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    TLR4、CD14在干燥綜合征患者唇腺組織中的表達(dá)及臨床意義

    2017-02-27 22:32:00張東霞項(xiàng)德坤郭偉民
    中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新 2016年35期

    張東霞 項(xiàng)德坤 郭偉民

    【摘要】 目的:探討干燥綜合征患者唇腺組織分泌功能損傷與TLR4、CD14的關(guān)系。方法:通過對干燥綜合征患者唇腺組織進(jìn)行免疫組化和逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),來檢測其中TLR4、CD14蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果:(1)TLR4和CD14在干燥綜合征組唇腺組織中表達(dá)明顯增高,對照組唇腺組織中未見TLR4、CD14表達(dá);(2)按照病理分級,TLR4、CD14表達(dá)的陽性率分別為0~1級62.5%,2級70.0%,3級75.0%,4級58.3%,各組間TLR4、CD14表達(dá)陽性率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);(3)約64.4% PSS唇腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞有TLR4、CD14的表達(dá),在淋巴細(xì)胞灶中67.8%的淋巴細(xì)胞表達(dá)TLR4、CD14,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);(4)TLR4、CD14 mRNA在干燥綜合征組唇腺組織中的表達(dá)明顯高于對照組(P<0.05)。結(jié)論:TLR4、CD14在干燥綜合征唇腺組織中高表達(dá),干燥綜合征唇腺組織分泌功能的損傷,可能與外源性感染啟動(dòng)TLR4、CD14信號傳導(dǎo)通路有關(guān);在干燥綜合征發(fā)病機(jī)制中,導(dǎo)管上皮細(xì)胞主動(dòng)參與了免疫損傷過程。

    【關(guān)鍵詞】 TLR4; CD14; 唇腺組織

    Expression and Clinical Significance of TLR4,CD14 in Patients with Sjogrens Syndrome Labial Gland Tissue/ZHANG Dong-xia,XIANG De-kun,GUO Wei-min.//Medical Innovation of China,2016,13(35):051-055

    【Abstract】 Objective:To study the relationship between TLR4,CD14 and patients with sjogrens syndrome labial gland secretion tissue damage and.Method:Through the labial gland tissue in patients with sjogren's syndrome immunohisto chemical and reverse transcription polymerase chain reaction,to detect the TLR4,CD14 protein and mRNA expression.Result:(1)CD14 and TLR4 expression in labial gland organization in sjogren's syndrome group was obviously higher,the control group did not see labial gland tissue TLR4,CD14 expression.(2)According to the pathological classification,TLR4,CD14 expression positive rate respectively 0-l level was 62.5%,2 level was 70.0% and 3 level was 75.0% and 4 level was 58.3%.TLR4,CD14 expression positive rate differences were statistically significant(P<0.05).(3)About 64.4% of PSS labial gland duct epithelial cells had the expression of TLR4,CD14,about 67.8% of the lymphatic in focal lymphocytic cells express TLR4,CD14,there was no statistically significant difference(P>0.05).(4)TLR4,CD14 mRNA expression of labial gland tissue in sjogrens syndrome group was obviously higher than that of the control group(P<0.05).Conclusion:TLR4,CD14 in sjogrens syndrome labial gland tissue increases,sjogrens syndrome labial gland secretion of tissue damage,may exogenous infection start TLR4 and CD14 signaling pathways.Epithelial cells in the pathogenesis of sjogrens syndrome,actively involve in the immune damage process.

    【Key words】 TLR4; CD14; Salivary gland

    First-authors address:The PLA 285th Hospital,Handan 036000,China

    doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.013

    干燥綜合征(sjogrens syndrome,SS)是風(fēng)濕免疫病中的常見疾病,其病理特點(diǎn)為淋巴細(xì)胞浸潤人體外分泌腺所形成的一種慢性炎癥反應(yīng)[1],其可能的病因與遺傳、免疫、內(nèi)分泌和感染等因素有關(guān)[2]。其中細(xì)菌感染與自身免疫性疾病的關(guān)系目前受到廣泛重視,研究表明干燥綜合征患者合并牙周炎的概率很高,而導(dǎo)致牙周炎的常見細(xì)菌是革蘭陰性菌(gramnegative bacteria,GNB)[3]。現(xiàn)已知,當(dāng)人體感染GNB后,其菌體本身和/或其內(nèi)毒素——脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)隨之進(jìn)入血循環(huán),激活淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞,釋放多種炎性介質(zhì),最終導(dǎo)致免疫炎癥發(fā)生[4]。TLR4(Toll like receptor 4)、CD14是人體對LPS產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要受體,LPS可以通過TLR4、CD14信號傳導(dǎo)系統(tǒng)啟動(dòng)固有免疫和自身免疫,從而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生[4]。那么,SS的發(fā)病與該信號傳導(dǎo)系統(tǒng)是否有關(guān),為此設(shè)計(jì)本課題旨在探討細(xì)菌感染在SS發(fā)病中的作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    1.1.1 唇腺組織中TLR4、CD14 mRNA檢測樣本采集與分組 經(jīng)解放軍第285醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并逐一簽署患者知情同意書后,選擇解放軍第285醫(yī)院風(fēng)濕科門診或住院患者中因病情需要需做唇腺活檢者48例,進(jìn)行唇腺組織樣本采集,經(jīng)臨床分析,其中符合干燥綜合征分類標(biāo)準(zhǔn)的患者27例,作為干燥綜合征組;通過血清學(xué)檢查和唇腺組織活檢否定干燥綜合征診斷的患者21例,作為對照組進(jìn)行唇腺組織中TLR4、CD14 mRNA的檢測。

