柿屬6種藥用植物營(yíng)養(yǎng)期葉片輔助鑒別研究

依澤+喬娟娟+陸耕宇+吳剛+謝國(guó)勇+秦民堅(jiān)

[摘要]為建立柿屬藥用植物的營(yíng)養(yǎng)期輔助鑒別方法，對(duì)該屬6種植物的葉片脈序、葉表皮形態(tài)、葉解剖結(jié)構(gòu)、葉粉末等特征進(jìn)行比較觀察。結(jié)果表明所觀察的該屬植物葉片的二級(jí)脈與三級(jí)脈具有鑒別意義； 該屬植物葉表皮皆具有單細(xì)胞非腺毛，大多具有腺毛； 個(gè)別種的粉末中可見(jiàn)石細(xì)胞。通過(guò)研究，獲得了柿屬藥用植物葉片的主要區(qū)別點(diǎn)，并據(jù)此建立了實(shí)用的鑒別檢索表，為柿屬藥用植物的營(yíng)養(yǎng)期鑒定和柿葉生藥基原植物的準(zhǔn)確鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]柿屬； 鑒定； 葉表皮； 葉脈； 解剖特征

[Abstract]To establish a method for the identification of five species and one variety of medicinal plants fromDiospyros， their leaf veins， epidermis， anatomic and powder characters were observed and compared with macro-morphological and microscopic methods. The results indicated the differences of secondary and tertiary veins among thoseDiospyros species. The single cell non-glandular hair and glandular hair exist in most species′ epidermis while stone cells were only found in the leaf powders of two species. Through the study， the main differences of leaf macro- and micro-morphology of these species were obtained and practical keys were also established， which can provide scientific base not only for identification of these species during their vegetative stages， but also for accuracy authentication of the source of Kaki Folium.

[Key words]Diospyros； identification； leaf epidermis； leaf vein； anatomic character

doi：10.4268/cjcmm20162110

柿屬Diospyros L.植物為落葉或常綠喬木或灌木，全世界約500種，主產(chǎn)于熱帶地區(qū)； 我國(guó)有57種，其中江蘇省有6種，1變種^[1]。柿屬植物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值較大，柿D. kaki Thunb.的果實(shí)可食用，亦可入藥，柿蒂為常用中藥材；柿葉被收載于《中國(guó)藥典》附錄^[2]，具有清熱解毒、潤(rùn)肺等作用；老鴉柿D. rhombifolia Hermsl.的根和枝入藥可活血利膽等^[3]。目前對(duì)柿屬植物的研究主要有化學(xué)成分、藥理作用、食品飲料的開(kāi)發(fā)等^[4-6]。

當(dāng)前全國(guó)正在開(kāi)展中藥資源普查試點(diǎn)工作^[7]。柿屬植物的營(yíng)養(yǎng)期較長(zhǎng)，其葉片大多橢圓狀卵形或倒卵形，極易混淆。在野生藥用植物外業(yè)調(diào)查過(guò)程中碰到的多是其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，這給野外藥用植物基原鑒定工作帶來(lái)了一定困難。

20世紀(jì)70年代初期，Hickey等^[8-9]闡釋了葉片宏觀形態(tài)系統(tǒng)研究的內(nèi)容及意義，已廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代植物學(xué)研究，并提供了重要的分類和鑒定依據(jù)^[10-12]。植物葉片的微觀形態(tài)特征是物種本身遺傳特征的反應(yīng)，具有一定的穩(wěn)定性，在一定程度上可用于探討屬下種間關(guān)系^[13]。因此，結(jié)合以上2種技術(shù)手段，可對(duì)易混淆植物物種做出比較可信的鑒別。

本文對(duì)江蘇省6種（5種1變種）柿屬植物從傳統(tǒng)的葉表皮微形態(tài)、葉解剖和葉粉末特征等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察，同時(shí)引進(jìn)了植物葉片脈序的比較研究，并制定了鑒別檢索表，為柿屬植物生藥基原的準(zhǔn)確性鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 植物

