Angiopoietin—2和Tie—2在人乳腺癌組織中的表達及臨床意義

付傳恒　戶莊　常亮

【摘要】 目的：探討Angiopoietin-2和Tie-2在人乳腺癌組織中的表達及其臨床意義。方法：應用免疫組織化學法檢測乳腺癌組織和正常乳腺組織中Angiopoietin-2和Tie-2的表達情況，并分析其與臨床病理學特征及預后間的相關性。結(jié)果：Angiopoietin-2在乳腺癌和正常乳腺組織中的陽性表達率分別為80.99%（98/121）、10.53%（4/38），Tie-2在乳腺癌和正常乳腺組織中的陽性表達率分別為75.21%（91/121）、15.79%（6/38），乳腺癌中Angiopoietin-2和Tie-2的陽性表達率均顯著高于正常乳腺組織（P<0.05）。Angiopoietin-2、Tie-2的表達與病理分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后相關（P<0.05）。結(jié)論：Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌組織中呈高表達，其可能成為預測乳腺癌發(fā)生發(fā)展及預后的生物標志物。

【關鍵詞】 乳腺癌； Angiopoietin-2； Tie-2； 預后

【Abstract】 Objective：To investigate the expression and clinical significance of Angiopoietin-2 and Tie-2 in human breast cancer.Method：The expressions of Angiopoietin-2 and Tie-2 in breast cancer tissues and normal breast tissues were detected by immunohistochemistry，and their correlation with clinicopathological features were analyzed.Result：The positivity rates of Angiopoietin-2 and Tie-2 in breast cancer tissue were 80.99%（98/121） and 75.21%（91/121），there were significantly higher than those of the adjacent normal tissues （10.53% and 15.79%，P<0.05）.The expression of Angiopoietin-2 and Tie-2 were correlated with pathological stage，axillary lymph node metastasis and prognosis（P<0.05）.Conclusion：Angiopoietin-2 and Tie-2 are highly expressed in breast cancer tissues，which may be biomarkers for predicting the development and prognosis of breast cancer.

【Key words】 Breast cancer； Angiopoietin-2； Tie-2； Prognosis

First-authors address：Huaihe Hospita1 of Henan University，Kaifeng 475000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.32.006

乳腺癌發(fā)病率占女性惡性腫瘤的首位，目前其發(fā)病機制尚不清楚，但有研究表明乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展與血管生成關系密切，乳腺癌組織中的微血管密度明顯高于正常乳腺組織[1]。血管生成素-2（Angiopoietin-2）主要通過與內(nèi)皮細胞特異性酪氨酸激酶受體-2（Tie-2）的結(jié)合介導血管生成[2]。血管生成不僅為腫瘤細胞的生長提供營養(yǎng)，而且能夠促進腫瘤細胞的遠處轉(zhuǎn)移。本研究主要通過免疫組織化學方法檢測Angiopoietin-2及其受體Tie-2在乳腺癌中的表達，探討兩者的表達與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預后的關系，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2003年1月-2011年12月在河南大學淮河醫(yī)院乳腺外科手術并經(jīng)組織病理學確診的女性乳腺癌患者121例，全部病例均未行術前放療和化療。年齡26～73歲，平均（53.9±7.8）歲。組織學分型：浸潤性導管癌76例，導管內(nèi)癌39例，浸潤性小葉癌6例；其中有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者75例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例，臨床分期Ⅰ期21例，Ⅱ期72例，Ⅲ期27例，Ⅳ期1例。同時選擇38例乳腺良性病變中的病變旁組織為正常乳腺組織，經(jīng)病理學觀察確定為正常乳腺組織。