    1.1.2 唇腺組織中TLR4、CD14蛋白檢測樣本采集與分組 采用解放軍第285醫(yī)院2011年2月-2016年

    2月常規(guī)石蠟包埋的唇腺組織標(biāo)本作為研究對象,根據(jù)患者的病歷資料,其中診斷符合干燥綜合征分類標(biāo)準(zhǔn)的唇腺標(biāo)本作為研究組,共31例,其中男3例,女28例;臨床排除干燥綜合征診斷的標(biāo)本作為對照組,共20例,其中男3例,女17例。

    1.1.3 唇腺標(biāo)本采集 在無菌條件下,手術(shù)切取患者唇腺組織約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小2小塊,一塊常規(guī)病理檢查,另一塊即刻置于Trizol液中,10 min內(nèi)置-70 ℃冰箱保存,備RNA提取用。

    1.2 方法

    1.2.1 主要儀器及試劑 Mx3005熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國Stratagenes公司)、PTC-100 PCR儀(美國MJ Research公司)、鼠抗任CD14單克隆抗體(北京中杉金橋公司)、Trizol總RNA提取試劑盒(大連寶生物公司)、兔抗人TLR4單克隆抗體 (博士德公司)、引物由上海生物工程有限公司合成、DNA Marker(北京博邁德公司)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(大連寶生物公司)。

    1.2.2 總RNA提取 將上述置于-70 ℃冰箱保存的唇腺組織放入含有1.5 mL RNAiso Reagent的離心管中,進(jìn)行勻漿至漿液呈透明狀,室溫下靜置5 min;取上清液,加入等體積異丙醇,再次離心后取沉淀物經(jīng)清洗溶解后保存于-70 ℃冰箱備檢。

    1.2.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genebank中TLR4、CD14基因序列(ACCESSION NM 003266)、(ACCESSIONNM 000591),采用引物設(shè)計(jì)軟件primer premier 5設(shè)計(jì)引物:TLR4引物:上游:5-AAA GCC CTG CTG GAT GGT AAA T-3(2724-2745),下游:5-TTG AAA TGC CCA CCT GGA AGA C-3(3027-3006),擴(kuò)增產(chǎn)物長度304 bp;CD14引物:上游:5-CGT GGG CGA CAG GGC GTT CTT-3(812-832),下游:5-TCC CGT CCA GTG TCA GGT TAT CCA-3(1139-1316),擴(kuò)增產(chǎn)物長度528 bp;β-actin:作為陽性對照,上游:5-AGC GAG CAT CCC CCA AAG TT-3(1380-1399),下游:5-GGG CAC GAA GGC TCA TCA TT-3(1664-1645),擴(kuò)增產(chǎn)物長度285 bp。

    1.2.4 TLR4、CD14mRNA檢測 按RT-PCR產(chǎn)品試劑盒說明書檢測。

    1.2.5 TLR4、CD14 蛋白檢測 采用Envision (Enhanced labeled polym ersystem)法檢測,具體按試劑盒說明書檢測。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 12.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以(x±s)表示,比較采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,比較采用 字2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組唇腺組織中TLR4、CD14 mRNA的表達(dá)

    2.1.1 TLR4、CD14 mRNA RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果比較 TLR4、CD14 mRNA RT-PCR結(jié)果,見圖1和2。

    2.1.2. TLR4、CD14 mRNA半定量結(jié)果 干燥綜合征組TLR4 mRNA和CD14 mRNA的表達(dá)均高于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

    2.2 兩組唇腺組織中TLR4和CD14蛋白的表達(dá)

    2.2.1 表達(dá)結(jié)果 干燥綜合征組高表達(dá)TLR4和CD14,對照組未出現(xiàn)TLR4、CD14表達(dá),見表2和圖3~6。

    2.2.2 TLR4和CD14蛋白表達(dá)與病理分級的關(guān)系 根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]的分類法,將唇腺組織中的淋巴細(xì)胞浸潤程度分為0~4級,檢測不同分級標(biāo)本中TLR4、CD14的綜合陽性率,結(jié)果顯示,前三級中分級越高,TLR4、CD14陽性率也越高,其陽性率分別為:0~1級TLR4、CD14的陽性率為62.5%,2級陽性率為70.0%,3級76.0%,4級的唇腺組織破壞嚴(yán)重,TLR4、CD14表達(dá)率明顯下降為58.3%,不同病理間TLR4、CD14陽性率比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

