鐵對紫球藻生長及可溶性蛋白和胞外多糖含量的影響

谷兵+張達(dá)娟+王沂

摘要：通過研究不同鐵離子濃度條件下紫球藻的比生長率、主要葉綠素含量、可溶性蛋白及胞外多糖含量的變化情況，來闡述鐵離子對紫球藻生長的影響。結(jié)果表明，添加不同濃度的Fe3+對紫球藻的生長有明顯的促進(jìn)作用；Fe3+濃度在5×10-7～5×10-5 mol/L范圍內(nèi)時(shí)，紫球藻的生長和葉綠素a、β-胡蘿卜素、可溶性蛋白、胞外多糖的積累隨Fe3+濃度的升高而增加，當(dāng)Fe3+濃度為5×10-4 mol/L時(shí)，紫球藻的生長較為緩慢，其細(xì)胞密度略低于其他處理及對照組，且上述各指標(biāo)均與5×10-5 mol/L處理組之間無顯著差異。因此，紫球藻培養(yǎng)中鐵的最適添加濃度約為5×10-5 mol/L。

關(guān)鍵詞：紫球藻；鐵；可溶性蛋白；胞外多糖

中圖分類號(hào)： S968.43+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0159-04

鐵是浮游植物的微量營養(yǎng)元素和催化元素，是浮游植物生長的關(guān)鍵限制因子之一，影響著浮游植物的電子傳遞、氧的新陳代謝、氮的吸收利用、呼吸作用和光合作用[1]，且在海洋“生物泵”循環(huán)過程起著關(guān)鍵作用[2]。20世紀(jì)30年代初，研究學(xué)者提出鐵是海洋浮游植物生長的潛在性限制因子[3-6]。李麗研究了鐵離子對三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、小球藻CS-01（Chlorella sorokiniana CS-01）和等鞭金藻（Isocrydid galbana）生長和脂質(zhì)積累的影響，發(fā)現(xiàn)鐵對這3株微藻的生長和脂質(zhì)積累均有促進(jìn)作用，同時(shí)還比較研究了鐵、鎂、銅、鈣對小球藻生長和脂質(zhì)積累的影響，其中鐵離子的影響最為顯著[7]。王培磊等研究了鐵對鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）生長和β-胡蘿卜素積累的影響，結(jié)果表明，較高濃度的鐵有利于其β-胡蘿卜素的積累[1]。

紫球藻（Porphyridium cruentum）細(xì)胞呈圓形或卵圓形，外披黏質(zhì)的鞘膜，隸屬于紅藻門（Rhodophyta）原紅藻綱（Protofloridcophyceac）紫球藻目（Porphyridiales）紫球藻科（Porphyridiaceae）紫球藻屬（Porphyridium），是紅藻門中唯一的單細(xì)胞藻類，紫球藻廣泛分布于海水、淡水、咸水及潮濕的土壤中[8]。關(guān)于紫球藻的研究主要集中在培養(yǎng)工藝的優(yōu)化改良和多種生物活性物質(zhì)的開發(fā)利用方面[9]。已有相關(guān)文獻(xiàn)研究表明[10]，基于藻類的光合作用效率和生長潛能，1 hm2大小的土地理論上計(jì)算可以生產(chǎn)超過30 000 L，即200桶油的量，相當(dāng)于同樣土地上大豆產(chǎn)油量的100倍，而紫球藻生長快、繁殖周期短，且抗鹽性強(qiáng)，具廣闊的應(yīng)用前景及較大的潛在市場。本研究主要探討了不同濃度的鐵離子對紫球藻比生長率和葉綠素a、β-胡蘿卜素、可溶性蛋白、胞外多糖含量的影響，以期為進(jìn)一步探討紫球藻的培養(yǎng)條件以及生物活性物質(zhì)的提取提供有益參考。

目前，國內(nèi)外關(guān)于海藻多糖的研究主要集中在其組成、結(jié)構(gòu)分析、生理活性及藥理試驗(yàn)等方面，而對于影響或促進(jìn)海藻多糖合成和分泌的外界物理因子的研究相對比較少。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藻種

紫球藻藻種，由中國科學(xué)院水生生物研究所藻種庫提供。

1.2 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)采用f/2培養(yǎng)基，以自然光照為光源，光—暗周期為12 h—12 h，光照度為2 000～2 500 μmol/（m2·s），培養(yǎng)溫度為（27±2） ℃。設(shè)置對照組和4個(gè)處理組，處理組培養(yǎng)基中鐵離子濃度分別為5×10-7、5×10-6、5×10-5、5×10-4 mol/L，每組分別設(shè)置3個(gè)平行，按10%的量接種紫球藻液，試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)周期為14 d，每2 d取樣1次測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 各項(xiàng)指標(biāo)的測定及方法

