比較基因組分析斯氏假單胞菌遺傳多樣性及固氮基因島進(jìn)化機(jī)制

李向陽(yáng)+湯宏+張國(guó)輝

摘要：對(duì)5株固氮與11株非固氮斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）基因組開(kāi)展綜合比較分析，從基因組水平上研究斯氏假單胞菌種內(nèi)遺傳多樣性及其固氮基因島進(jìn)化機(jī)制。核心與元基因組分析發(fā)現(xiàn)，16個(gè)斯氏假單胞菌擁有的獨(dú)特基因數(shù)占元基因數(shù)的46.37%；基于平均核苷酸相似度分析，這16個(gè)菌株被劃分為11種不同的基因組變異型，表明斯氏假單胞菌基因組異質(zhì)化程度高。固氮基因島及進(jìn)化樹(shù)分析表明，5株固氮菌屬于3種不同基因組變異型，它們的固氮基因島及其側(cè)翼序列保守性好，而且固氮酶基因進(jìn)化樹(shù)與菌株譜系進(jìn)化樹(shù)呈現(xiàn)高度一致性。據(jù)此推測(cè)，斯氏假單胞菌祖先可能通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移的方式獲得固氮基因島，從而轉(zhuǎn)變?yōu)楣痰?，但是在后期進(jìn)化過(guò)程中，絕大部分固氮菌株丟失了固氮基因島。

關(guān)鍵詞：斯氏假單胞菌；固氮基因島；比較基因組；基因組變異型；多樣性

中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0033-06

斯氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）屬γ變形菌亞門（γ-Proteobacteria）假單胞菌屬（Pseudomonas），是革蘭氏陰性菌。它廣泛分布于土壤、湖泊和海洋，甚至臨床環(huán)境中[1-2]，是研究細(xì)菌反硝化作用機(jī)制的主要模式菌株之一，同時(shí)也是假單胞菌屬中為數(shù)不多的具備生物固氮能力的菌種[3-4]。代謝功能多樣性是斯氏假單胞菌的典型特征，這些代謝功能使得斯氏假單胞菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值[3]。例如，斯氏假單胞菌的生物固氮和反硝化代謝作用廣泛參與氮元素的地球化學(xué)循環(huán)；一些斯氏假單胞菌能夠降解芳香族化合物（如萘、苯并蒽、咔唑）[5]并參與重（類）金屬循環(huán)與轉(zhuǎn)化[6]。此外，很多菌株具有自然轉(zhuǎn)化（自然吸收外界DNA）的能力，如自然轉(zhuǎn)化菌株P(guān). stutzeri DSM 10701[7]、P. stutzeri 28a24[8]。

基于16S rRNA 基因及多位點(diǎn)序列分析發(fā)現(xiàn)，斯氏假單胞菌在遺傳水平上呈現(xiàn)高度異質(zhì)性[9-10]。因?yàn)樵诜诸悓W(xué)上暫時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明確的表型來(lái)支持新種的劃分，所以研究者暫時(shí)采用基因組變異型對(duì)這些斯氏假單胞菌進(jìn)行分類[3]。目前斯氏假單胞菌被劃分為多達(dá)19種不同的基因組變異型[3，11]，如該種的典型菌株P(guān). stutzeri ATCC 17588和固氮菌株P(guān). stutzeri A1501為基因組變異型1的菌株[12-13]；P. stutzeri ATCC 14405為基因組變異型2的菌株[14]；固氮菌株P(guān). stutzeri NF13為基因組變異型19的菌株[15]。

自2008年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院首次完成聯(lián)合固氮斯氏假單胞菌A1501基因組序列測(cè)定以來(lái)[13]，目前累計(jì)已對(duì)十幾株分離于不同環(huán)境的斯氏假單胞菌完成了基因組序列的測(cè)定，其中包括5株固氮菌，分別是菌株P(guān). stutzeri A1501、P. stutzeri DSM4166、P. stutzeri B1SMN1、P. stutzeri NF13、P. stutzeri KOS6[13，15-18]。對(duì)P. stutzeri A1501菌株的固氮基因島分析顯示，它由49個(gè)成簇分布的基因組成。通過(guò)與假單胞菌屬其他菌株基因組序列比較并結(jié)合GC含量分析，推測(cè)菌株A1501的固氮基因島可能通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移的方式獲得[13]。