    2.2.3 TLR4、CD14在唇腺組織中的表達(dá) 對照組20例唇腺標(biāo)本中未見TLR4、CD14表達(dá),研究組的唇腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中有64.4%表達(dá)TLR4、CD14,在唇腺組織的淋巴細(xì)胞灶中TLR4、CD14的表達(dá)為67.8%,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    3 討論

    干燥綜合征(SS)是一種以外分泌腺組織中出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤為特征的自身免疫性疾病,最常見的癥狀是口眼干燥,其臨床表現(xiàn)多種多樣,是一種系統(tǒng)性疾病,人體的任何系統(tǒng)和器官均可受累,其中腎臟受累導(dǎo)致腎小管病多見,惡性淋巴細(xì)胞增殖是其另一特點(diǎn)[5]。SS的病理特點(diǎn)是在外分泌腺的柱狀上皮中出現(xiàn)大量浸潤的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和單核細(xì)胞,形成濾泡樣結(jié)構(gòu),臨床上稱之為淋巴細(xì)胞灶,隨著病情的進(jìn)一步發(fā)展,外分泌腺出現(xiàn)腺管狹窄、萎縮、擴(kuò)張以及纖維化。

    SS的病因及發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說,其中細(xì)菌感染與SS發(fā)病的關(guān)系研究較少,在臨床工作中筆者觀察到,細(xì)菌感染常常導(dǎo)致SS患者病情加重或者出現(xiàn)癥狀,SS患者最常見的感染莫過于口腔內(nèi)革蘭陰性菌。革蘭陰性菌進(jìn)入人體可以釋放LPS,LPS可以通過TLR4-CD14信號傳導(dǎo)系統(tǒng)啟動(dòng)免疫反應(yīng)。

    TLR4屬于Toll樣受體,是參與固有免疫的一類蛋白質(zhì)分子,也是連接獲得性免疫和固有免疫的橋梁[6]。當(dāng)人體的物理屏障如皮膚、黏膜,被微生物突破后, TLR可以識別它們并激活人體免疫應(yīng)答反應(yīng)。CD14,即LPS受體,是一種存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞表面的白細(xì)胞分化抗原,其生物活性是識別、結(jié)合LPS,介導(dǎo)LPS性細(xì)胞反應(yīng)。

    文獻(xiàn)[7-9]研究顯示,33%~100%唇腺上皮細(xì)胞表達(dá)HLA-DR抗原,具有抗原提呈功能,可導(dǎo)致免疫反應(yīng)發(fā)生;文獻(xiàn)[10-11]檢測到SS患者唇腺上皮細(xì)胞高表達(dá)TLR2、TLR3、TLR4及髓樣分化因子MyD88,提示TLR參與了SS的發(fā)病過程。文獻(xiàn)[12-13]體外培養(yǎng)SS唇腺上皮細(xì)胞,結(jié)果顯示TLR1、TLR2、TLR3和TLR4分子的表達(dá)明顯高于對照組。文獻(xiàn)[14-18]研究推斷在SS發(fā)病中唇腺上皮細(xì)胞并不是“無辜旁觀受害者”,而是SS發(fā)病的主動(dòng)參與者。

    本研究對SS患者的唇腺組織采用RT-PCR法和免疫組化法檢測其TLR4、CD14 mRNA和蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示,SS患者高表達(dá)TLR4、CD14 mRNA;TLR4和CD14蛋白檢測也顯示SS組明顯增高,而對照組唇腺組織中未見TLR4和CD14表達(dá),提示TLR4和CD14參與了SS外分泌腺體炎癥,淋巴細(xì)胞的浸潤與TLR4和CD14有密切關(guān)系;本研究還發(fā)現(xiàn)TLR4和CD14的表達(dá)均位于浸潤的淋巴細(xì)胞和唇腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞,表達(dá)呈胞漿型,在SS唇腺腺泡細(xì)胞上均未發(fā)現(xiàn)TLR4和CD14的表達(dá),這一結(jié)果表明導(dǎo)管上皮細(xì)胞參與了SS的發(fā)病過程,腺泡細(xì)胞是免疫炎癥的受害者,本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[19-20]的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析還可以看到,隨著淋巴細(xì)胞浸潤程度的提高TLR4和CD14的表達(dá)陽性率也明顯增高,而當(dāng)唇腺組織出現(xiàn)明顯纖維化時(shí),TLR4和CD14的表達(dá)出現(xiàn)下降,這一結(jié)果也進(jìn)一步證明,TLR4、CD14與腺體中淋巴細(xì)胞的大量浸潤密切相關(guān)。本研究結(jié)果提示,TLR4、CD14在干燥綜合征患者唇腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞高表達(dá),細(xì)菌感染可能通過LPS-TLR4-CD14信號傳導(dǎo)通路參與干燥綜合征的發(fā)病過程,這一研究結(jié)果將為臨床預(yù)防和治療SS提供新思路。

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    (收稿日期:2016-10-12) (本文編輯:程旭然)

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