1.3.1 紫球藻比生長率的測定 用血球計(jì)數(shù)板記錄紫球藻細(xì)胞數(shù)，每個(gè)重復(fù)均需要測定后取平均數(shù)。

相對生長率=ln（X2-X1）/（T2-T1）。

式中：X1和X2分別代表T1和T2時(shí)紫球藻細(xì)胞的濃度。

1.3.2 葉綠素a的提取與測定 參考韓娟等的方法[11]，取紫球藻液，4 500 r/min離心5 min，棄上清液，藻團(tuán)中加入甲醇振蕩混勻，70 ℃水浴振蕩5 min，自然冷卻后4 500 r/min離心5 min取上清液，即為紫球藻葉綠素a提取液，1 cm光徑下測定750、665 nm波長處的吸光度。

葉綠素a含量=13.9×（D665 nm-D750 nm）×V1/V2。

式中：V1為最終體積，V2為取樣體積，13.9為相關(guān)系數(shù)。

1.3.3 β-胡蘿卜素的提取與測定 參考劉建國等的方法[12-13]，取紫球藻液，4 000 r/min離心15 min，棄上清液，將藻團(tuán)轉(zhuǎn)入到研磨器中，加入80%的丙酮溶液，研磨均勻，4 000 r/min 離心15 min，取上清液至容量瓶中，再將沉淀轉(zhuǎn)入研磨器中，重復(fù)上述操作，合并所有上清液并定容，450 nm 波長、1 cm光徑測定吸光度。

β-胡蘿卜素含量=[D450 nm×稀釋倍數(shù)×10×1 000]÷2 500。公式中，10為所取藻液的體積，1 000為單位換算值，2 500 為β-胡蘿卜素系數(shù)。

1.3.4 水溶性蛋白的測定

1.3.4.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取100 mg的牛血清蛋白溶于少量的無菌水中，并定容至100 mL容量瓶中，配制成1 000 μg/mL的母液，再分別稀釋制成不同濃度的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（表1），分別吸取0.5 mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液置于 20 mL 的比色管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑，反應(yīng)2 min后在1 cm光徑、595 nm波長處測定溶液的吸光度（表1），然后以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

1.3.4.2 可溶性蛋白的提取與測定 取紫球藻液，5 000 r/min 離心10 min，棄上清液，分別用無菌水和 10 mmol/L、pH=6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗藻團(tuán)1次，再將藻團(tuán)轉(zhuǎn)入到研缽中，并加入少許磷酸鹽緩沖液和0.05 g二氧化硅，在冰浴下充分研磨，5 000 r/min離心10 min，取上清液，即為可溶性蛋白的粗提取物，采用Bdarofdr法[14]測定其蛋白含量。

1.3.5 多糖含量的測定

1.3.5.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)確稱取100 mg葡萄糖（烘干至恒質(zhì)量），溶于少量的無菌水中，并定容至100 mL容量瓶中，制成1 000 μg/mL的母液，再分別稀釋制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（表2）。以苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量，取標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，冰水浴一段時(shí)間后加入1 mL 6%的苯酚溶液，隨即加入5 mL的濃硫酸，反應(yīng)完全后在水浴鍋中加熱 20 min 使其充分反應(yīng)，自然冷卻后490 nm波長、1 cm光徑測定吸光度（表2），以標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

1.3.5.2 紫球藻多糖的制備與含量的測定 取紫球藻液，5 000 r/min 離心10 min，棄上清液，向藻細(xì)胞團(tuán)中加入 0.01 mol/L 的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液，在磁力攪拌器上攪拌45 min，再加入同倍體積20%的三氯乙酸（TCA）溶液脫蛋白，4 ℃靜置過夜，5 000 r/min離心10 min，取上清液加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃醇沉過夜，5 000 r/min離心 10 min，去上清液，將沉淀物裝入透析袋（透過分子量8 000），在無菌蒸餾水中透析24 h，透析后的溶液即為提取的多糖溶液。以無菌蒸餾水作為空白對照，用苯酚-硫酸法測定樣品多糖含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，在統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0中利用單因素方差分析（one-way ANOVA）對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，標(biāo)有不同小寫字母者表示組間有顯著差異（P<0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度Fe3+對紫球藻生長的影響