6種柿屬藥用植物的葉片采集自中國(guó)藥科大學(xué)藥用植物園、方山國(guó)家地質(zhì)公園、南京市中山植物園，每種植物均采集不同成熟度的葉片，采集不少于3棵植株，經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)中藥資源學(xué)教研室秦民堅(jiān)教授鑒定為柿D. kaki、老鴉柿D. rhombifolia、美洲柿D. virginiana L.、油柿D. oleifera Cheng、野柿D. kaki var.silvestris Makino、山柿D. japonica Siebold et Zucc.，憑證標(biāo)本保存于中藥藥科大學(xué)中藥資源學(xué)教研室（表1）。通過(guò)同種葉片葉表觀結(jié)構(gòu)特征比較，對(duì)比特征出現(xiàn)的幾率來(lái)選取最有代表性的材料。

1.2 儀器

NIKON ECLIPSE E200顯微鏡、HISTOSTAT 820石蠟切片機(jī)、脫影板、NIKON D7000相機(jī)。

2 方法

采集的實(shí)驗(yàn)材料經(jīng)凈制后，每種取4～5枚具有代表性的葉片制作臘葉標(biāo)本作為憑證，其余葉片按如下方法處理。

2.1 透明葉的制作

為了使葉脈清晰可見(jiàn)，一般采取如下操作步驟（根據(jù)葉片的質(zhì)地不同，具體可進(jìn)行調(diào)整）：取代表性的完整新鮮葉片置于合適大小培養(yǎng)皿中，加適量5% NaOH溶液透化至淡茶色或顏色不再變淡。傾去培養(yǎng)皿中的NaOH溶液，并小心沖去葉表面殘留的NaOH溶液，然后向培養(yǎng)皿中加入4.5%～5.5%的次氯酸鈉溶液至浸沒(méi)葉片，1 min后，傾出次氯酸鈉溶液（回收），加入RO（reverses osmosis， 超純水）水浸沒(méi)葉片，直至葉片顏色變白。傾去RO水，用0.5%的番紅水溶液（或酸性品紅溶液）均勻染于葉片上30 min左右，用流動(dòng)的RO水洗去葉片表面的浮色，繼續(xù)以25%，50%梯度的乙醇溶液進(jìn)行脫水、分色，可使用搖床使其分色更加均勻，直至主脈與各級(jí)脈清晰可見(jiàn)，最后轉(zhuǎn)移至脫影板上拍攝。

整體葉脈圖像在背光微距拍攝后，需要在顯微鏡下對(duì)葉脈細(xì)微的結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步拍攝，以展示一些次級(jí)脈結(jié)構(gòu)和脈附屬結(jié)構(gòu)。

2.2 葉表皮片的制作

取新鮮葉片，洗凈，撕取上下表皮，刮去殘留在上面的葉肉，以水裝片，置顯微鏡下觀察。對(duì)于親水性差的葉片可采用水合氯醛試液裝片；對(duì)于表皮難撕取的葉片，若葉片較為革質(zhì)，可用薄刀片將上表皮削下，裝片觀察上表皮。再將中間葉肉刮去至下表皮露出，將下表皮分離下來(lái)，裝片觀察；若葉片較為草質(zhì)，可切取不含主脈的0.5 cm×0.5 cm小塊，置于5%的次氯酸鈉溶液中浸泡至白色再觀察；此外，還可用寬膠帶撕取結(jié)合次氯酸鈉離析的方法^[14]。

2.3 葉結(jié)構(gòu)解剖方法

每種取10余枚新鮮葉片，每枚葉片切取含有主脈的1 cm×1 cm小塊，裝入FAA固定液中（福爾馬林-乙酸-70%乙醇 1∶1∶18）固定24 h以上。取固定好的材料，以常規(guī)石蠟切片法切片，番紅-固綠染色，得到含有主脈的葉橫切面切片。

