枯否細(xì)胞在肝衰竭中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

田光敏+劉鵬

摘要：免疫介導(dǎo)的損傷在肝衰竭發(fā)病機(jī)制中起十分重要的作用，與肝衰竭過程中的肝細(xì)胞壞死和疾病臨床預(yù)后密切相關(guān)。枯否細(xì)胞（Kupffer，KC）是免疫系統(tǒng)中最著名的角色之一，定植于肝臟血竇內(nèi)皮之間，具有高度活性，它可以吞噬和清除從腸道來的微生物，又可被細(xì)菌脂多糖或細(xì)胞超抗原激活，釋放炎癥介質(zhì)進(jìn)入血液中，激活眾多的炎性細(xì)胞，參與肝臟的炎癥反應(yīng)。本文就KC在肝衰竭中的作用機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞：KC；肝衰竭；細(xì)胞因子；調(diào)節(jié)機(jī)制

肝衰竭是多種因素引起的嚴(yán)重而廣泛的肝細(xì)胞死亡，導(dǎo)致肝臟本身合成、解毒、排泄和生物轉(zhuǎn)化等功能發(fā)生嚴(yán)重障礙或失代償，出現(xiàn)以凝血機(jī)制障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組臨床證候群。肝衰竭內(nèi)科綜合治療效果不佳，預(yù)后差，病死率高，嚴(yán)重威脅患者的生命健康，影響社會穩(wěn)定。肝衰竭的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已成為肝病學(xué)的研究熱點。最近研究表明肝衰竭的發(fā)病機(jī)制大體可歸為兩類：直接損傷和免疫介導(dǎo)的損傷，而免疫學(xué)機(jī)制特別是以免疫細(xì)胞動員和細(xì)胞因子的大量分泌為代表的免疫系統(tǒng)活化是急性肝衰竭發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。KC是定居于肝血竇內(nèi)的巨噬細(xì)胞，胃腸道來源的毒素、微生物以及機(jī)體衰老的紅細(xì)胞等，經(jīng)門靜脈到達(dá)肝臟后，首先要經(jīng)過 KC這道防線。KC過度活化，并分泌多種細(xì)胞因子在肝衰竭發(fā)病機(jī)制中起重要的作用，若能深入研究肝衰竭進(jìn)程中KC的作用機(jī)制，早期抑制KC的過度活化，阻止炎癥重癥化，便有可能從源頭上遏制肝衰竭的發(fā)生。

1 KC的一般特性及功能

KC是肝臟駐留性巨噬細(xì)胞，在健康肝臟中，KC占機(jī)體全部組織特性巨噬細(xì)胞的80～90%、肝臟所有細(xì)胞的15 %以及肝臟非實質(zhì)細(xì)胞的35%。KC主要定居在肝血竇中，有43%位于門靜脈區(qū)，29%位于中央靜脈區(qū)，剩余的28%則位于肝小葉的中部區(qū)域，這種分布可以讓其第一時間高效地吞噬來源于門脈循環(huán)的病原體。其生物功能具有兩面性，一方面能清除細(xì)菌及毒素發(fā)揮抗感染作用；另一方面通過釋放各種炎癥介質(zhì)放大炎癥反應(yīng)而造成組織損傷。此外，KC還可影響肝細(xì)胞、星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等肝內(nèi)主要組成細(xì)胞的生物學(xué)功能。

2 KC在肝衰竭中的作用及機(jī)制

2.1 KC在肝衰竭過程中表型 巨噬細(xì)胞有很強(qiáng)的可塑性，目前最主流的分型方法是將巨噬細(xì)胞分為：經(jīng)典傳統(tǒng)活化的M1型巨噬細(xì)胞和替代活化的M2型巨噬細(xì)胞，這些表型的極化是受細(xì)胞所處的微環(huán)境所影響?；罨腗1巨噬細(xì)胞與I型細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6 和INF-γ）有關(guān)，表現(xiàn)出強(qiáng)大的促炎效應(yīng)，可以促進(jìn)Th1免疫應(yīng)答。與之相反，活化的M2型巨噬細(xì)胞釋放一些免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)（如IL-4、IL-10和IL-13），抑制炎癥和促進(jìn)組織修復(fù)，促進(jìn)Th2型方向的免疫效應(yīng)。KC是位于肝內(nèi)的巨噬細(xì)胞，是組織中數(shù)量最多的一種巨噬細(xì)胞。 正常狀態(tài)下，不成熟的KC多分化為M2型，以維持肝臟內(nèi)的免疫耐受。在ALF的早期，活化的KC表現(xiàn)出M1表型，釋放大量的炎性介質(zhì)，如IFN-γ、TNF-α 、HMGB1、fgl2等，促進(jìn)肝損傷。在ALF的緩解期，KC更多表現(xiàn)出M2型的特點，產(chǎn)生抗炎因子和促增殖細(xì)胞因子，如IL-10、IL-6、CDl63等，調(diào)節(jié)過度的免疫反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)[2]。

