牦牛和雄性不育犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因表達(dá)

王鵬非+黃林+唐會(huì)會(huì)+金素鈺+鄭玉才

摘要：為探索牦牛（Bos grunniens）雜交后代（犏牛）雄性不育的分子機(jī)制，比較了牦牛及其雜交后代睪丸中兩種精蛋白（Prm）基因的表達(dá)。從成年牦牛（n=13）和犏牛（n=7）睪丸中提取總RNA，定量PCR分析表明，犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因的mRNA水平均極顯著低于牦牛（P<0.01），這將影響正常精子發(fā)生的過程，推測(cè)可能與犏牛雄性不育有一定關(guān)系。

關(guān)鍵詞：牦牛（Bos grunniens）；雜交雄性不育；睪丸；Prm1；Prm2

中圖分類號(hào)：S823.8+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）20-5375-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.053

Abstract： To elucidate the molecular mechanism of hybrid male sterility of yak， the expressions of two protamines （Prm） between yak and its hybrid （cattle-yak） was compared. Total RNA was extracted from the testes of yaks （n=13） and cattle-yaks（n=7），and quantative PCR analysis showed that the testicular Prm1 and Prm2 mRNA levels in cattle-yaks were significantly lower than those of yaks（P<0.01），which may affect normal spermatogenesis， and thus we speculate that the significantly reduced mRNA levels of the two gene might associate with the male sterility of cattle-yak.

Key words： yak（Bos grunniens）； hybrid male sterility； testis； Prm1； Prm2

牦牛（Bos grunniens）是適應(yīng)青藏高原低氧環(huán)境的特有牛種。牦牛與普通牛的雜交后代（稱犏牛）在產(chǎn)乳、產(chǎn)肉等方面具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，但表現(xiàn)為回交三代內(nèi)雄性不育[1]，而雌性雜交后代生殖正常，其分子機(jī)制一直未闡明。研究表明，很多基因在犏牛睪丸中的mRNA水平都低于其親本牦牛和黃牛，如SYCP3、Boule、Dazl、Dmc1等基因[2-4]。牦牛和犏牛睪丸蛋白質(zhì)組學(xué)研究也發(fā)現(xiàn)，與牦牛相比，犏牛睪丸中大多數(shù)蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)[5]。

精蛋白（Protamine）是在精子細(xì)胞形成后期合成的，富含精氨酸，是主要的精子核蛋白，能結(jié)合DNA并使精子細(xì)胞基因組濃縮為非活性狀態(tài)[6]。哺乳動(dòng)物中包括精蛋白1（P1）和精蛋白2（P2）家族研究的最多，分別由Prm1和Prm2基因編碼，前者存在于所有哺乳動(dòng)物中，包裝精子DNA；而Prm2僅存在于靈長(zhǎng)類、多數(shù)嚙齒類和其他胎盤哺乳類亞類中，是精子發(fā)揮功能所必需的[6]。人類精子中Prm1與Prm2基因的表達(dá)水平相近，二者比例的升高或降低均可能與男性不育關(guān)聯(lián)[7]。本研究對(duì)成年牦牛和雄性不育犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因mRNA水平進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，以探索其與犏牛雄性不育之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

選擇健康的成年麥洼牦牛13頭和成年雄性不育犏牛7頭（公黃牛與母麥洼牦牛的雜交后代），于秋季屠宰時(shí)迅速采集睪丸，縱切面剖開成若干小塊后用干冰帶回實(shí)驗(yàn)室，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

試劑：Trizol Reagent購自美國Ambion公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購自美國Thermo Scientific公司；QuantiFast SYBR Green PCR Kit購自德國QIAGEN公司。

儀器：C1000 Thermal Cycler梯度PCR儀、C1000 Touch Thermal Cycler熒光定量PCR儀、Versa Doc 1000凝膠成像系統(tǒng)均為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.3 睪丸總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照試劑盒說明書用Trizol法提取牦牛和犏牛睪丸總RNA，經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度和質(zhì)量。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit以2 μg總RNA為模板，利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA備用。