2.4 葉粉末制片的方法

每種取數(shù)十枚葉片陰干至水分小于14%，粉碎，過(guò)4號(hào)篩^[2]。取篩后的粉末適量，加水合氯醛加熱透化，甘油酒精裝片。

2.5 圖像處理

使用顯微鏡系統(tǒng)圖像處理軟件，Photoshop，LEAFGUI^[15]等專業(yè)軟件對(duì)獲得的脈序特征、葉表皮特征、葉主脈橫切面特征、葉粉末特征等圖像進(jìn)行分析處理，并加以描述。葉脈術(shù)語(yǔ)參照B Ellis等編著的《葉結(jié)構(gòu)手冊(cè)》^[16]。

3 結(jié)果

3.1 脈序特征

3.1.1 柿 主脈羽狀，少見(jiàn)梳狀脈。粗二級(jí)脈簡(jiǎn)單弓形，間距不規(guī)則。二級(jí)脈間三級(jí)脈為對(duì)生、V形的貫穿脈，其向軸端與中脈夾角近似直角。中脈上三級(jí)脈為對(duì)生貫穿脈，其基部與中脈夾角為銳角，頂端向基部彎曲（圖1A）。四級(jí)脈呈不規(guī)則網(wǎng)狀，五級(jí)脈呈自由分支狀。游離段小脈多數(shù)不分支，少數(shù)具一個(gè)分支，具有簡(jiǎn)單的末端。邊緣末級(jí)脈環(huán)狀（圖2A，3A）。

3.1.2 老鴉柿 主脈羽狀，無(wú)梳狀脈。粗二級(jí)脈花環(huán)狀弓形，間距基部漸減。二級(jí)脈間三級(jí)脈呈不規(guī)則網(wǎng)狀。中脈上三級(jí)脈網(wǎng)狀，邊緣三級(jí)脈環(huán)狀（圖1B）。四級(jí)脈呈不規(guī)則網(wǎng)狀，五級(jí)脈呈自由分支狀。游離段小脈多數(shù)具有1個(gè)分支，少數(shù)均等分支，具有簡(jiǎn)單的末端。邊緣末級(jí)脈環(huán)狀（圖2B，3B）。

3.1.3 美洲柿 主脈羽狀，無(wú)梳狀脈。粗二級(jí)脈簡(jiǎn)單弓形，間距不規(guī)則。二級(jí)脈間三級(jí)脈呈不規(guī)則網(wǎng)狀。中脈上三級(jí)脈網(wǎng)狀，邊緣三級(jí)脈環(huán)狀（圖1C）。四級(jí)脈呈不規(guī)則網(wǎng)狀，五級(jí)脈呈自由分支狀。游離段小脈多數(shù)不分支并具有簡(jiǎn)單的末端。邊緣末級(jí)脈環(huán)狀（圖2C，3C）。

3.1.4 油柿 主脈羽狀，具復(fù)合梳狀脈。粗二級(jí)脈簡(jiǎn)單弓形，細(xì)二級(jí)脈簡(jiǎn)單弓形，粗二級(jí)脈間距不規(guī)則。二級(jí)脈間三級(jí)脈為對(duì)生、外凸形的貫穿脈，其向軸端與中脈夾角約為直角，角度穩(wěn)定。中脈上三級(jí)脈為對(duì)生的貫穿脈，其基部與中脈夾角為銳角，頂部平行于二級(jí)脈間的三級(jí)脈。邊緣三級(jí)脈環(huán)狀（圖1D）。四級(jí)脈呈不規(guī)則網(wǎng)狀，五級(jí)脈呈自由分支狀。游離段小脈多數(shù)具分支，并具有簡(jiǎn)單的末端。邊緣末級(jí)脈環(huán)狀（圖2D，3D）。

