微波輔助提取白背毛木耳多糖的工藝優(yōu)化及抗氧化性研究

楊申明+王振吉+管春平+代東

摘要：采用微波輔助提取白背毛木耳（Auricularia polytricha）多糖，通過單因素試驗和正交試驗對多糖提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化，并研究所提取的多糖對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用。結(jié)果表明：多糖的最佳提取工藝參數(shù)為微波時間3.0 min、料液比1 ∶[KG-3]45（g/mL）、微波功率640 W；在此條件下多糖平均提取率為14.87%，平均加樣回收率為98.25%；多糖對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率最大分別為44.57%和60.68%。本試驗首次測定了白背毛木耳多糖的抗氧化活性，為白背毛木耳多糖的開發(fā)利用提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：白背毛木耳；多糖；正交試驗；活性氧自由基

中圖分類號： TS201.1文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0357-03

白背毛木耳（Auricularia polytricha）屬于真菌門擔(dān)子菌綱銀耳目黑木耳科黑木耳屬[1]，是從臺灣引進的一種毛木耳新品種。它是一種藥食兩用食用菌，分布于全國各地，營養(yǎng)成分種類齊全，含量豐富，具有較高營養(yǎng)價值。白背毛木耳作蔬菜食用，可烹制出多種菜肴，風(fēng)味獨特，深受廣大消費者的喜愛。它性味甘平，具有補益氣血、潤肺止咳、止血等功效，在民間常用于氣血兩虧，肺虛咳嗽、咯血、吐血及痔瘡出血等癥狀。有研究表明，毛木耳多糖作為一種重要的生物活性物質(zhì)，在疑難病癥的治療方面有較好的療效，特別在抗凝血和降血脂、增強免疫細胞、抗腫瘤、抗氧化和防治心血管疾病等方面具有較好的效果[2-3]。

多糖類化合物具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗衰老、抗疲勞以及抗凝血、抗炎、抗菌、抗驚厥、鎮(zhèn)靜、止喘及降血壓等[4-6]多種生物活性及藥理作用，很可能是白背毛木耳抗凝血、增強免疫細胞和抗腫瘤的有效成分之一。目前，白背毛木耳的研究主要集中在栽培技術(shù)方面，而對其多糖的開發(fā)和利用研究相對較少，張丹鳳等對白背毛木耳胞內(nèi)多糖和胞外多糖的提取與純化進行了研究[7]，魏燕平等對白背木耳子實體多糖和胞內(nèi)多糖提取方法進行了研究[8]。但有關(guān)白背毛木耳多糖的提取工藝及抗氧化性的研究尚未見相關(guān)報道。本研究采用微波輔助提取白背毛木耳多糖，通過單因素試驗和L9（33）正交試驗對多糖提取工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，并研究了所提取的多糖對于活性氧自由基的清除作用，為白背毛木耳多糖的開發(fā)利用提供了科學(xué)的依據(jù)和參考。

1材料與方法

1.1試驗材料與試劑

白背毛木耳采自云南省楚雄市東華鎮(zhèn)，經(jīng)鑒定為黑木耳屬毛木耳種。樣品依次用自來水、蒸餾水洗凈后置于（50 ℃）干燥箱中烘干，用植物粉碎機粉碎后過40目篩，得白背毛木耳干粉，備用。葡萄糖對照品（HPLC≥98%），其他試劑均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1白背毛木耳多糖的提取準確稱取3份白背毛木耳干粉各2.00 g，用90 mL蒸餾水在功率680 W處微波提取 3.0 min，提取完后減壓抽濾，濃縮濾液，濾液用sevag法[9]除蛋白后，再往濾液中加入4倍體積的95%乙醇沉淀多糖，靜止24 h，將醇沉后的白色絮狀物進行離心，得白背毛木耳多糖。將白背毛木耳多糖全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，搖勻，然后再準確吸取上述制備液1.00 mL用蒸餾水定容至100 mL容量瓶中，搖勻，得供試品溶液。