由圖3可知，各組紫球藻的生長趨勢基本相同，接種后各組的藻細(xì)胞都處于靜止適應(yīng)狀態(tài)，從培養(yǎng)6 d開始，紫球藻進(jìn)入對數(shù)生長階段，生物量不斷增大，培養(yǎng)10 d紫球藻基本達(dá)到穩(wěn)定期，生長速度減慢。從紫球藻比生長率（表3）來看，紫球藻的生長狀況為處理組2>處理組3>處理組1>對照組>處理組4。Fe3+濃度在5×10-7～5×10-5 mol/L范圍內(nèi)時(shí)對紫球藻的生長具有促進(jìn)作用，以5×10-6 mol/L的Fe3+對紫球藻的生長促進(jìn)作用最大，其次是5×10-5 mol/L。5×10-4 mol/L 的Fe3+抑制了紫球藻的生長。

2.2 不同濃度Fe3+對紫球藻葉綠素a含量的影響

由圖4可知，紫球藻葉綠素a的含量在接種后基本保持不變，隨細(xì)胞濃度升高，葉綠素a的含量在培養(yǎng)6 d后逐漸升高，在培養(yǎng)10 d基本穩(wěn)定，隨后Fe3+濃度為5×10-4、5×10-5 mol/L 的處理組紫球藻葉綠素a含量還持續(xù)升高。單因素方差分析結(jié)果表明，在培養(yǎng)的前6 d，各處理組的葉綠素a含量差異不顯著（P>0.05），自培養(yǎng)8 d開始，5×10-5 mol/L處理組中紫球藻葉綠素a的含量顯著高于其他處理組及對照組（P<0.05）。

2.3 不同濃度Fe3+對紫球藻β-胡蘿卜素含量的影響

由圖5可知，紫球藻β-胡蘿卜素含量在接種后的一段時(shí)間里基本保持不變，隨細(xì)胞濃度升高，培養(yǎng)6 d后β-胡蘿卜素含量逐漸升高，但Fe3+濃度為5×10-4、5×10-5 mol/L的處理組β-胡蘿卜素含量升高的速率比對照組和Fe3+濃度為5×10-6、5×10-7 mol/L的處理組快。單因素方差分析結(jié)果表明，在培養(yǎng)的前6 d，各處理組的β-胡蘿卜素含量差異不顯著（P>0.05），自培養(yǎng)8 d開始，5×10-5 mol/L處理組中紫球藻β-胡蘿卜素含量顯著高于其他處理組及對照組（P<0.05）。

2.4 不同濃度Fe3+對紫球藻可溶性蛋白含量的影響

由圖6可知，在培養(yǎng)的前8 d，各處理組可溶性蛋白含量與對照組無顯著差異（P>0.05），在培養(yǎng)10 d，F(xiàn)e3+濃度為 5×10-5 mol/L處理組的紫球藻可溶性蛋白含量顯著高于其他處理組及對照組（P<0.05），在培養(yǎng)12、14 d，各處理組的可溶性蛋白含量與對照組相比均有顯著升高（P<0.05），添加不同濃度的Fe3+可以有效地促進(jìn)紫球藻可溶性蛋白的分泌。

2.5 不同濃度Fe3+對紫球藻胞外多糖積累的影響

由圖7可知，紫球藻胞外多糖含量在接種后的一段時(shí)間里基本保持不變，隨細(xì)胞濃度升高，從培養(yǎng)8 d開始，胞外多糖含量逐漸升高，在培養(yǎng)10 d基本達(dá)到穩(wěn)定。在培養(yǎng)的前 8 d，對照組與各處理組的胞外多糖含量差異不顯著（P>0.05），自培養(yǎng)8 d開始，各處理組胞外多糖含量出現(xiàn)差異，但差異不顯著（P>0.05），在培養(yǎng)10、12、14 d，各處理組與對照組的胞外多糖含量幾乎保持穩(wěn)定，但添加Fe3+的濃度越高，紫球藻胞外多糖的積累量越多。

3 討論

相關(guān)研究表明，F(xiàn)e對藻類的影響不僅取決于Fe的含量，更重要的是取決于它轉(zhuǎn)化成生物活性形式的速度以及藻類的有效吸收[1]。本試驗(yàn)研究表明，不同F(xiàn)e3+濃度下紫球藻的生長趨勢基本相同，在試驗(yàn)所涉及的Fe3+濃度范圍內(nèi)，隨著Fe3+濃度升高，生長促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，但并不是Fe3+濃度越高越好，適量的Fe3+（5×10-6、5×10-5 mol/L）會(huì)促進(jìn)紫球藻的生長，但Fe3+濃度增加到一定濃度（5×10-4 mol/L）后，紫球藻細(xì)胞的促進(jìn)作用開始減弱，甚至抑制了紫球藻的生長。Fe3+濃度高抑制了紫球藻細(xì)胞生長的原因可能為Fe3+過高時(shí)，藻類光合作用效率下降，表現(xiàn)在葉綠素a含量的下降、細(xì)胞變小、細(xì)胞分裂率和生長率均下降[1]。劉丹楹等指出，紫球藻生長的最適Fe3+濃度為1×10-5 mol/L，其次為 5×10-6 mol/L[14]，本試驗(yàn)結(jié)果與之相似。由此可見，最適紫球藻生長的Fe3+濃度為1×10-5～5×10-5 mol/L，這為實(shí)際生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)參考。