3.1.5 野柿 主脈羽狀，無(wú)梳狀脈。粗二級(jí)脈簡(jiǎn)單弓形，間距不規(guī)則。二級(jí)脈間三級(jí)脈為對(duì)生、波狀的貫穿脈，其向軸端與中脈夾角為鈍角，角度不穩(wěn)定。中脈上三級(jí)脈網(wǎng)狀。邊緣三級(jí)脈環(huán)狀（圖1E）。四級(jí)脈呈不規(guī)則網(wǎng)狀，五級(jí)脈呈自由分支狀。游離段小脈多數(shù)具1個(gè)分支，并具有簡(jiǎn)單的末端。邊緣末級(jí)脈不完整（圖2E，3E）。

3.1.6 山柿 主脈羽狀，無(wú)梳狀脈。粗二級(jí)脈簡(jiǎn)單弓形，間距不規(guī)則。二級(jí)脈間三級(jí)脈為對(duì)生、外凸的貫穿脈，其向軸端與中脈夾角為鈍角，角度不穩(wěn)定。中脈上三級(jí)脈網(wǎng)狀，邊緣三級(jí)脈環(huán)狀（圖1F）。四級(jí)脈呈不規(guī)則網(wǎng)狀，五級(jí)脈呈自由分支狀。游離段小脈多數(shù)具一個(gè)分支并具有簡(jiǎn)單的末端。邊緣末級(jí)脈不完整（圖2F，3F）。

3.1.7 脈序特征差異及檢索表 通過(guò)觀察以上特征，總結(jié)了6種植物其脈序特征的主要區(qū)別點(diǎn)（表2）， 并結(jié)合葉表觀性狀建立了鑒定檢索表（表3）。其中，由于山柿和野柿的葉脈特征極其相似，但是葉形區(qū)別較大，因此在甄別兩者時(shí)，引入了葉形加以輔助鑒別。

3.2 葉表皮特征

3.2.1 柿 上表皮細(xì)胞多角形，垂周壁平直，無(wú)氣孔和毛茸。下表皮細(xì)胞多角形，垂周壁微彎曲；腺毛、非腺毛常見(jiàn)，腺毛頭部1～2細(xì)胞，柄4～5細(xì)胞；非腺毛單細(xì)胞，長(zhǎng)圓錐形，有的彎曲；氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～5個(gè)（圖4A，5A）。

3.2.2 老鴉柿 上表皮細(xì)胞不規(guī)則形，垂周壁淺波狀，無(wú)氣孔與毛茸。下表皮細(xì)胞不規(guī)則形，垂周壁淺波狀；腺毛和非腺毛多見(jiàn)，腺毛頭部1～2細(xì)胞，柄4～6細(xì)胞；非腺毛單細(xì)胞，長(zhǎng)圓錐形，有的彎曲；氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～6個(gè)（圖4B，5B）。

3.2.3 美洲柿 上表皮細(xì)胞多角形，垂周壁平直，無(wú)氣孔與毛茸。下表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，垂周壁淺波狀；非腺毛少見(jiàn)，單細(xì)胞，長(zhǎng)圓錐形；氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～6個(gè)（圖4C，5C）。

3.2.4 油柿 上表皮細(xì)胞多角形，垂周壁較平直。下表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，垂周壁淺波狀。腺毛和非腺毛常見(jiàn)與上下表皮，腺毛頭部1～2細(xì)胞，柄3～4細(xì)胞；非腺毛單細(xì)胞，長(zhǎng)圓錐形，有的彎曲。氣孔只存在于下表皮，不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～5個(gè)（圖4D，5D）。

3.2.5 野柿 上表皮細(xì)胞多角形，垂周壁較平直，無(wú)氣孔，但可見(jiàn)長(zhǎng)條形非腺毛，單細(xì)胞。下表皮細(xì)胞類圓形，垂周壁微彎曲；腺毛、非腺毛常見(jiàn)，腺毛頭部細(xì)胞1個(gè)，柄部細(xì)胞2～4個(gè)；非腺毛單細(xì)胞，長(zhǎng)圓錐形，有的彎曲；氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～6個(gè)（圖4E，5E）。