雖然眾多斯氏假單胞菌完成了基因組測(cè)序，但是目前還沒(méi)有對(duì)它們開(kāi)展多基因組比較的報(bào)道。本研究首次對(duì)16株斯氏假單胞菌基因組進(jìn)行綜合比較分析，從基因組成水平上分析與解釋斯氏假單胞菌顯著的遺傳多樣性；同時(shí)通過(guò)斯氏假單胞菌種內(nèi)的5株固氮菌、11株非固氮菌基因組之間的比較來(lái)分析固氮基因島復(fù)雜的進(jìn)化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

16株斯氏假單胞菌基因組從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因組數(shù)據(jù)庫(kù)下載，包括7株完整基因組（P. stutzeri 28a24、P. stutzeri A 1501、P. stutzeri ATCC 17588、P. stutzeri CCUG 29243、P. stutzeri DSM 10701、P. stutzeri DSM 4166 和P. stutzeri RCH2）和9株草圖基因組（P. stutzeri ATCC 14405、P. stutzeri B1SMN1、P. stutzeri KOS6、P. stutzeri MF28、P. stutzeri NF13、P. stutzeri SDM-LAC、P. stutzeri T13、P. stutzeri TS44 和P. stutzeri XLDN-R）。

1.2 方法

1.2.1 核心基因與元基因組分析 利用自編寫的Perl腳本從16個(gè)斯氏假單胞菌的基因組序列注釋文件中分別提取每個(gè)基因組的所有基因序列，作為元基因組分析軟件PGAP[19]的輸入文件；然后在LINUX系統(tǒng)下運(yùn)行PGAP，依次經(jīng)蛋白質(zhì)同源聚類分析和元基因組計(jì)算，即可獲得元基因組和核心基因組信息。

1.2.2 核心基因序列構(gòu)建系統(tǒng)譜系進(jìn)化樹(shù) 利用16個(gè)斯氏假單胞菌的核心基因數(shù)據(jù)來(lái)推導(dǎo)它們之間的譜系進(jìn)化關(guān)系。首先從17個(gè)菌株（選取銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa POA1為外群菌株）的核心基因中選取894個(gè)高度保守基因（蛋白質(zhì)相似度≥70%，序列比對(duì)覆蓋度≥90%），確保這些同源蛋白基因在每個(gè)基因組中只有1個(gè)拷貝，而且每套保守基因的長(zhǎng)度都差不多；用ClustalW分別比對(duì)每套保守基因的蛋白質(zhì)序列，然后將這些保守基因比對(duì)結(jié)果串聯(lián)成17條氨基酸鏈，每條分別對(duì)應(yīng)1個(gè)基因組；將串聯(lián)得到的序列文件導(dǎo)入MEGA 5.0[20]軟件，選擇鄰接法來(lái)重構(gòu)進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap方法重復(fù)計(jì)算1 000次來(lái)評(píng)估樹(shù)的可靠性。

1.2.3 平均核苷酸相似度（ANI）分析及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 平均核苷酸相似度表示2個(gè)菌株在基因組DNA水平上的相似度，一般用軟件JSpecies[21]進(jìn)行計(jì)算。JSpecies計(jì)算平均核苷酸相似度的主要步驟：（1）將16個(gè)基因組的DNA序列導(dǎo)入JSpecies；（2）在JSpecies窗口，根據(jù)基因組兩兩自由組合，共120個(gè)組合[C（16，2）]，并選擇序列比對(duì)算法MUMMER（其他參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)）進(jìn)行計(jì)算。

將JSpecies生成的120個(gè)ANI值導(dǎo)入Excel 2007，以 100-ANI%處理方法構(gòu)建距離矩陣，然后導(dǎo)入MEGA 5.0構(gòu)建鄰接法進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 基因組共線性分析 7株完整基因組采用軟件MUMMER 3.0[22]進(jìn)行共線性分析。在Linux環(huán)境下運(yùn)行MUMMER程序，并選取典型菌株P(guān). stutzeri ATCC 17588作為參考基因組。

1.2.5 多基因組及固氮基因島比較分析 以生物固氮株A1501生物為參考基因組，利用BLASTp 程序（選擇默認(rèn)參數(shù)）比對(duì)其他15株基因組的蛋白質(zhì)基因序列，然后用軟件CGview[23]對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化展示。固氮基因島序列比對(duì)采用多基因組比對(duì)軟件MAUVE[24]進(jìn)行。另外，通過(guò)5株固氮斯氏假單胞菌的固氮酶編碼基因nifHDK比對(duì)NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取其他相關(guān)菌株的nifHDK蛋白質(zhì)基因序列，按照“1.2.2”節(jié)建樹(shù)類似方法，構(gòu)建固氮酶基因進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 16株斯氏假單胞菌基因組特征

