響應(yīng)面法對(duì)地榆總黃酮超聲提取工藝的優(yōu)化

張卓睿+高輝+葛冬雪+姜貴全

摘要：以地榆（Sanguisorba officinalis L.）根為材料，對(duì)其所含黃酮類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了提取工藝研究。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、原料粒度、液料比、超聲功率、超聲時(shí)間、超聲次數(shù)對(duì)地榆總黃酮提取率的影響，在單因素基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，優(yōu)化了各項(xiàng)工藝參數(shù)。結(jié)果表明，超聲提取地榆根總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)47.78%、原料粒度40～60目、液料比20∶1（mL∶g）、超聲功率374.25 W、超聲時(shí)間33.70 min。此工藝條件下，地榆根中總黃酮提取率為10.565%。按照響應(yīng)面優(yōu)化的最佳提取工藝條件，對(duì)40～60目地榆粉末超聲提取3次，測(cè)量總黃酮提取率為11.035%。研究結(jié)果表明，超聲輔助提取的黃酮得率要高于一些傳統(tǒng)方法，適合對(duì)地榆總黃酮進(jìn)行提取加工。

關(guān)鍵詞：地榆（Sanguisorba officinalis L.）根；總黃酮；超聲提??；響應(yīng)面法

中圖分類(lèi)號(hào)：TS209；S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）20-5340-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.043

Abstract： Using Sanguisorba officinalis root as material，the extraction technology of total flavonoids from it was studied. Through single factors experiment，the effects of ethanol volume fraction， particle size，solvent-to-solid ratio，ultrasonic power，ultrasonic time，and ultrasonic frequency on the extraction rate of total flavonoids from Sanguisorba officinalis root were investigated，and then the process parameters had been optimized by the response surface design. The results showed that the optimum extraction conditions were ethanol volume fraction of 47.78%，material particle size of 40～60 mesh，solvent-to-solid ratio of 20∶1（mL∶g）， ultrasonic power of 374.25 W，ultrasonic time of 33.70 min. Under these conditions，the extraction rate of total flavonoids from Sanguisorba officinalis root was 10.565%. According to the optimum conditions，40～60 mesh powders of Sanguisorba officinalis root were extracted by ultrasonic extraction for 3 times，and the measured extraction rate of total flavonoids was 11.035%. It could be concluded that the ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Sanguisorba officinalis root was higher than some traditional methods，which was suitable for the extraction process of flavonoids from Sanguisorba officinalis L..

Key words： Sanguisorba officinalis L. root； total flavonoids； ultrasonic extraction； response surface methodology

地榆（Sanguisorba officinalis L.）為薔薇科（Rosaceae）地榆屬植物的根及根狀莖，廣泛分布于歐洲和亞洲北溫帶，在中國(guó)主要分布于東北、華北、西北、華東、中南及廣西等地區(qū)[1]。地榆是一種常用中藥，具有涼血止血，解毒斂瘡之功效，臨床上可用于便血、痔血、血痢、崩漏、水火燙傷及癰腫瘡毒的治療[2]。現(xiàn)代研究表明，地榆中含有鞣質(zhì)[3]、三萜皂苷[4]、黃酮、蒽醌、甾體類(lèi)[5]等多種化學(xué)成分，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、治療心血管疾病等功效[6，7]，是極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的野生植物資源。黃酮類(lèi)物質(zhì)是一大類(lèi)天然多酚化合物，可防治心腦血管疾病和呼吸系統(tǒng)疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗輻射、抗癌、抗腫瘤以及增強(qiáng)免疫能力等生理活性[8-10]。黃酮的提取方法主要有熱回流提取、酶提取、微波輔助提取和超聲輔助提取等[11]。其中超聲波輔助提取是利用超聲波產(chǎn)生的“空穴作用”破碎植物細(xì)胞，使提取液不斷振蕩，有利于黃酮類(lèi)化合物的溶出和擴(kuò)散，大大提高了植物有效成分的提取率[12]。目前關(guān)于地榆黃酮的提取鮮有報(bào)道，且方法也僅限于一些傳統(tǒng)提取工藝，而有關(guān)超聲波輔助提取至今尚無(wú)相關(guān)報(bào)道，故本試驗(yàn)采用超聲波輔助提取地榆總黃酮，以期為今后開(kāi)展地榆的研究工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試材料為地榆，2013年9月采于吉林市二道林場(chǎng)，洗凈、干燥、粉碎后，密封避光保存；無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等試劑均為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁為生化試劑（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；LG10-2.4A型高速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；WK-1000A型高速藥物粉碎機(jī)（青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司）；JY92-2D型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）；RE-85Z型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器（上海青浦瀘西儀器廠）；QUANTA200型環(huán)境掃描電子顯微鏡（荷蘭FEI公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取質(zhì)量濃度0.2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只10 mL比色管中，各加30%乙醇至5 mL，精密加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，再各加入10% Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加1 mol/L NaOH溶液4 mL，并分別加水定容至10 mL，搖勻，放置15 min。以空白試劑為參比液，在510 nm下測(cè)定吸光度[13]。以吸光度A為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行回歸，得吸光度A與總黃酮濃度x線性方程為：A=11.675x+0.033 5，R2=0.997 8，表明總黃酮濃度在0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈較好的線性關(guān)系。

