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    臍血干細(xì)胞移植聯(lián)合電針治療對損傷脊髓腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響

    2017-02-23 13:47:07梁希港陳方民楊成
    醫(yī)學(xué)信息 2016年35期
    關(guān)鍵詞:脊髓損傷電針

    梁希港 陳方民 楊成

    摘要:目的 觀察臍血干細(xì)胞(umbilical cord blood stem cells)移植聯(lián)合督脈電針治療對脊髓全橫斷損傷(spinal cord injury,SCI)大鼠的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響。方法 建立SD大鼠T10脊髓節(jié)段完全橫斷模型,隨機分為正常組、損傷模型組、督脈電針治療組、臍血干細(xì)胞移植組、督脈電針治療聯(lián)合臍血干細(xì)胞移植組(分別簡稱正常組、模型組、電針組、臍血組、聯(lián)合組),每組再分為3個時間段7 d、14 d、28 d,每組共大鼠18只。分別于7 d、14 d、28 d分離各組大鼠的脊髓組織,應(yīng)用免疫熒光、RT-PCR和Western Blot技術(shù)定位、定量檢測各組組織中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的表達變化。結(jié)果 電針治療組、臍血移植組和聯(lián)合組腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達都高于損傷模型組,臍血干細(xì)胞移植聯(lián)合電針治療組表達量最高。結(jié)論 結(jié)果顯示臍血干細(xì)胞移植和電針治療具有協(xié)同作用,能顯著提高腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達,對脊髓損傷的功能恢復(fù)有促進作用。

    關(guān)鍵詞:脊髓損傷;臍血干細(xì)胞;電針;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

    脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病,臨床康復(fù)治療效果仍不理想。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,神經(jīng)營養(yǎng)素家族的表達發(fā)生改變,這些改變與神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性有重要關(guān)系[1]。成年哺乳動物脊髓具有可塑性,且針刺可促進脊髓可塑性[2-6]。研究證實,督脈電針可以改善損傷局部組織的血液微循環(huán),促進腦脊液流動,減輕SCI部位的水腫、血腫的壓迫及粘連,抑制脊髓繼發(fā)性損傷,同時督脈電針治療可以促進SCI脊髓神經(jīng)軸突的再生[6]。在過去的幾年中,干細(xì)胞成為再生醫(yī)學(xué)的研究焦點。胚胎干細(xì)胞,盡管能夠分化成所有三個胚細(xì)胞譜系層,但是它的使用受到倫理問題的限制[7]。自從1974年Kandtzon等發(fā)現(xiàn)人臍血中存在造血干細(xì)胞后,國內(nèi)外學(xué)者對臍血干細(xì)胞的生物學(xué)、免疫學(xué)特性及臨床應(yīng)用進行了廣泛的研究[8],證實臍血可以作為一種新的干細(xì)胞來源治療惡性血液病、退行性疾病及修復(fù)神經(jīng)損傷等。目前,人臍血干細(xì)胞(human umbilical cord blood stem cell,hUCBSC)移植治療脊髓損傷是脊髓修復(fù)領(lǐng)域的研究熱點,在動物實驗中已取得滿意效果,并有初步的臨床研究。本研究將人臍血干細(xì)胞移植和督脈電針治療聯(lián)合應(yīng)用,觀察對脊髓損傷后BDNF表達的影響,以期為電針治療聯(lián)合臍血干細(xì)胞移植臨床應(yīng)用治療脊髓損傷提供理論和實驗依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1一般資料 實驗動物選擇與分組:90只成年雌性SD大鼠(SPF級),體重220~260 g,購自煙臺綠葉制藥有限公司。隨機分為5組,正常組、損傷對照(CT)組、督脈電針治療(EA)組、臍血干細(xì)胞移植(UCS)組、督脈電針治療聯(lián)合臍血干細(xì)胞移植(UCS+EA)組,每組18只。

    1.2方法

    1.2.1樣本獲取 ①造模后7,14,28 d各時間點每組隨機取3只大鼠,40 g/L多聚甲醛心臟灌注固定,取損傷處頭端長約1 cm脊髓組織,中性甲醛溶液后固定,石蠟包埋,切片。②造模后7,14,28 d各時間點每組隨機取3只大鼠,脊髓新鮮取材,置-80℃冰箱冷存,以備提取蛋白及mRNA。

    1.2.2免疫熒光組織化學(xué)觀察 取各組標(biāo)本石蠟切片,厚4 μm,常規(guī)脫臘至水;抗原修復(fù);山羊血清封閉;滴加兔抗大鼠BDNF單克隆抗體(1∶200,abcam公司),4℃過夜;Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶100,北京中杉金橋技術(shù)有限公司),37℃、30 min;DAPI復(fù)染;封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相。圖像經(jīng)LEICA QWin圖像處理與分析系統(tǒng)處理,統(tǒng)計陽性表達面積(m2)、平均灰度值,分析BDNF的陽性表達變化。

    1.2.3 RT-PCR檢測 采用Trizol試劑盒(Invitrogen公司),根據(jù)說明書操作,提取各組脊髓織中的總RNA,溶于20 μL DEPC-H2O,-80℃冰箱冷存。

    BDNF引物序列:上游:5'-ATAGCAGGGCAGTTGGACA-3';下游:5'-CACCTTGGCGATTACAGAAG-3';GAPDH序列:上游:5'-CGTGCCGCTGGAGAAACCTG-3';下游:5'-AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3'。

    加樣完成后離心,放入熒光定量PCR儀(ABI Prism?7300型,Corbett research公司,澳大利亞),按以下條件進行Real-time PCR反應(yīng):①步驟一:變性,重復(fù)1次,95℃,30 s;②步驟二:PCR反應(yīng),重復(fù)40次,95℃,5 s→60℃,34 s。