16株斯氏假單胞菌分離于多種不同的環(huán)境，表明它們具有廣泛的環(huán)境適應(yīng)性。與假單胞菌屬其他菌株相比，斯氏假單胞菌基因組較小，其長(zhǎng)度介于4.17～5.32 Mbp之間，GC含量為60.5%～64.4%（表1）。用MUMMER3.0軟件分析種內(nèi)菌株基因組之間的共線性，由圖1可知，P. stutzeriATCC17588與同一基因組變異型菌株A1501、DSM 4166及菌株RCH2之間的共線性非常保守；除幾個(gè)大片段區(qū)域的倒位外，P. stutzeri ATCC 17588與基因組變異型3菌株CCCUG 29243的整體共線性較好；但是，菌株ATCC 17588與2個(gè)自然轉(zhuǎn)化菌株（P. stutzeri DSM 10701和28a24）的共線性程度非常低。

2.2 核心與元基因組分析

核心和元基因組經(jīng)常被用來(lái)評(píng)估一個(gè)種內(nèi)菌株之間的多樣性[25]，一個(gè)種的核心基因定義為所有菌株共同擁有的基因，也就是基本的遺傳物質(zhì)用來(lái)維持這個(gè)種的特征。元基因組指的是所有基因，主要用來(lái)反映這個(gè)種容納遺傳物質(zhì)的能力。分析結(jié)果表明，16個(gè)斯氏假單胞菌元基因組大小為 10 822 個(gè)同源蛋白基因，在10 822個(gè)同源蛋白基因中，所有16個(gè)菌株的獨(dú)特同源蛋白基因總和為5 018個(gè)（圖2），約為元基因組數(shù)的46.37%，說(shuō)明斯氏假單胞菌通過(guò)高頻率的水平基因轉(zhuǎn)移獲取外源基因。核心基因數(shù)為2 157個(gè)同源蛋白基因（圖2），占其基因組大小的42.27%～56.54%，表明斯氏假單胞菌株只需要其50%左右的基因來(lái)維持種的基本特征。上述這些特征正好解釋了斯氏假單胞菌的表型及代謝多樣性，在一定程度上賦予它們適應(yīng)周圍環(huán)境的能力。

2.3 平均核苷酸相似度分析斯氏假單胞菌多樣性

與16S rRNA基因進(jìn)化樹(shù)相比較，核心基因進(jìn)化樹(shù)具有更高的分辨率[26]。如圖3-A所示，基于894個(gè)核心基因構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)能夠清晰地區(qū)分16個(gè)斯氏假單胞菌之間的進(jìn)化關(guān)系?；?20個(gè)ANI值構(gòu)建100-ANI%雙向矩陣，然后采用MEGA構(gòu)建得到進(jìn)化樹(shù)，如圖3-B所示，可見(jiàn)ANI矩陣進(jìn)化樹(shù)與核心基因進(jìn)化樹(shù)之間的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)非常相似。以上結(jié)果相互驗(yàn)證了2種方法推導(dǎo)得到的進(jìn)化樹(shù)結(jié)果的可靠性。

ANI被認(rèn)為是一種用來(lái)比較菌株之間進(jìn)化距離的非常可靠的方法，2個(gè)細(xì)菌基因組之間的ANI值為95%，相當(dāng)于它們之間DNA-DNA雜交值為70%，因此ANI≥95%被作為判斷細(xì)菌種的閾值[21，27]。由圖3-B可知，菌株ATCC 17588、A1501、DSM 4166、B1SMN1、T13和XLDN-R緊密聚集在一起，它們兩兩之間的ANI值均大于95%，因此被歸類為基因組變異型1；其他10個(gè)菌株兩兩之間的ANI值均小于95%的臨界值，因此分別代表基因組突變型2、3、8、19和其他未知的6種。綜上所述，16個(gè)菌株可以被劃分為11個(gè)基因組變異型；同時(shí)ANI分析結(jié)果顯示，120個(gè)ANI值介于84.51%～98.37%之間，絕大多數(shù)ANI值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于95%，說(shuō)明斯氏假單胞菌基因組之間存在顯著的遺傳多樣性。