1.2.2葡萄糖標準曲線的建立及白背毛木耳多糖含量的測定采用苯酚-濃硫酸法測多糖含量，參照文獻[10]的方法繪制標準曲線。以吸光度（D）為縱坐標，葡萄糖濃度（C，mg/mL）[JP3]為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程式：y=15.652x-0006 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 1，表明葡萄糖在0.00～0.06 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。

準確吸取待測液2.00 mL，加入1.00 mL新配制的5%苯酚溶液，參照文獻[10]繪制標準曲線，測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算白背毛木耳多糖含量。

1.2.3提取工藝單因素試驗參照文獻[11]的方法，分別考察單因素影響：（1）選擇微波時間分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 min進行比較，料液比1 g ∶[KG-3]40 mL，微波功率 640 W；（2）確定了微波時間3.0 min提取效果較好后，分別在料液比為1 ∶[KG-3]25、1 ∶[KG-3]30、1 ∶[KG-3]35、1 ∶[KG-3]40、1 ∶[KG-3]45、1 ∶[KG-3]50（g ∶[KG-3]mL）的條件下微波提取，微波功率640 W；（3）確定了料液比1 g ∶[KG-3]40 mL提取效果較好后，分別在100、160、320、480、640、800 W 的條件下進行微波提取3.0 min，從而確定各因素的影響作用。

1.2.4提取工藝參數(shù)優(yōu)化在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以微波時間、料液比和微波功率為考察因素，以白背毛木耳多糖提取率為評價指標，設(shè)計L9（33）正交試驗優(yōu)化提取工藝參數(shù)。因素及水平見表1。

1.2.7白背毛木耳多糖抗氧化性測定白背毛木耳多糖對·OH的清除作用，參照Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型，參考文獻[12]的方法。將待測樣品的濃度分別換為 0.005 9、0.011 8、0.017 7、0.023 6、0.029 5 mg/mL，其他操作按參考文獻的方法進行試驗。按下式計算清除率：

[JZ（]·OH清除率=[D0-（Dx-Dx0）]/D0×100%[JZ）]。

式中：D0為空白對照液的吸光度；Dx為待測樣品液吸光度；Dx0為本底吸光度。

白背毛木耳多糖對 O-2[KG-2]· [KG-3]的清除作用采用鄰苯三酚自氧化法測定，參考文獻[13]的方法。將待測樣品的濃度分別換為0.005 9、0.011 8、0.017 7、0.023 6、0.029 5 mg/mL，其他操作按參考文獻的方法進行。按下式計算清除率：

[JZ]O-2[KG-2]· [KG-3]清除率=（F0-Fx）/F0×100%。

式中：F0為空白對照的吸光度隨時間的變化率，F(xiàn)x為待測樣品吸光度隨時間的變化率。

2結(jié)果與分析

2.1提取工藝單因素試驗結(jié)果

2.1.1微波時間對多糖提取效果的影響如圖1所示，微波時間對白背毛木耳多糖的提取效果有一定影響，開始隨著微波時間的增加，多糖提取率提高，當微波時間為3.0 min時提取率最高，之后隨著微波時間的增加，多糖提取率呈下降趨勢。說明有少部分多糖被降解了，微波時間過長，使局部溫度和壓強過大，使多糖發(fā)生變性或結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定的大分子多糖斷裂而損失。因此選擇微波時間為2.0～4.0 min用于進一步優(yōu)化試驗。

2.1.2料液比對多糖提取效果的影響如圖2所示，料液比對白背毛木耳多糖的提取效果有一定影響，剛開始增加很明顯后緩慢增加，當料液比達1 g ∶[KG-3]40 mL時多糖提取率最大，之后隨著料液比的繼續(xù)增大多糖提取率略有降低，可能是因