2.2 KC與細(xì)胞因子

2.2.1早期的M1型KCs細(xì)胞分泌促炎因子，介導(dǎo)肝毒性作用 在ALF早期，KC受到各種轉(zhuǎn)化信號通路的活化，成為經(jīng)典活化的M1表型，釋放大量的前炎癥介質(zhì)，如TNF-a、IFN-γ、ROS、HMGB-1、fgl2等，促進(jìn)肝損傷。

2.2.1.1腫瘤壞死因子-α 在KC釋放的眾多炎癥介質(zhì)當(dāng)中，TNF-α是最受矚目的。它在炎癥、細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)KC向"M1"型化過程中均起重要作用。KC 分泌的TNF-α是肝內(nèi)該細(xì)胞因子的主要來源，低濃度的 TNF-α能夠刺激肝細(xì)胞再生，而高濃度的 TNF-α則導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。肝臟炎癥時，刺激 KC 分泌大量的 TNF-α加重肝臟的炎癥，進(jìn)一步導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死。有研究發(fā)現(xiàn)，KC受內(nèi)毒素刺激后大量分泌TNF-α，其數(shù)量與肝細(xì)胞凋亡程度成正相關(guān)，用TNF-α單抗阻斷后肝細(xì)胞凋亡數(shù)目明顯下降。在LPS/GalN和Con A介導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭模型中，血清和肝組織中的TNF-α水平均升高，用中和性TNF抗體預(yù)處理小鼠，或?qū)NF-α進(jìn)行基因敲除，均對肝損傷有保護(hù)作用[3]。

2.2.1.2 IFN- γ 具有抗病毒和促炎癥效應(yīng)雙重效應(yīng)。許多研究發(fā)現(xiàn)，在病毒相關(guān)性或化學(xué)損傷相關(guān)性的ALF時，IFN-γ的表達(dá)增加，在體內(nèi)給予抗IFN-γ中和性抗體，可以通過抑制IFN-γ和TNF-a的分泌而減輕肝損傷[4]，且過量并持續(xù)的 IFN-γ表達(dá)能刺激KC產(chǎn)生極強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

2.2.1.3 HMGB1 HMGB1具有刺激其他炎癥細(xì)胞因子釋放的功能，參與了肝衰竭的發(fā)生發(fā)展，對肝衰竭的診斷和治療有重要的意義。臨床研究表明，在肝衰竭的過程中，活化的KC細(xì)胞可以主動釋放 HMGB1，HMGB1 通過晚期糖化終產(chǎn)物受體和 Toll 樣受體4等發(fā)揮促炎癥因子的作用。陽喬等[5]通過體外實驗，得出肝臟KC細(xì)胞中HMGB1的表達(dá)在肝衰竭早期明顯增高。趙中夫等[6]在LPS誘導(dǎo)原代培養(yǎng)肝實質(zhì)細(xì)胞與KC細(xì)胞表達(dá)和釋放HMGB1的實驗中，得出經(jīng)LPS誘導(dǎo)6 h，肝實質(zhì)細(xì)胞和枯否細(xì)胞培養(yǎng)液中 HMGB1含量無顯著差異；但在繼續(xù)誘導(dǎo)12～48 h后 ，KC培養(yǎng)液中HMBG 1顯著增加，且明顯高于相應(yīng)時間點的肝實質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液HMGB1含量，從而得出KC細(xì)胞是肝衰竭發(fā)生發(fā)展過程中促炎因子HMGB1的主要來源細(xì)胞。

2.2.1.4凝血酶原酶蛋白-2（fibrinogen-like protein2，fgl 2） 凝血酶原酶是新近發(fā)現(xiàn)的一種新的免疫凝血因子，正常情況下，fgl2 在內(nèi)皮細(xì)胞、CTL等中微量表達(dá)，在病毒感染或細(xì)胞因子如IFN γ 誘導(dǎo)下，單核細(xì)胞等可高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠感染小鼠肝炎病毒（MHV-3）后，由巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌的 fgl2 在肝臟選擇性高表達(dá)，fgl2可通過直接裂解凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶而啟動免疫凝血過程，促使局部微小血栓的形成和肝細(xì)胞缺血缺氧性壞死進(jìn)而加重肝損傷。用中和性fgl2抗體或fgl2.siRHA質(zhì)粒進(jìn)行體內(nèi)研究，結(jié)果顯示肝臟中纖維膠原沉積減少，小鼠生存率明顯提高，提示fgl2可能是治療人類病毒相關(guān)性肝衰竭的靶分子。

