新疆楊樹(shù)葉紋斑病病原菌分離及致病性測(cè)定

張金萍+蔣萍

摘要：2014—2015年通過(guò)實(shí)地考察、采集病葉標(biāo)本并采用常規(guī)的組織分離方法對(duì)病葉中的病原菌進(jìn)行分離，對(duì)分離物培養(yǎng)純化，并觀察其形態(tài)特征，為確定這些分離物是否為楊樹(shù)葉紋斑病的致病菌，根據(jù)柯赫氏法則進(jìn)行分離物的致病性測(cè)定及再分離試驗(yàn)。結(jié)果表明，相同癥狀的病葉可以分離出多個(gè)不同的菌株，由于不同菌株的致病性強(qiáng)弱不一，使得在不同的接種條件下，不同菌株對(duì)健康楊樹(shù)葉片的致病性差異顯著，潛育期及發(fā)病率均不相同，根據(jù)ArcGIS軟件對(duì)病葉進(jìn)行分級(jí)，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，并進(jìn)行LSD檢驗(yàn)，判斷出強(qiáng)致病菌。通過(guò)再分離試驗(yàn)得到原致病菌，在顯微鏡下對(duì)強(qiáng)致病菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，初步判定為鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌。

關(guān)鍵詞：楊樹(shù)葉紋斑病；病原菌分離；致病性測(cè)定；鏈格孢屬

中圖分類號(hào)： S763.15 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0110-04

楊樹(shù)是楊柳科楊屬（Populus L.）落葉喬木的通稱，全屬共有100多個(gè)品種，其中有50多種分布在我國(guó)，主要栽種于我國(guó)西部各省。在北疆的額爾齊斯河流域、南疆的塔里木河流域以及天山南北坡的河谷中分布著大面積的楊樹(shù)原始林[1-2]，楊樹(shù)也是新疆地區(qū)綠化造林的重要樹(shù)種之一。國(guó)內(nèi)外報(bào)道的有關(guān)楊樹(shù)葉部壞死斑類的病害主要有褐斑?。∕arssonina brunnea）[3]（別稱黑斑?。?、灰斑?。–oryenum populinum）、皺葉?。‥riophyes dispar）[4]、角斑?。–ercospora populina）[5]、葉緣枯病（Macrophama sp.）[6]、花葉病（CMV）、黑星病（Fusicladium tremulae）、葉枯病（Alternaria alternata）[7]、斑枯?。⊿eptoria）等，其中葉枯病別稱葉紋斑?。ˋlternaria）[8-9]。徐素琴等1984年對(duì)黑龍江省森林植物園、遼寧省蓋縣楊樹(shù)研究所的病葉中的病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、鑒定，確定病原菌為細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuis），但未作病原菌的致病性測(cè)定[10]。1979年趙震宇首次報(bào)道了新疆楊樹(shù)葉紋斑病的病原菌為細(xì)鏈格孢菌，但未對(duì)病原菌進(jìn)行分離及致病性測(cè)定[11]。黃毅2010年對(duì)采自東北林業(yè)大學(xué)林場(chǎng)的楊樹(shù)葉枯病病樣中的病原菌也進(jìn)行了分離培養(yǎng)、鑒定，確定病原菌為[A. alternate （Fr.） Keissl]，但未作病原菌的致病性測(cè)定[5]。因此，本研究通過(guò)對(duì)新疆楊樹(shù)葉紋斑病病葉中的病原菌分離培養(yǎng)、純化及致病性測(cè)定，為進(jìn)一步對(duì)楊樹(shù)葉紋斑病的病原菌進(jìn)行鑒定及確認(rèn)其分類地位提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

楊樹(shù)病葉于2014年5月至2015年9月采自烏魯木齊市、石河子市、沙雅縣、阿拉爾市、瑪納斯縣等地區(qū)。

1.2 病原菌分離培養(yǎng)

采用組織分離法[12]，取病健交界處組織，切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，放入無(wú)菌的燒杯中，用0.1%氯化汞溶液消毒60 s，然后用無(wú)菌水漂洗3次，最后用無(wú)菌濾紙吸去多余的水分，將病塊組織移入PDA培養(yǎng)基平板上，每皿放5塊，3次重復(fù)，以健康葉片組織作對(duì)照，放入25 ℃光照恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d后挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行純化。分離率=病原菌菌落數(shù)/分離組織塊總數(shù)×100%。

