吸收陷窩形成

2.5 AOPPs 增加ROS生成 予 50、100、150 μg/ml AOPPs 刺激骨髓單核細胞，顯示隨著劑量濃度的增加,細胞 ROS 的生成逐漸增加〔分別為(251.58±43.89)%，(297.35±4.59)%，(284.41±19.99)%〕,其中 100 μg/ml AOPP 產(chǎn)生的 ROS 濃度最高，且各濃度組與對照組〔(97.47±9.31)%〕之間差異顯著，加入夾竹桃麻素可明顯抑制 AOPPs誘導的 ROS 生成〔(112.64±16.52)%〕(P<0.05)。

在共聚焦顯微鏡中觀察AOPP 刺激骨髓單核細胞產(chǎn)生ROS量的變化，細胞質(zhì)中可見到綠色的熒光顆粒，即為ROS的表達，熒光強度越強，表明胞內(nèi)ROS表達越高。與空白對照組、RSA組相比，AOPPs組的熒光強度明顯較強，而夾竹桃麻素能有效地抑制AOPPs導致的這一效應。見圖4。

圖4 激光共聚焦分析AOPPs對骨髓單核細胞內(nèi)ROS生成的影響(×10)

3 討 論

AOPPs是體內(nèi)蛋白質(zhì)氧化修飾損傷的產(chǎn)物，也是氧化應激的重要標志物。在慢性腎臟疾病、肥胖、糖尿病、阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征等慢性疾病患者中，血清AOPPs水平升高〔9〕。研究證實AOPPs能激活細胞內(nèi)NADPH氧化酶，促使ROS生成，激活敏感的信號通道(如MAPK，NF-kappa B)，上調(diào)腫瘤壞死因子(TNF)-α 等炎癥因子表達〔10～13〕。因此，AOPPs是一類新型的致病介質(zhì)，可通過誘發(fā)氧化應激參與多種疾病的病理過程。

骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨的微結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣鳎瑢е鹿谴嘈栽黾尤菀装l(fā)生骨折的全身性骨病〔14〕。在病理條件下，骨吸收超過骨形成，骨代謝失去平衡，發(fā)生骨質(zhì)疏松。破骨細胞作為骨吸收的主要細胞，對于骨量的變化具重要作用〔15〕。破骨前體細胞的分化成熟和成熟破骨細胞的活化是骨吸收作用的前提，破骨細胞分化研究對骨質(zhì)疏松的機制探討及其防治具有重要意義。前期研究證實AOPPs與骨質(zhì)疏松存在相關(guān)性，并且可抑制成骨樣細胞增殖、降低成骨分化活性〔4～7〕，但是 AOPPs是否參與調(diào)控破骨細胞分化及活性尚不清楚。TRAP 為破骨細胞特異性的標志酶，在成熟破骨細胞和融合前單核細胞內(nèi)表達，在破骨細胞前體細胞內(nèi)不表達。既往研究證實RANKL是破骨細胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，可誘導破骨前體細胞(如骨髓單核細胞，外周血單核細胞，RAW264.7 細胞)向TRAP染色陽性細胞分化，即誘導破骨細胞形成〔16〕。本研究結(jié)果表明AOPPs可誘導破骨細胞分化。

破骨細胞進行骨吸收時，形成一個富含F(xiàn)-actin環(huán)的縫合區(qū)錨定在骨質(zhì)上，分泌質(zhì)子和蛋白酶，溶解和降解骨基質(zhì)〔17〕。因此，F(xiàn)-actin環(huán)形成是成熟破骨細胞被激活后發(fā)揮骨吸收活性的標志。F-actin環(huán)可以通過羅丹明-鬼筆環(huán)肽熒光染色顯示出來〔8〕。已證實AOPPs干預骨髓單核細胞可誘導F-actin環(huán)形成，這一效應與陽性對照RANKL組類似，而空白對照組及陰性對照組未發(fā)現(xiàn)F-actin環(huán)形成。為了進一步驗證AOPPs誘導破骨細胞分化及骨吸收活性，本研究檢測AOPPs誘導骨髓單核細胞向破骨細胞分化后骨吸收作用，實驗結(jié)果表明AOPPs能促進破骨細胞骨吸收功能，這一作用與RANKL組效應類似。因此，AOPPs可誘導骨髓單核細胞向破骨細胞分化成熟，并發(fā)揮骨吸收功能。

NADPH 氧化酶表達于大多數(shù)細胞，包括破骨前體細胞以及破骨細胞，是細胞內(nèi) ROS 產(chǎn)生的主要途徑之一〔18〕。NADPH氧化酶介導產(chǎn)生的ROS為破骨細胞分化過程必需的信號分子。本研究發(fā)現(xiàn)，AOPPs可促進骨髓單核細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，NADPH氧化酶抑制劑夾竹桃麻素顯著降低AOPPs誘導的ROS生成，說明NADPH氧化酶在該效應中發(fā)揮重要作用。夾竹桃麻素也能抑制AOPPs誘導的TRAP陽性細胞及F-actin環(huán)形成。以上實驗結(jié)果均表明，NADPH氧化酶介導產(chǎn)生的ROS可能在AOPPs誘導骨髓單核細胞向破骨細胞分化成熟中發(fā)揮重要作用?？傊?，AOPPs作為一類新型的致病介質(zhì)，能促進骨髓單核細胞內(nèi)ROS生成，誘導破骨細胞分化成熟，發(fā)揮骨吸收功能。這些發(fā)現(xiàn)為探索骨質(zhì)疏松的發(fā)生、發(fā)展機制提供了新的思路。

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〔2016-03-25修回〕

(編輯 袁左鳴)

Advanced oxidation protein products induced the osteoclast differentiation of rat bone marrow mononuclear cells in vitro

ZHUANG Jing-Shen，ZHU Si-Yuan，HUANG Yu-Sheng，etal.

Department of Orthopedic and Spinal Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong, China

Objective To evaluate the effect of advanced oxidation protein products (AOPPs) on osteoclast differentiation in vitro.Methods Rat bone marrow mononuclear cells were isolated and cultured in vitro, and divided into the blank control，negative control(RSA), positive control(RANKL), AOPPs, NADPH oxidase inhibitor groups (AOPPs+ Apocynin). After treatment for 6 days, the TRAP-positive multinuclear cells were observed by using tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining，the F-actin ring by phalloidine fluorescence staining，the bone resorption pits on bone slices by toluidine blue. Furthermore, intracellular reactive oxygen species (ROS) generation were detected by DCFH-DA fluorescent probe after AOPPs stimulation for 2 hours.Results The TRAP-positive multinuclear cells, F-actin ring and bone resorption pits on bone slices were observed in AOPPs and RANKL positive control groups. Meanwhile, AOPPs stimulation increased ROS generation. However,the above effects of AOPPs challenge were abolished by the apocynin, a NADPH oxidase inhibitor.Conclusions AOPPs could induce the osteoclast differentiation of rat bone marrow mononuclear cells in vitro, which provides a new sight in understanding the pathogenic basis of osteoporosis.

Advanced oxidation protein products; Bone marrow mononuclear cells; Osteocalst; Differentiation

國家自然科學基金項目(No.81000785,81472135)

鐘招明(1946-)，男，副教授，碩士生導師，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

莊景燊(1994-)，男，碩士，主要從事骨質(zhì)疏松研究。

R681

A

1005-9202(2017)03-0521-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.03.001