2.2.1.5氧自由基 氧自由基作為一種含一個未配對的化學(xué)物質(zhì)，幾乎可以損傷體內(nèi)所有的活性物質(zhì)，包括蛋白質(zhì)，核酸及某些大分子物質(zhì)。 KC 被激活后能夠產(chǎn)生大量的氧自由基，通過使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生其它促炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激以及組織病理性損傷。氧自由基不但能夠直接損傷肝細(xì)胞， 還能引起內(nèi)皮細(xì)胞和庫否細(xì)胞腫脹， 從而導(dǎo)致肝臟微循環(huán)障礙，加重肝臟損傷。早期研究提示，活化的肝臟巨噬細(xì)胞可釋放超氧離子，介導(dǎo)如LPS、ConA和缺血缺氧性肝損傷過程，用自由基清除劑可以減輕肝臟炎癥反應(yīng)。

2.2.1.6趨化因子 趨化因子可引導(dǎo)免疫細(xì)胞遷移，研究已證明由趨化因子-趨化因子受體相互作用誘導(dǎo)免疫細(xì)胞浸潤是許多急性和慢性肝病的致病因素。單核趨化蛋白-1（MCP-1），也稱CCL2，是一種經(jīng)典的單核/巨噬細(xì)胞趨化因子，它可作用于細(xì)胞的CCR2，在許多炎癥反應(yīng)中動員和募集細(xì)胞。國內(nèi)外研究證明，發(fā)生肝衰竭時，作為CC類趨化因子MCP-1作用于于KC的受體CCR2，動員骨髓中的活化的單核巨噬細(xì)胞并使其游走向肝臟，參與急性肝衰竭的進(jìn)展。

2.2.2 M2型KC分泌抗炎因子，起肝臟保護(hù)作用 在ALF的整個過程中，部分自我更新的KC呈現(xiàn) M2型細(xì)胞樣作用，分泌IL-10、IL-6、CDl63等抗炎及促增殖的細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及促進(jìn)肝臟損傷修復(fù)的功能，特別是在的后期階段M2細(xì)胞樣作用的KC起主導(dǎo)作用。闡明這類KC細(xì)胞表型及增殖的調(diào)節(jié)機(jī)制，有助于為ALF的免疫治療提供新的思路。

2.2.2.1 IL-10 肝臟中的IL-10主要是由M2型KC和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）產(chǎn)生的，其主要作用是拮抗促炎癥效應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受。在LPS/GalN介導(dǎo)的肝衰竭時，體內(nèi)TNF-γ和IL-10水平平行上升，提示促炎癥M1型KC和抑炎癥M2型KC之間存在著相互作用的關(guān)系[7]。

2.2.2.2 IL-6 主要由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是一種多功能炎癥因子，參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化、分化和肝細(xì)胞的再生過程。在急性肝衰竭動物模型中，血清中的 IL-6水平顯著升高，肝臟浸潤細(xì)胞可表達(dá)正常10倍以上的 IL -6。IL-6 可以通過促進(jìn)肝細(xì)胞再生、誘導(dǎo)熱休克蛋白表達(dá)，抑制NKT細(xì)胞活性對肝臟產(chǎn)生保護(hù)作用，或通過激活抗凋亡途徑如誘導(dǎo)肝細(xì)胞表達(dá) Bcl-x1抑制肝細(xì)胞凋亡。也有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6和轉(zhuǎn)化生長因子（ TGF -β）能通過激活轉(zhuǎn)錄因子維甲酸相關(guān)孤獨(dú)受體（ROR） γt和RORα 促進(jìn) Th17 細(xì)胞的分化，IL -6 還可通過誘導(dǎo)STAT3的表達(dá)上調(diào) Th17細(xì)胞導(dǎo)致慢加急性肝衰竭[8]。

2.2.2.3 CD163 CD163 是清道夫受體家族成員之一，特異性地表達(dá)在單核/巨噬細(xì)胞群中，是單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞的標(biāo)志，大量CD163分子的表達(dá)被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞活化的標(biāo)志活化。KC可以釋放可溶性CD163參與機(jī)體抑炎癥效應(yīng)。

2.3 KC與鄰近細(xì)胞在肝衰竭中的相互作用 KC作為肝臟中重要的天然免疫細(xì)胞之一，它調(diào)控著肝臟的早期炎癥反應(yīng)，它與其它臨近細(xì)胞之間相互作用，很大程度上決定著肝炎發(fā)生的結(jié)局。KC常受腸道細(xì)菌、微生物碎片和LPS等因子刺激， 釋放細(xì)胞因子、類前列腺素、氧化亞氮和活性氧簇； 這些因子一方面調(diào)控KC自身的功能活性， 介導(dǎo)炎癥反應(yīng)， 另一方面又和鄰近細(xì)胞（肝細(xì)胞、星形細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及其他旁路免疫細(xì)胞）產(chǎn)生交互調(diào)控。盡管這是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，隨著肝臟各細(xì)胞成分分離技術(shù)的成熟和體外共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立，各細(xì)胞類型之間的相互作用成為研究的熱點。