1.4 睪丸Prm1和Prm2基因的定量分析

以普通牛Prm1（NM_174156）、Prm2（NM_174157）和普通牛內(nèi)參基因GAPDH （NM_001034034）、18s RNA（NR_036642）為模板，設(shè)計(jì)定量PCR引物（表1）。對(duì)2個(gè)目的基因和2個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后經(jīng)10倍梯度稀釋作為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，并用定量PCR儀上的軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以反轉(zhuǎn)錄的牦牛和犏牛睪丸cDNA為模板，采用熒光定量PCR方法分析Prm1基因和Prm2基因的相對(duì)表達(dá)量。25 μL的熒光定量PCR體系包括：2×Quanti Fast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上、下游引物各1 μL、模板cDNA 1 μL、RNase-free water 9.5 μL。PCR條件：95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性15 s，64 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)；65 ℃～95 ℃制作融解曲線。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用2-△△Ct法計(jì)算Prm1和Prm2基因在睪丸中的相對(duì)表達(dá)水平[8]。用雙內(nèi)參GAPDH和18sRNA的幾何平均數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以牦牛睪丸的表達(dá)量為對(duì)照。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，用SPSS18.0軟件對(duì)熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)Prm1和Prm2 mRNA水平的熒光定量PCR方法建立

本試驗(yàn)提取的牦牛和犏牛睪丸RNA質(zhì)量經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀和瓊脂糖凝膠電泳分析，質(zhì)量均符合要求。試驗(yàn)建立了分析牦牛和犏牛Prm1和Prm2基因mRNA相對(duì)水平的定量PCR方法，并采用雙內(nèi)參基因的幾何平均數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增特異性高（圖1），擴(kuò)增效率為93.7%～95.1%，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好（R2>0.99），符合定量要求。

2.2 牦牛和犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較

對(duì)成年牦牛和雄性不育犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因mRNA水平的熒光定量PCR分析結(jié)果表明，犏牛睪丸中Prm1和Prm2基因mRNA水平均極顯著低于牦牛（P<0.01），兩個(gè)基因在犏牛睪丸中均僅有微弱的表達(dá)（圖2）。

3 討論

犏牛的雜種優(yōu)勢(shì)在生產(chǎn)實(shí)際中具有重要的價(jià)值，但其雄性不育制約了犏牛的有效利用。很多研究證實(shí)犏牛睪丸和附睪中無精子[1，9]。犏牛精子發(fā)生受阻很可能與減數(shù)分裂異常有關(guān)。已有研究表明，犏牛睪丸中很多基因的表達(dá)下調(diào)[2-5]，但這與其雄性不育的因果關(guān)系仍不清楚。Prm1和Prm2基因在人睪丸中僅表達(dá)于圓形和長(zhǎng)形精子細(xì)胞中，而不存在于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和Sertoli等細(xì)胞中[10]。有報(bào)道表明，人Prm1和Prm2基因存在單核苷酸多態(tài)性，與男性不育存在一定關(guān)系，且研究結(jié)果提示減數(shù)分裂前期停滯可能導(dǎo)致精蛋白表達(dá)的大幅度下降[11]。犏牛雄性不育很可能與減數(shù)分裂異常有關(guān)，其睪丸中極低水平的Prm1和Prm2表達(dá)可能與此有類似的機(jī)制。另外，犏牛睪丸中的細(xì)胞組成明顯不同于成年牦牛[9]，根據(jù)Prm1和Prm2基因在人睪丸細(xì)胞中的表達(dá)特征[10]，其Prm1和Prm2表達(dá)水平也會(huì)顯著下降。

在人類中精蛋白基因突變、表達(dá)異常與男性不育存在顯著的關(guān)聯(lián)[12]。精蛋白基因進(jìn)化快，牦牛Prm1和Prm2基因序列及表達(dá)調(diào)控需要進(jìn)一步研究，以全面闡明犏牛精子發(fā)生障礙的詳細(xì)分子生物學(xué)機(jī)制。

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