為隨著溶劑進一步增加，溫度上升趨于緩慢，能耗效率下降，同時雜質(zhì)溶出增加，相當于多糖被稀釋，得率反而降低。從節(jié)約方面考慮，選擇料液比1 g ∶[KG-3]（35～45） mL用于進一步優(yōu)化試驗。

2.1.3微波功率對多糖提取效果的影響如圖3所示，微波功率對白背毛木耳多糖的提取效果有一定的影響，多糖得率隨微波功率的升高而增加，當微波功率為640 W時提取率最高，之后隨著微波功率的繼續(xù)升高，多糖提取率呈下降趨勢，可能是微波功率過高使少量多糖降解。因此選擇微波功率為480～800 W用于進一步優(yōu)化試驗。

[FK（W11][TPYSM33.tif][FK）]

2.2提取工藝參數(shù)優(yōu)化

從表2分析可知，各因素對白背毛木耳多糖提取率的影響程度依次為C﹥B﹥A，即微波功率﹥料液比﹥微波時間。優(yōu)化后得最佳提取工藝為A2B3C2，即微波時間3.0 min，料液比1 g ∶[KG-3]45 mL，微波功率640 W。在此條件下進行重復(fù)性試驗，測得白背毛木耳樣品中多糖平均提取率為14.87%。

2.3重復(fù)性試驗結(jié)果

[CM（24]結(jié)果平均吸光度為0.925，相對標準偏差RSD值為

2.4回收率試驗結(jié)果

結(jié)果平均回收率為98.25%，相對標準偏差RSD值為 0.85%，表明該方法加樣回收率較高，相對標準偏差較小，測定的準確度較高。

2.5多糖對·OH和 O-2[KG-2]· [KG-3]的清除作用

如表3所示，白背毛木耳多糖對·OH和 O-2[KG-2]· [KG-3]具有清除作用，且在試驗濃度0.005 9～0.029 5 mg/mL 范圍內(nèi)，隨著多糖濃度的升高，清除率也逐漸增加，即清除率與多糖的濃度存在著一定的量效關(guān)系。

3結(jié)論與討論

多糖的提取方法有很多[14-16]，本試驗采用微波輔助水提法從白背毛木耳中提取多糖，經(jīng)單因素試驗和正交試驗結(jié)果表明，微波功率、料液比、微波時間各因素對白背毛木耳多糖提取效果的影響程度不同，其影響的主次順序分別為微波功率﹥料液比﹥微波時間。優(yōu)化后的最佳提取工藝參數(shù)為：微波時間3.0 min、料液比1 g ∶[KG-3]45 mL、微波功率640 W。在此條件下，白背毛木耳多糖平均提取率為14.87%，RSD值為 0.47%，平均回收率為98.25%，RSD值為0.85%。該提取方法快速簡便，準確度高，重復(fù)性好，可作為提取和測定白背毛木耳多糖含量的一種有效方法。

該研究采用體外模型從羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除能力2個方面評價其抗氧化性，試驗結(jié)果表明，白背毛木耳多糖提取物具有一定的清除羥基自由基和超氧陰離子自由基的能力，且隨提取物多糖濃度的升高，對羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率能力增加，在所試濃度0.005 9～0.029 5 mg/mL 范圍內(nèi)，羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除率最大分別為44.57%和60.68%，說明白背毛木耳多糖具有一定的抗氧化活性，可作為抗氧化的功能性食品進一步開發(fā)利用。

本研究結(jié)果表明，白背毛木耳中富含多糖類化合物，白背毛木耳多糖具有很強的抗氧化活性，有關(guān)研究結(jié)果對白背毛木耳的進一步開發(fā)和綜合利用具有重要的意義。但本研究僅對白背毛木耳多糖提物進行體外抗氧化活性評價，有必要在此基礎(chǔ)上對白背毛木耳多糖的體內(nèi)抗氧化活性進行研究，為開發(fā)安全性高的天然抗氧化劑和保健產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)和參考。

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