1.2 方法 兔抗人Angiopoietin-2及Tie-2多克隆抗體及SP免疫組化試劑盒均購自博士德公司，一抗以1∶100稀釋使用。所有標本經(jīng)甲醛固定后石蠟包埋，4 μm的組織連續(xù)切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，酒精梯度脫水，H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，枸櫞酸鹽微波高壓抗原修復，然后滴加一抗4 ℃過夜，室溫復溫后滴加二抗并于37 ℃溫箱孵育1 h，DAB顯色，然后蘇木素復染，梯度酒精脫水后封片。采用已知陽性切片作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定標準 腫瘤組織染色強度判定：未染色記作0分；輕度染色記作1分；中度染色記作2分；強度染色記作3分。腫瘤組織染色細胞百分比：在高倍鏡下選取陽性最多的區(qū)域，記錄5個高倍視野中陽性細胞的百分比，計算其平均值。每個視野染色細胞百分數(shù)平均值分為4個級別：0～25%記作0分；25%～50%記作1分；50%～75%記作2分；>75%記作3分。組織染色強度與染色細胞百分比級別之和3～6分為陽性。以上檢測有病理科醫(yī)生采用盲法獨立檢測。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌中的表達情況 Angiopoietin-2和Tie-2的陽性染色主要位于細胞漿/細胞膜基質(zhì)，為淡黃色到棕黃色顆粒細胞漿，在乳腺癌中絕大多數(shù)導管上皮細胞顯示強陽性，基質(zhì)組織不染色；而在正常乳腺組織中細胞不染色或染色細胞數(shù)目減少，見圖1。在121例乳腺癌患者中，Angiopoietin-2的陽性表達率為80.99%（98/121），Angiopoietin-2在正常乳腺組織中的陽性表達率為10.53%（4/38）。Tie-2在乳腺癌中的陽性表達率為75.21%（91/121），在正常乳腺組織中的陽性表達率為15.79%（6/38）。研究結(jié)果顯示，兩者在乳腺癌中的陽性表達率均高于正常乳腺組織中的陽性表達率，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2 Angiopoietin-2和Tie-2的表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關系Angiopoietin-2和Tie-2的表達與患者的年齡、分化程度及腫瘤大小均無關（P<0.05），但是與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分期相關（P<0.05）。Angiopoietin-2和Tie-2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的陽性表達率分別為85.33%（64/75）和82.67%（62/75），均高于其在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的52.17%（24/46）和45.65%（21/46），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。Ang-2、Tie-2在Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌中的陽性表達率分別為85.71%（24/28）和78.57%（22/28），均高于Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌的52.69%（49/93）和50.54%（47/93），差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.3 Angiopoietin-2和Tie-2的表達與乳腺癌患者預后的關系 采用對數(shù)秩檢驗（Log-rank test）分析Angiopoietin-2和Tie-2的表達與預后的關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Angiopoietin-2陰性的乳腺癌患者生存期顯著高于Angiopoietin-2陽性的患者（P=0.026），見圖2；且Tie-2陽性乳腺癌患者預后較Tie-2陰性患者差，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.031），見圖3。

3 討論

Angiopoietin-2為分泌型糖蛋白，主要通過與內(nèi)皮細胞特異性酪氨酸酶受體Tie-2結(jié)合而發(fā)揮功能。當Angiopoietin-2與內(nèi)皮細胞上的Tie-2結(jié)合時，可引起內(nèi)皮細胞之間、內(nèi)皮細胞與支持細胞之間的相互作用減弱，破壞血管結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，由此導致毛細血管形成新的血管[3-4]。目前研究發(fā)現(xiàn)這兩種在功能上相關的蛋白在肺癌等多種腫瘤中的表達上調(diào)并在腫瘤血管形成中起著重要作用[5-6]，但是兩者在乳腺癌組織中表達尚不明確，特別是其與臨床病理特征和預后的關系并不清楚。本研究對Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌中的表達及預后進行了初步探討。

本研究首先觀察Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達情況，結(jié)果顯示乳腺癌中Angiopoietin-2和Tie-2的陽性表達率均顯著高于正常乳腺組織（P<0.05），表明兩者可能以協(xié)同或互補的方式共同參與乳腺癌的發(fā)生過程。目前研究表明，Angiopoietin-2與Tie-2相互作用而參與腫瘤血管的重塑及組織修復的過程，其在腫瘤組織的高表達可能參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等[7]。有學者通過動物模型發(fā)現(xiàn)Angiopoietin-2轉(zhuǎn)染促進肺和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在肺轉(zhuǎn)移灶中Angiopoietin-2呈過表達并破壞內(nèi)皮細胞的完整性，而阻斷Angiopoietin-2后可減少淋巴結(jié)、肺轉(zhuǎn)移和腫瘤淋巴管生成[8]。Imanishi等[9]研究表明Angiopoietin-2和Tie-2上調(diào)不但促進乳腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移并且在轉(zhuǎn)移發(fā)生的啟動階段起關鍵作用。而本研究結(jié)果顯示，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者中Angiopoietin-2和Tie-2的陽性表達率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者（P<0.05），并且兩者與乳腺癌的分期相關，提示兩者在乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程中可能起重要作用，可以作為判斷乳腺癌惡性程度的指標，本研究結(jié)果與在腎癌、結(jié)腸癌及卵巢癌中的研究一致[10-12]。

有研究發(fā)現(xiàn)靶向抑制Ang-2/Tie-2可減少腫瘤的轉(zhuǎn)移和抑制腫瘤的生長，Ang-2 是未來的治療腫瘤的靶點[13-14]。Han等[15]研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Angiopoietin-2的高標表達與患者的生存期降低有關。本研究進一步對Angiopoietin-2和Tie-2與乳腺癌生存期的關系進行了初步探討，結(jié)果表明對Angiopoietin-2陽性的乳腺癌患者生存期顯著高于Angiopoietin-2陰性的乳腺癌患者（P<0.05），并且Tie-2陽性的乳腺癌患者生存期顯著高于Tie-2陰性的乳腺癌患者（P<0.05），這一結(jié)果支持這兩種因子是預測乳腺癌預后的生物學標志物。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Angiopoietin-2和Tie-2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，兩者可以作為預測乳腺癌預后的生物學標志物，有望成為乳腺癌治療的新靶點。

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（收稿日期：2016-09-18） （本文編輯：程旭然）