2.4 固氮基因島進(jìn)化分析

從圖4-A中可以看出，固氮基因島存在于所有5株固氮斯氏假單胞菌（A1501、B1SMN1、DSM 4166、KOS6和NF13）中， 但是在其他11株非固氮斯氏假單胞菌基因組中缺失，并且固氮基因島對(duì)應(yīng)的側(cè)翼序列在16個(gè)基因組中保守性較好。5株菌的固氮基因島序列比對(duì)分析結(jié)果顯示，它們整體上的組成類似，并且固氮相關(guān)基因序列相似度高（圖4-B）。此外還發(fā)現(xiàn)，基因組變異型1的3個(gè)菌株（A1501、B1SMN1、DSM 4166）的固氮基因島在組成與排布上幾乎完全相同；屬于基因組變異型19的NF13菌株，其固氮基因島與4株固氮菌的差異最大。為了進(jìn)一步分析固氮基因島的進(jìn)化機(jī)制，利用5株固氮斯氏假單胞菌及其他相關(guān)固氮菌的固氮酶編碼基因nifHDK構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。如圖5所示，固氮斯氏假單胞菌在nifHDK基因進(jìn)化樹(shù)和斯氏假單胞菌譜系進(jìn)化樹(shù)（圖3-A、圖3-B）中的位置關(guān)系高度一致。

3 結(jié)論與討論

本研究主要從基因組水平上對(duì)斯氏假單胞菌高度的遺傳多樣性以及固氮基因島的進(jìn)化機(jī)制進(jìn)行了分析。斯氏假單胞菌在進(jìn)化上呈現(xiàn)高度的遺傳多樣性是該種研究的主要熱點(diǎn)之一。之前的研究主要借助16S rRNA基因或者多個(gè)看家基因來(lái)解析該種群的多樣性關(guān)系[28-32]。根據(jù)相關(guān)研究，斯氏假單

胞菌被分為19個(gè)基因組突變型，并且更多的基因組突變型還在不斷被發(fā)現(xiàn)。本研究首次利用已測(cè)序的16個(gè)斯氏假單胞菌基因組序列，從基因組內(nèi)容（基因）、結(jié)構(gòu)（共線性）及核苷酸（ANI）水平上分析了斯氏假單胞菌種內(nèi)多樣性。結(jié)果顯示：（1）絕大多數(shù)斯氏假單胞菌兩兩基因組之間的ANI值都小于95%，16個(gè)菌株可以劃分為11種不同的基因組變異型；（2）獨(dú)特基因占整個(gè)元基因組數(shù)量的46.37%；（3）部分菌株基因組之間的共線性程度非常低（如DSM 10701vs ATCC 17588和28a24vs ATCC 17588）。上述現(xiàn)象正好解釋了斯氏假單胞菌種內(nèi)高度的遺傳多樣性（異質(zhì)性）以及多樣的代謝表型。在分類學(xué)上，ANI被認(rèn)為很有可能替代DNA-DNA雜交法，作為一種衡量菌株之間遺傳關(guān)系的非常可靠的方法。本研究根據(jù)ANI分析結(jié)果推測(cè)，斯氏假單胞菌很可能將被劃分為多個(gè)親緣關(guān)系非常密切的種。

生物固氮菌通過(guò)固氮酶及其他相關(guān)基因的作用下，將大氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)變成生物可利用的銨根離子（NH4+），使其在氮元素的地球化學(xué)循環(huán)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有重要應(yīng)用價(jià)值[33]。雖然生物固氮菌廣泛分布于原核生物界，但是主要零星地分布于變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠藻門（Chlorobi）、廣古菌門（Euryarchaeota）等[34-35]。同樣，本研究涉及的5株固氮斯氏假單胞菌也是呈零散狀分布于該種的譜系進(jìn)化樹(shù)分支中。核心基因進(jìn)化樹(shù)分析顯示，在進(jìn)化時(shí)間上，非固氮斯氏假單胞菌（MF28、28a24、SDM-LAC、DSM10701和TS44）的起源早于固氮斯氏假單胞菌（A1501、B1SMN1、DSM 4166、KOS6和NF13），因此推測(cè)斯氏假單胞菌的祖先不具有固氮基因島，而是在后來(lái)進(jìn)化的過(guò)程中才獲得了固氮基因島[36]。5株固氮斯氏假單胞菌的固氮基因島組成相似，蛋白質(zhì)編碼基因序列相似度高，并且它們?cè)趎ifHDK基因進(jìn)化樹(shù)和該種譜系進(jìn)化樹(shù)中的位置關(guān)系高度一致[37]，表明固氮基因島很可能通過(guò)垂直遺傳傳遞給子代，同時(shí)，ATCC1788、T13、XLDN-R、ATCC1405和CCUG29243在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中丟失了固氮基因島[36]。另外，固氮基因島的GC含量明顯高于其基因組的平均GC含量，因此推測(cè)斯氏假單胞菌固氮基因島通過(guò)近期水平基因轉(zhuǎn)移獲得。綜上所述，在斯氏假單胞菌中，固氮基因島的發(fā)生與轉(zhuǎn)移是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程。

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