3.2.6 山柿 上表皮細(xì)胞多角形，垂周壁平直，無(wú)氣孔和毛茸。下表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，垂周壁微彎曲；非腺毛多見(jiàn)，單細(xì)胞，長(zhǎng)圓錐形；氣孔不定式，副衛(wèi)細(xì)胞4～6個(gè)（圖4F，5F）。

3.3 葉主脈橫切面特征

3.3.1 柿 上下表皮均由1列細(xì)胞組成；下表皮常見(jiàn)腺毛和非腺毛。柵欄組織細(xì)胞1列，長(zhǎng)約70～80 μm；海綿組織較厚，由6～8列細(xì)胞組成，細(xì)胞類圓形，有的細(xì)胞含草酸鈣方晶。主脈維管束外韌型，呈月牙狀，纖維多于韌皮部外側(cè)聚集成束，周?chē)”诩?xì)胞常含草酸鈣方晶，主脈上下表皮內(nèi)側(cè)有2～3列厚角細(xì)胞（圖6A）。

3.3.2 老鴉柿 葉肉柵欄組織細(xì)胞長(zhǎng)約60～80 μm；海綿組織由4～5列細(xì)胞組成。其余特征同柿（圖6B）。

3.3.3 美洲柿 下表皮偶見(jiàn)非腺毛，近無(wú)腺毛。葉肉柵欄組織細(xì)胞長(zhǎng)約40～60 μm；海綿組織由4～5列細(xì)胞組成。纖維單個(gè)散在或聚集成束。其余特征同柿（圖6C）。

3.3.4 油柿 上下表皮均可見(jiàn)腺毛和非腺毛。葉肉柵欄組織細(xì)胞長(zhǎng)約40～45 μm；海綿組織由4～5列細(xì)胞組成。維管束與葉肉之間有石細(xì)胞，單個(gè)或成群；纖維單個(gè)散在或聚集成束。主脈上下表皮內(nèi)側(cè)有4～5列厚角細(xì)胞。其余特征同柿（圖6D）。

3.3.5 野柿 上表皮少見(jiàn)非腺毛；下表皮可見(jiàn)腺毛和非腺毛。葉肉柵欄組織細(xì)胞長(zhǎng)約40～50 μm；海綿組織由4～5列細(xì)胞組成。主脈維管束呈“U”字形，纖維單個(gè)散在或聚集成束。其余特征同柿（圖6E）。

3.3.6 山柿 下表皮非腺毛，腺毛近無(wú)。柵欄組織細(xì)胞長(zhǎng)約75～85 μm；海綿組織由5～7列細(xì)胞組成。維管束與葉肉之間有石細(xì)胞，單個(gè)或成群；纖維單個(gè)散在或聚集成束。其余特征同柿（圖6F）。

3.4 葉粉末特征

3.4.1 柿 粉末深綠色。纖維常聚集成束，周?chē)”诩?xì)胞中常含草酸鈣方晶，形成晶鞘纖維。草酸鈣方晶隨處可見(jiàn)。導(dǎo)管多為梯紋。腺毛頭部1～2細(xì)胞，柄4～5細(xì)胞；非腺毛單細(xì)胞，長(zhǎng)圓錐形，彎曲（圖7A）。

3.4.2 老鴉柿 粉末棕綠色。其余特征同柿（圖7B）。

3.4.3 美洲柿 粉末棕綠色。纖維單個(gè)散在或聚集成束。非腺毛少見(jiàn)，微彎曲，腺毛近無(wú)。其余特征同柿（圖7C）。

3.4.4 油柿 粉末灰綠色。纖維單個(gè)散在或聚集成束。石細(xì)胞長(zhǎng)圓形，有的呈分枝狀，壁厚。腺毛頭部1～2細(xì)胞，柄3～4細(xì)胞。其余特征同柿（圖7D）。