1.3.2 地榆中總黃酮的提取 準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g地榆粉置于100 mL燒杯中，按最佳料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇，超聲波輔助提取一定時(shí)間后，提取液用8 000 r/min離心10 min，上清液于100 mL容量瓶中定容。

1.3.3 樣品中總黃酮含量的測(cè)定 取1 mL定容后提取液，按“1.3.1”方法測(cè)定吸光度A，由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程得出樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度C，再計(jì)算出樣品中總黃酮的提取率。計(jì)算公式為：

式中，D為樣品溶液稀釋倍數(shù)；C為樣品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為測(cè)定時(shí)比色管中溶液體積，mL；V2為樣品溶液總體積，mL；m為樣品質(zhì)量，mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 以總黃酮提取率為檢測(cè)指標(biāo)，分別考察提取方法、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、原料粒度、液料比（mL∶g，下同）、超聲時(shí)間、超聲次數(shù)7個(gè)因素對(duì)地榆中總黃酮提取率的影響。

1.3.5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-expert軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化地榆總黃酮的提取工藝條件，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取方法對(duì)地榆中總黃酮提取率的影響 不同提取方法對(duì)地榆中總黃酮提取率的影響見(jiàn)表2。由表2可以看出，酶-超聲輔助提取法的提取率最高，超聲提取法次之，不過(guò)兩者差別并不顯著，而酶提取法和回流提取法的提取率皆較低。將酶-超聲輔助提取法和超聲提取法提取前后的地榆物料在室溫條件下風(fēng)干，置于載物臺(tái)上用離子濺射儀噴金后在掃描電子顯微鏡下觀察其形貌變化，如圖1所示。從圖1（a）可以看出，未經(jīng)提取原料內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整密實(shí)，提取后則呈現(xiàn)出疏松多孔結(jié)構(gòu)，這是由于超聲波的空化作用引起提取溶液體系的宏觀湍動(dòng)和固體顆粒的高速碰撞，導(dǎo)致傳質(zhì)邊界層變薄、植物組織細(xì)胞破壁或變形，而這有利于溶劑更充分地滲透到植物細(xì)胞中，溶出其中化學(xué)成分。對(duì)比圖1（b）和圖1（c），可以發(fā)現(xiàn)兩種提取方法處理后，地榆內(nèi)部松散程度大體相同，因此，兩者的提取率相近，但酶-超聲輔助提取法引入了外來(lái)酶，增加了成本，且不利于后期分離純化，綜合考慮，本試驗(yàn)選擇超聲提取法從地榆中提取總黃酮。

2.1.2 提取參數(shù)對(duì)地榆中總黃酮提取率的影響 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)地榆總黃酮提取率的影響如圖2（a）所示。從圖2（a）可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，總黃酮提取率先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí)達(dá)到最大值，這主要是因?yàn)樵擉w積分?jǐn)?shù)的乙醇可以使醇溶性和水溶性黃酮類(lèi)物質(zhì)都能最大程度地溶出。因此，確定地榆黃酮提取時(shí)較佳的乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。

超聲功率對(duì)地榆總黃酮提取率的影響如圖2（b）所示。由圖2（b）可見(jiàn)，隨著超聲功率的增加，植物組織被破壞程度逐漸加大，提取率逐漸升高，當(dāng)超聲功率為360 W時(shí)提取率達(dá)到最大值，之后再繼續(xù)增大功率，超聲波產(chǎn)生的熱效應(yīng)使部分黃酮發(fā)生氧化，導(dǎo)致總黃酮提取率開(kāi)始下降。因此，確定較佳的提取超聲功率為360 W。