    每個待測樣品cDNA設(shè)置3個重復(fù),對得到的3個Ct值取平均值,用2-△△Ct[8,10]法進行計算最后與GAPDH進行校正后統(tǒng)計。

    1.2.4 Western Blot檢測 抽提28 d各組標(biāo)本總蛋白,采用BCA方法測定BDNF蛋白含量。依次經(jīng)5%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠、8%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜;5%脫脂奶粉封閉2 h;孵育袋內(nèi)根據(jù)需要加入兔抗大鼠抗體BDNF IgG,4℃孵育過夜;TBS-T洗膜;加入山羊抗兔HRP IgG,37℃,孵育1 h,TBS-T洗膜。膠片曝光、經(jīng)顯影、定影處理后觀察結(jié)果,掃描,采用Image J軟件分析。

    1.3統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)以(x±s)表示,用SPSS統(tǒng)計學(xué)軟件處理,兩組間差異比較選用t檢驗。

    2 結(jié)果

    2.1免疫熒光檢測大鼠脊髓損傷后不同時間點灰質(zhì)內(nèi)BDNF的表達變化 免疫熒光顯示BDNF陽性細(xì)胞染色呈紅色,輪廓清晰,主要為脊髓的星形膠質(zhì)細(xì)胞。建模后28 d,與對照組大鼠相比,PD大鼠脊髓組織中BDNF熒光強度分別增強了62.7%、49.1%和145%(P<0.05),見圖1。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):聯(lián)合組的BDNF表達量最高。

    圖1 免疫熒光結(jié)果

    2.2 RT-PCR檢測大鼠脊髓損傷后不同時間點BDNF mRNA的相對表達量 Real-time PCR結(jié)果顯示:BDNF在脊髓損傷大鼠脊髓組織中7 d組表達分別為(9.8±1.0)、(8.0±1.5)、(22.2±3.9),均較模型對照組(2.4±0.8)明顯升高(Fig.2A,B),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。14 d組表達分別為(3.8±0.7)、(7.9.0±1.3)、(13.2±1.6),均較模型對照組(0.4±0.05)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);28 d組表達分別為(3.4±0.7)、(2.2±0.4)、(5.2±1.0),均較模型對照組(0.4±0.07)明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Real-time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn):BDNFmRNA在模型組表達較低,在治療組的表達明顯升高。損傷7 d后明顯升高,并達到高峰,14 d和28 d表達量有所下降,但明顯高于模型組。

    2.3大鼠脊髓損傷后28dBDNF蛋白的表達變化 Western-Blot結(jié)果顯示:與模型組相比,建模后28 d,SCI大鼠脊髓組織BDNF的蛋白表達量分別增加了41.3%、3.5%和59.8%(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義,見圖2。

    圖2 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子在28 d組大鼠中蛋白表達水平

    3 討論

    脊髓損傷一直是醫(yī)學(xué)界面對的一大難題,它涉及損傷即刻的原發(fā)性損傷和后續(xù)的繼發(fā)性損傷。原發(fā)性損傷是直接損傷,多為不可逆的創(chuàng)傷性損傷;繼發(fā)性損傷為創(chuàng)傷后的病理生理過程,其損傷機制十分復(fù)雜[9]。

    干細(xì)胞的研究是一個快速發(fā)展的領(lǐng)域,人類臍血干細(xì)胞已經(jīng)證明在許多疾病模型中有肯定效果[10]。臍血干細(xì)胞有來源廣泛、低的免疫性、容易獲得等優(yōu)點。最主要的是他可以分化為不同的細(xì)胞,例如骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。然而如何能夠有效的將臍血干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為脊髓損傷后的細(xì)胞是一個具有挑戰(zhàn)性的技術(shù)難題。脊髓損傷治療目標(biāo)有兩個:挽救受損神經(jīng)元的繼發(fā)性損傷和死亡;促進神經(jīng)元軸突的再生。脊髓繼發(fā)性損傷是在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上,損傷局部發(fā)生的復(fù)雜的病理生理改變,包括缺血缺氧、興奮性氨基酸毒性、自由基生成、蛋白酶釋放、中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞活化以及周圍巨噬細(xì)胞浸潤導(dǎo)致的炎性反應(yīng)等。研究發(fā)現(xiàn),SCI后損傷脊髓局部BDNF免疫反應(yīng)陽性,星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加,SCI后1 w,大多數(shù)少突膠質(zhì)細(xì)胞呈BDNF免疫反應(yīng)陽性,提示BDNF與SCI后脊髓修復(fù)關(guān)系密切[11-12]。

    NTFs是軸突再生微環(huán)境中的一組重要因子,除對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有營養(yǎng)作用外,還可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù),如生長相關(guān)蛋白-43(growth associated protein-43,GAP-43)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、BDNF、神經(jīng)營養(yǎng)素等,其中BDNF是目前研究最為廣泛和深入的NTFs之一。研究表明,BDNF可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)增殖、分化,調(diào)節(jié)自由基代謝,減少自由基積聚,保護神經(jīng)元免受自由基的攻擊。本試驗中將臍血干細(xì)胞移植和電針治療結(jié)合起來,通過對檢測腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達量來評估兩者在脊髓損傷過程中的效果。從動物實驗的結(jié)果中可以看出,單純的臍血干細(xì)胞和電針治療都對脊髓損傷有一定的治療效果,而兩者的聯(lián)合呈現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢,提示在治療脊髓損傷的過程中聯(lián)合運用多種治療手段可起到很好的協(xié)同作用。有關(guān)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)在神經(jīng)細(xì)胞增殖分化的過程中的作用,對移植干細(xì)胞的分化方向等尚需進一步的研究。

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    編輯/羅茗柯

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