3.4.5 野柿 粉末灰綠色。纖維單個(gè)散在或聚集成束。腺毛頭部細(xì)胞1個(gè)，柄部細(xì)胞2～4個(gè)。其余特征同柿（圖7E）。

3.4.6 山柿 粉末污綠色。纖維單個(gè)散在或聚集成束。非腺毛微彎曲，近無(wú)腺毛。石細(xì)胞不規(guī)則形，多呈分枝狀，壁厚。其余特征同柿（圖7F）。

3.5 粉末特征差異及檢索表

觀察以上特征（3.2～3.4）總結(jié)了6種柿屬植物的葉表皮特征、葉主脈橫切面特征和葉粉末特征的主要區(qū)別點(diǎn)（表4），并以此依據(jù)建立了顯微特征鑒定檢索表（表5）。

4 討論

柿葉作為傳統(tǒng)的中草藥，在民間有著長(zhǎng)久的應(yīng)用歷史。柿葉不僅作為茶飲，還作為原料應(yīng)用于一些常用中成藥制劑當(dāng)中。被2015年版《中國(guó)藥典》收載的就有心舒寧片、婦炎凈膠囊、腦心清片，其中腦心清片用到了柿葉提取物，并制定了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)。

《中國(guó)藥典》附錄收載的柿葉來(lái)源為柿樹(shù)D. kaki的干燥葉，但在實(shí)際藥材流通過(guò)程中同屬的其他植物，由于其形態(tài)的相似性，存在混同使用的可能性，這會(huì)在一定程度上造成用藥基原的混亂。柿屬植物的分類鑒定，主要是依據(jù)其果實(shí)的形態(tài)。如果能從植物營(yíng)養(yǎng)器官如葉片形態(tài)上加以區(qū)分，對(duì)藥材的實(shí)際采收過(guò)程，以及柿葉藥材真?zhèn)舞b別等方面，都具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

甄漢深等^[17]研究并描述了柿葉的藥材性狀與粉末顯微特征；嚴(yán)鑄云^[18]從生藥學(xué)的角度比較了川產(chǎn)柿葉與近緣種的特征區(qū)別。不同于上述的研究，本文引入了葉脈特征、表皮特征及葉解剖特征進(jìn)行比較分析，并制定了基于營(yíng)養(yǎng)器官特征的檢索表。這樣在藥材采集中遇到柿屬植物營(yíng)養(yǎng)器官就可以通過(guò)較為簡(jiǎn)便的撕取表皮片和葉脈特征觀察做出判斷，對(duì)于準(zhǔn)確用藥起到輔助作用。

柿葉雖然被應(yīng)用于多個(gè)中成藥制劑中，但是目前只有提取物的標(biāo)準(zhǔn)。在2015年版《中國(guó)藥典》中并沒(méi)有“柿葉”藥材的標(biāo)準(zhǔn)，這是亟待去完善的。本研究一方面對(duì)常見(jiàn)柿屬基原植物進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)期鑒別的研究，為其準(zhǔn)確用藥提供支持；同時(shí)也完善了柿葉藥材的部分標(biāo)準(zhǔn)，為今后藥典標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了一定的依據(jù)。

葉片是植物營(yíng)養(yǎng)器官中相對(duì)特征顯著和易于觀察的部位，通過(guò)研究找到一定的葉表觀特征參數(shù)可區(qū)分不同的物種。由于實(shí)用性強(qiáng)，基于植物營(yíng)養(yǎng)期輔助鑒別的工作近年來(lái)越來(lái)越受到重視，有學(xué)者提出了諸如“比較解剖學(xué)”、“植紋”、“脈序圖譜”、“葉表皮微形態(tài)”等概念^{[10，19-21]}。本研究從葉脈的形態(tài)入手探討柿屬易混淆藥用植物的區(qū)別，并輔助以其他的營(yíng)養(yǎng)器官特征進(jìn)行鑒別，是中藥材采集、用藥過(guò)程中基原快速準(zhǔn)確判定的一種有益的嘗試。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]