普伐他汀對(duì)人胰腺癌細(xì)胞SW1990的影響及其聯(lián)合順鉑的抗瘤作用

張敏

[摘要]目的 探討普伐他汀對(duì)人胰腺癌細(xì)胞SW1990的作用及其聯(lián)合順鉑對(duì)該細(xì)胞增殖的影響。方法 采用MTT比色法檢測(cè)普伐他汀對(duì)SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞的周期分布和凋亡率。順鉑、普伐他汀聯(lián)合順鉑作用細(xì)胞48 h后，采用MTT法測(cè)定各處理組的OD值，并計(jì)算相互作用指數(shù)（CI）。結(jié)果 1、5、10、15、25 μmol/L普伐他汀作用于SW1990細(xì)胞24～72 h，隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，處理組OD值不同程度下降（P<0.05），生長(zhǎng)抑制率逐漸增大。0、5、15、25 μmol/L普伐他汀處理細(xì)胞48 h后，G0/G1期細(xì)胞逐漸增多，S期和G2/M期細(xì)胞逐漸減少，凋亡率由（2.74±0.92）%增加至（27.85±1.56）%。普伐他汀聯(lián)合順鉑作用細(xì)胞后，兩者的CI值均<1。結(jié)論 普伐他汀具有抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖和誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用，并可阻滯細(xì)胞周期于G1期。普伐他汀聯(lián)合順鉑對(duì)SW1990細(xì)胞具有協(xié)同抗瘤作用。

[關(guān)鍵詞]普伐他??；順鉑；胰腺癌；增殖；凋亡；SW1990

[中圖分類號(hào)] R735.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）11（a）-0004-04

[Abstract]Objective To study the effects of Pravastatin on human pancreatic cancer cell SW1990 and the influence of combining Pravastatin and Cisplatin on the cells proliferation.Methods Inhibition of Pravastatin on SW1990 cells was measured by MTT colorimetric method，apoptosis rate and distribution of cell cycle were shown by flow cytometry.After the cells were treated with cisplatin，combining Pravastatin with Cisplatin for 48 hours，Proliferation was examined with MTT test，the OD values were computed，the combination index （CI） was calculated.Results SW1990 cells were treated with 1，5，10，15，25 μmol/L Pravastatin for 24 hours to 72 hours，with the increase of drug concentration and the prolongation of time，different levels of OD value in each treatment group decreased （P<0.05），the growth inhibition rate increased gradually.After the cells were treated with 0，5，15，25 μmol/L Pravastatin for 48 hours，the number of cells in G0/G1 phase increased gradually，while the number of cells in S phase and G2/M phase decreased gradually，and the apoptosis rate increased from （2.74±0.92）% to （27.85±1.56）%.The CI values of Cisplatin and Pravastatin were all less than 1 when the cells were treated with two drugs.Conclusion Pravastatin can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of SW1990 cells in vitro，and show an arrest of cell cycle in G1 phase.Combining Pravastatin with Cisplatin show a synergistic antitumor effect on SW1990 cells.

[Key words]Pravastatin；Cisplatin；Pancreatic cancer；Proliferation；Apoptosis；SW1990

胰腺癌預(yù)后差，在西方國(guó)家居惡性腫瘤死亡第4位，預(yù)計(jì)在未來十年內(nèi)將上升至第2位[1]。在我國(guó)，胰腺癌位于惡性腫瘤死亡第9位。他汀類藥物是20世紀(jì)80年代研發(fā)的一類調(diào)脂藥物，可降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇生成。研究表明，他汀類藥物除了具有降低膽固醇的作用外，還具有抗腫瘤作用。本研究旨在探討普伐他汀對(duì)人胰腺癌細(xì)胞SW1990的影響及其聯(lián)合順鉑的抗瘤作用。

1材料與方法

1.1主要材料

人胰腺癌細(xì)胞株SW1990由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心惠贈(zèng)；普伐他汀購自美國(guó)Sigma公司；胎牛血清為杭州四季青生物技術(shù)公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國(guó)Sigma公司；順鉑為市售齊魯制藥公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

在37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，將SW1990細(xì)胞置于含10%胎牛血清、含青霉素100 U/ml、含鏈霉素100 U/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板，用含不同濃度普伐他汀的RPMI-1640培養(yǎng)基換液培養(yǎng)24、48、72 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組（空白培養(yǎng)基）、細(xì)胞對(duì)照組（不含普伐他汀）以及含1、5、10、15、25 μmol/L普伐他汀的處理組，每組設(shè)6個(gè)平行孔。培養(yǎng)完成后加入MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄上清，上機(jī)于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定吸光度（OD）值，并根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率（%）=（細(xì)胞對(duì)照組OD值-處理組OD值）/（細(xì)胞對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。

1.3.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布和凋亡率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，加入0、5、15、25 μmol/L的普伐他汀處理48 h后收獲細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行DNA分析，計(jì)算細(xì)胞周期的時(shí)相分布和凋亡率。

1.3.3 MTT比色法檢測(cè)普伐他汀聯(lián)合順鉑對(duì)SW1990細(xì)胞的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板上。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，加入含不同組別、不同濃度藥物的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，上機(jī)測(cè)OD值并計(jì)算不同組別細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組，細(xì)胞對(duì)照組，濃度為0.1、0.5、1.0 μg/ml單藥順鉑組，濃度為1、5、10 μmol/L普伐他汀分別聯(lián)合0.1、0.5、1.0 μg/ml順鉑組。