1.3 致病性測(cè)定

1.3.1 接種菌株 根據(jù)菌株的菌落特征，從烏魯木齊市分離菌株中選3個(gè)菌株、阿拉爾市選2個(gè)菌株、瑪納斯縣選2個(gè)菌株、石河子市選3個(gè)菌株、沙雅縣選2個(gè)菌株，共選取12個(gè)菌株。

1.3.2 接種材料 離體葉片：從活體樹(shù)上摘下健康的楊樹(shù)葉片。活體樹(shù)：田間健康楊樹(shù)。

1.3.3 接種體 菌餅：在純化7 d后的菌落上，打取直徑為 6 mm 的菌餅作為接種體。

孢子懸浮液的制備：將菌餅接種到PDA液體培養(yǎng)基（100 mL/瓶）中，每個(gè)菌株接種3瓶，共接種36瓶。置于 28 ℃ 恒溫箱中振蕩培養(yǎng)7 d后，用磁力攪拌機(jī)攪拌3 min制成孢子懸浮液。

1.3.4 接種方法 將葉片用流水沖洗，再用70%乙醇表面消毒，自然晾干，備用。接種方法分為刺傷和無(wú)傷接種，刺傷接種時(shí)先用無(wú)菌針在葉片接種部位刺傷4個(gè)點(diǎn)，將直徑為 6 mm 的菌餅的菌絲面貼于傷口上，對(duì)照接空白培養(yǎng)基塊。孢子懸浮液接種用同樣的刺傷方法，將配制好的孢子懸浮液噴灑在刺傷葉片的正反兩面，對(duì)照噴灑無(wú)菌水。無(wú)傷接種時(shí)直接將菌餅貼在葉片接種部位上，對(duì)照接空白培養(yǎng)基塊。無(wú)傷孢子懸浮液接種即將配制好的孢子懸浮液噴灑在健康葉片的正反兩面，對(duì)照噴灑無(wú)菌水。各接種處理均重復(fù)3次，接種后噴無(wú)菌水保濕48 h，定期觀察并記錄發(fā)病情況，計(jì)算發(fā)病率。發(fā)病率= 發(fā)病點(diǎn)數(shù)/接種總點(diǎn)數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

2014—2015年對(duì)不同地區(qū)的病葉進(jìn)行5次常規(guī)組織分離[11]，共分離268塊組織（表1），其中真菌菌落232個(gè)，占總數(shù)的86.6%；根據(jù)真菌菌落的顏色、形態(tài)特征及生長(zhǎng)速度的差異性[13]共分為5類菌株，將菌株在PDA平板上純化3 d后，可以觀察到菌落形態(tài)特征的差異性。如圖1所示，第1類菌株表面呈灰白色的絨毛狀，菌落疏松；第2類菌株表面呈灰色棉絮狀，較為蓬松；第3類菌株表面呈深褐色的絨毛狀，菌落較為緊密；第4類菌株表面呈紫紅色且有較長(zhǎng)的絨毛覆蓋，菌落疏松；第5類菌株表面呈粉紅色且有較短的絨毛，菌落緊密。

2.2 分離物致病性測(cè)定結(jié)果

2.2.1 室內(nèi)離體材料接種 由表2可知，健康的楊樹(shù)葉片接種12個(gè)真菌（表3）后，用菌餅接種的楊樹(shù)葉片發(fā)病速度最快，潛育期最短，其中楊樹(shù)葉片接種菌株M1、M2、M3、M11后發(fā)病率均達(dá)到100%，接種菌株M4、M8后發(fā)病率均為91.7%，接種菌株M6、M9后楊樹(shù)葉片的發(fā)病率均為83.3%。剩余菌株致病性較弱，在相同的接種時(shí)間內(nèi)，潛育期較長(zhǎng)，發(fā)病率較低。用孢子懸浮液接種后，對(duì)照均不發(fā)病，楊樹(shù)葉片接種菌株M1、M2、M4、M11后發(fā)病率均大于50.0%。