2.3.1 KC與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞之間的作用 在肝竇Dissc間隙中，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSECs）與KC毗鄰。肝臟巨噬細(xì)胞活化后釋放的TNF-a，超氧陰離子可以直接損傷LSECs，而且KC釋放的fgl2可誘導(dǎo)纖維蛋白沉積和微小血栓形成，造成鄰近LSECs缺血缺氧性損傷[9]。LSECs和KC間還可能通過胞內(nèi)粘附分子-1（ICAM-1）/白細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1（LFA-1）相互作用。該粘附分子的單克隆抗體對肝孢子蟲感染相關(guān)的肝損傷有保護(hù)作用。

2.3.2 KC與中性粒細(xì)胞之間的作用 KC和中性粒細(xì)胞均是肝臟中關(guān)鍵的天然免疫防御成分，KC吞噬損傷細(xì)胞后，通過LFA-1和CD54與中性粒細(xì)胞相互作用，激活中性粒細(xì)胞，后者再把細(xì)菌殺死，有效地抵御細(xì)菌感染[10]。在內(nèi)毒素相關(guān)的或缺血再灌注相關(guān)的肝損傷中，由KC釋放的TNF-a和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的中性粒細(xì)胞趨化因子（CrNC）可以介導(dǎo)中性粒細(xì)胞向肝竇間隙浸潤。同時，KC還可以吞噬并消化衰老/凋亡的中性粒細(xì)胞，維持肝臟免疫穩(wěn)態(tài)[11]。

2.3.3 KC與NK細(xì)胞之間的作用 日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，KC通過產(chǎn)生前列腺素可抑制NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，而通過分泌I/II干擾素、IL-12和IL-18則可增強(qiáng)NK細(xì)胞的活力和細(xì)胞毒性，兩類細(xì)胞間的相互作用還可通過NKG2D-Rael、TLR信號和細(xì)胞接觸而實現(xiàn)。由于巨噬細(xì)胞-NK細(xì)胞效應(yīng)是肝臟的第一道免疫防線，進(jìn)一步深入研究這兩類細(xì)胞之間竄話的分子機(jī)制是很有必要的。

2.4 KC可通過Fas/FasL途徑對肝臟造成損失 Fas是細(xì)胞表面重要的死亡受體，是細(xì)胞凋亡的信號分子。Fas與其配體FasL結(jié)合，活化并傳導(dǎo)凋亡信號，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑。有研究表明，當(dāng)肝臟發(fā)生衰竭時，KC被激活后，表達(dá)大量的FasL，同時受損傷的肝細(xì)胞表達(dá)大量的Fas，F(xiàn)as與FasL結(jié)合可觸發(fā)肝細(xì)胞的凋亡。Gallagher等[12]的研究顯示，從造模成功的肝衰竭大鼠肝臟中提取的KC高表達(dá)FasL mRNA，而且Fas也同時上調(diào)，從而介導(dǎo)受損的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，肝細(xì)胞大量壞死，進(jìn)而發(fā)生肝衰竭。朱人敏等[13]人通過對KC表達(dá)的Fas配體在急性胰腺炎并發(fā)肝損傷中的作用的研究結(jié)果表明急性胰腺炎通過上調(diào) KC FasL的生成介導(dǎo)了肝損傷， KC抑制劑GdCl，能通過抑制FasL的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)肝臟的作用。Mita等[14]對24名接受肝移植的暴發(fā)型肝衰竭（FHF）患者進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)FasL主要表達(dá)在肝臟巨噬細(xì)胞，通過Fas/FasL 途徑激活肝細(xì)胞的凋亡通路，從而造成嚴(yán)重的肝損傷。

3展望

KC特殊的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能， 以及他在肝臟和全身巨噬細(xì)胞中所處的地位和性質(zhì)， 決定了他在肝臟乃至全身天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)中具有的重要作用，是內(nèi)毒素性肝損害和多種肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，進(jìn)一步深入研究 KC的功能及其調(diào)控的分子機(jī)制顯得尤為重要。我們認(rèn)為在今后的研究工作中，深入揭示KC介導(dǎo)的免疫功能，及其對肝衰竭的調(diào)控機(jī)制，以及與鄰近細(xì)胞的相互作用可能對臨床的研究和治療具有指導(dǎo)意義。

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編輯/申磊