計(jì)算普伐他汀和順鉑的相互作用指數(shù)（combination index，CI），CI值=普伐他汀a/普伐他汀b+順鉑a/順鉑b，其中，普伐他汀a、順鉑a為兩藥聯(lián)合達(dá)到某一生長(zhǎng)抑制率時(shí)各自的濃度，普伐他汀b、順鉑b為兩藥單獨(dú)應(yīng)用達(dá)到相同生長(zhǎng)抑制率時(shí)的各自的濃度。CI>1.0表明兩藥聯(lián)合具有拮抗作用，CI=1.0表明兩藥聯(lián)合具有相加作用或無關(guān)作用，CI<1.0表明兩藥聯(lián)合具有協(xié)同作用。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1普伐他汀對(duì)SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響

1、5、10、15、25 μmol/L普伐他汀處理細(xì)胞24～72 h，隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，各處理組OD值不同程度下降（P<0.05），生長(zhǎng)抑制率逐漸增高（圖1）。

2.2普伐他汀對(duì)SW1990細(xì)胞周期分布的影響

5、15、25 μmol/L普伐他汀作用SW1990細(xì)胞48 h后，和對(duì)照組比較，隨藥物濃度增大，G0/G1細(xì)胞逐漸增多，S期和G2/M期細(xì)胞逐漸減少（圖2）。

2.3普伐他汀對(duì)SW1990細(xì)胞凋亡的影響

SW1990細(xì)胞經(jīng)過不同濃度普伐他汀處理48 h后，空白對(duì)照組（0 μmol/L普伐他?。┑牡蛲雎蕿椋?.74±0.92）%，5 μmol/L普伐他汀處理組的凋亡率為（7.34±1.23）%，15 μmol/L普伐他汀處理組的凋亡率為（15.76±2.18）%，25 μmol/L普伐他汀處理組的凋亡率為（27.85±1.56）%。各組的凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=800.971，P<0.05）。5 μmol/L普伐他汀處理組的凋亡率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。15、25 μmol/L普伐他汀處理組的凋亡率顯著高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.4普伐他汀聯(lián)合順鉑對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的影響

采用MTT比色法分析普伐他汀聯(lián)合順鉑對(duì)SW1990細(xì)胞增殖的作用，如表1所示。0.1、0.5、1.0 μg/ml順鉑作用于細(xì)胞后的OD值顯著低于對(duì)照組（0 μmol/L普伐他汀+0 μg/ml順鉑），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=311.139，P<0.05）。1、5、10 μmol/L普伐他汀分別配伍聯(lián)合0.1、0.5、1.0 μg/ml順鉑，不同濃度普伐他汀聯(lián)合某一濃度順鉑后，聯(lián)合組的OD值顯著低于該濃度單藥順鉑組（0.1、0.5、1.0 μg/ml順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=404.575、383.930、88.359，均P<0.05）。

2.5普伐他汀聯(lián)合順鉑對(duì)SW1990細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響

根據(jù)公式計(jì)算出普伐他汀聯(lián)合順鉑作用SW1990細(xì)胞后的生長(zhǎng)抑制率并繪制成抑制率曲線（圖3）。結(jié)果顯示，普伐他汀聯(lián)合順鉑達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為50%時(shí)的CI值，普伐他汀聯(lián)合順鉑的CI值均<1，提示普伐他汀和順鉑可協(xié)同抑制SW1990細(xì)胞增殖。

3討論

他汀類藥物通過抑制HMG-CoA還原酶阻滯內(nèi)源性膽固醇合成過程中的甲羥戊酸（mevalonic acid，MVA）途徑，從而影響許多重要的生物學(xué)功能如細(xì)胞膜構(gòu)成、蛋白異戊二烯化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期進(jìn)程等[2]。越來越多的研究證實(shí)，他汀類藥物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡、抑制新生血管、預(yù)防浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用[3-8]，且其對(duì)正常細(xì)胞沒有顯著毒副作用，具有良好的抗腫瘤前景。本實(shí)驗(yàn)證明，普伐他汀對(duì)胰腺癌細(xì)胞SW1990具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用并能阻滯該細(xì)胞周期進(jìn)程。

胰腺癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，病情進(jìn)展快，患者就診時(shí)多已發(fā)生局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，80%以上的患者已無法行根治性手術(shù)。胰腺癌致死率高，5年生存率僅為1%～4%，即使手術(shù)聯(lián)合輔助化療，總生存率也≤30%[9-10]。近年來由于治療的進(jìn)展，無法手術(shù)切除的局部晚期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的總生存期已延長(zhǎng)至將近1年[11]，但總體而言，胰腺癌患者手術(shù)治愈率低，對(duì)放療不敏感，缺乏特異的靶點(diǎn)和高效的靶向藥物[12-13]，新興的免疫治療尚不成熟[14]，化療仍是進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性胰腺癌的主要治療手段。順鉑為目前臨床最常用的化療藥物，抗瘤譜廣，順鉑聯(lián)合吉西他濱是治療胰腺癌常用的化療方案之一。

近年來，許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)報(bào)道了他汀類藥物的放化療增敏作用。2012年的一項(xiàng)研究證實(shí)，在前列腺癌PC-3細(xì)胞中，阿伐他汀增強(qiáng)了放療的敏感性[15]。Martirosyan等[16]指出，洛伐他汀增強(qiáng)了阿霉素抑制卵巢癌細(xì)胞的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，普伐他可增強(qiáng)順鉑的抑瘤作用。

綜上所述，普伐他汀具有抑制胰腺癌細(xì)胞SW1990增殖和誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡的作用，并可阻滯細(xì)胞周期于G1期。普伐他汀聯(lián)合順鉑對(duì)SW1990細(xì)胞具有協(xié)同抗瘤作用。

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（收稿日期：2016-10-08 本文編輯：祁海文）