藻體中色素含量的多少直接影響藻體的光合作用的能力[13]，同時(shí)Fe是藻類細(xì)胞光合色素合成不可缺少的元素，F(xiàn)e3+添加量較低時(shí)，紫球藻活性物質(zhì)的積累量少，這是因?yàn)镕e不足會(huì)影響細(xì)胞代謝活動(dòng)中一些重要的酶的合成或降低其催化活性[1]。隨著Fe3+添加量的升高，紫球藻主要色素葉綠素a和胡蘿卜素的含量明顯增多，本試驗(yàn)Fe3+最適濃度為5×10-5 mol/L。

藻膽蛋白是藍(lán)藻、紅藻和隱藻光合作用的捕光色素，主要包括藻紅蛋白、藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白，其中藻紅蛋白是十分有開發(fā)前景的一員。紫球藻細(xì)胞內(nèi)含有豐富的藻紅蛋白和藻藍(lán)蛋白，且以藻紅蛋白含量最多。紫球藻的生長環(huán)境會(huì)影響藻膽蛋白的含量，僅見少數(shù)報(bào)道[13-14]。在本試驗(yàn)中，紫球藻的可溶性蛋白在培養(yǎng)的中后期開始明顯升高。王明茲等指出，隨著紫球藻生長周期中細(xì)胞濃度的升高，可見光在培養(yǎng)液中的穿透和擴(kuò)散受到了影響，細(xì)胞僅由葉綠素吸收光能而不能滿足細(xì)胞代謝的需要，藻細(xì)胞在對數(shù)晚期開始積累代謝產(chǎn)物——藻膽蛋白[13]，這在一定程度上解釋了本試驗(yàn)紫球藻可溶性蛋白含量在其對數(shù)生長期后期開始明顯升高的現(xiàn)象。本試驗(yàn)中，有利于紫球藻水溶性蛋白積累的Fe3+濃度為 5×10-5 mol/L，這與劉丹楹等的結(jié)果[14]相似。在通入1%二氧化碳后，紫球藻的水溶性蛋白含量顯著降低，不過在補(bǔ)加氮源后，紫球藻水溶性蛋白含量明顯升高[11]。

紫球藻細(xì)胞外包圍著一層黏質(zhì)鞘，即細(xì)胞分泌出來的水溶性黏多糖，該多糖是一類由葡萄糖、木糖和半乳糖等單糖組成的易溶于水的多聚體。它是1種磺酸化多糖，在抗病毒、抗腫瘤、抗血脂、抗菌等方面具有特殊的生物活性作用。紫球藻多糖的產(chǎn)量和提取效率低、制備成本高限制了該多糖的大規(guī)模開發(fā)應(yīng)用[15]。因此，對不同生態(tài)條件下紫球藻多糖產(chǎn)量的研究具有十分重要的意義。盡管本試驗(yàn)中4個(gè)Fe3+處理組的紫球藻胞外多糖產(chǎn)量與對照組之間不存在顯著差異，但其產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間的延長和Fe3+濃度的升高而增大，說明Fe3+加富對紫球藻胞外多糖的分泌有著一定的促進(jìn)作用。由于紫球藻胞外多糖通過高爾基體合成并分泌到胞外，因此其產(chǎn)量受到培養(yǎng)條件的明顯影響[16]。因此，篩選適宜的培養(yǎng)條件對獲取紫球藻胞外多糖具有重要的作用。韓娟等在培養(yǎng)紫球藻時(shí)通入1%的二氧化碳，可以顯著提高紫球藻的活性物質(zhì)積累，其多糖含量最高可達(dá)238.8 mg/L，且在補(bǔ)加氮源后，其胞外多糖和水溶性蛋白的含量均顯著升高[11]。王明茲等指出，1 060 nm的激光照射可以使紫球藻多糖的分泌量提高 50%～150%[8]。此外，有研究表明，高鹽度對紫球藻胞外多糖的分泌具有一定的刺激作用，尤其在鹽度5%時(shí)，胞外多糖的分泌量顯著增大[17]，使藻細(xì)胞表面的外被增厚，有利于細(xì)胞形成表面的微環(huán)境，防治由于鹽度過高造成的細(xì)胞水分丟失，這是細(xì)胞防止離子毒害的機(jī)制之一[18]。

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