液料比對(duì)地榆總黃酮提取率的影響如圖2（c）所示。從圖2（c）可以看出，隨著液料比的增加，總黃酮提取率逐漸增大，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)提取率達(dá)到最大值；之后再繼續(xù)增加溶劑，體系內(nèi)過(guò)多的溶液會(huì)增大超聲破碎細(xì)胞的阻力，使細(xì)胞破碎不完全，進(jìn)而影響了黃酮類(lèi)物質(zhì)的溶出。因此，確定較佳的提取液料比為20∶1。

不同原料粒度對(duì)總黃酮提取率的影響如圖2（d）所示。由圖2（d）可見(jiàn)，40～60目原料提取率最高，因?yàn)樵狭６仍叫?，比表面積越大，溶劑與之接觸越充分，從而有利于總黃酮的浸出，但如原料粒度過(guò)小，雜質(zhì)大量溶出會(huì)阻礙黃酮物質(zhì)的溶出，且也不便于提取液的后期處理。因此，確定較佳的原料目數(shù)為40～60目。

超聲時(shí)間對(duì)地榆總黃酮提取率的影響如圖2（e）所示。超聲提取時(shí)間越長(zhǎng)，黃酮類(lèi)物質(zhì)浸出越充分，但如果時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，空化作用產(chǎn)生的熱效應(yīng)又會(huì)使黃酮氧化分解。從圖2（e）可以看出，超聲時(shí)間超過(guò)30 min以后，總黃酮提取率無(wú)明顯升高，反而有下降趨勢(shì)。因此，確定比較適宜的超聲時(shí)間為30 min。

超聲次數(shù)對(duì)地榆中總黃酮提取率的影響如圖2（f）所示。由圖2（f）可見(jiàn)，當(dāng)超聲提取3次后，提取率已無(wú)顯著提高，說(shuō)明經(jīng)3次超聲處理，地榆所含黃酮類(lèi)物質(zhì)已大部分溶出，因此，確定適宜的提取次數(shù)為3次。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。利用Design-Expert 7.0.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，以地榆總黃酮提取率為響應(yīng)值，得到提取率與所選4個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=10.59+0.044A-0.29B+0.32C+0.18D-0.13AB-0.19AC+0.12AD+0.058BC+0.30BD+0.29CD-0.49A2-0.50B2-0.47C2-0.62D2

通過(guò)比較一次項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值大小，可知影響地榆中總黃酮提取率主次因素為：提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲功率>液料比。對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，回歸模型檢驗(yàn)的P<0.000 1，表明試驗(yàn)所采用的二次模型回歸效果極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而失擬項(xiàng)檢驗(yàn)的P=0.343>0.05，表現(xiàn)為不顯著，證明無(wú)失擬因素存在，未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾小，可用回歸方程對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。綜上所述，該回歸方程是地榆總黃酮提取率與主要提取參數(shù)間較合適的數(shù)學(xué)模型，利用此方程可確定地榆總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)。由表4還可以看出，各交互作用中，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率、超聲時(shí)間與超聲功率的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，其三維響應(yīng)曲面見(jiàn)圖3。由圖3可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率、超聲時(shí)間與超聲功率交互作用的等高線皆為橢圓形，說(shuō)明這兩種交互效應(yīng)較強(qiáng)，對(duì)地榆總黃酮的提取率影響比較顯著，且在所選范圍內(nèi)都存在極值點(diǎn)，極值點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的條件位于等高線中心點(diǎn)處。圖3（a）表示乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲功率對(duì)總黃酮提取的影響，乙醇體積分?jǐn)?shù)曲面斜率大于超聲功率曲面斜率，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)地榆中總黃酮提取率的影響大于超聲功率；圖3（b）表示超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響，可以看出隨著超聲時(shí)間與超聲功率的增加，曲面變化都很陡峭，但沿提取時(shí)間軸向等高線變化密集，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)地榆總黃酮提取率的影響大于超聲功率。

通過(guò)響應(yīng)面法得出的最佳提取工藝條件為液料比20∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)47.78%，超聲時(shí)間33.70 min，超聲功率374.25 W。按此條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得總黃酮平均提取率為10.565%，實(shí)際值與預(yù)測(cè)值（10.702%）基本吻合。按照最佳提取工藝條件，對(duì)40～60目地榆粉末超聲提取3次，測(cè)量總黃酮提取率為11.035%。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，回流提取法、酶提取法、酶-超聲輔助提取法、超聲提取法4種方法中，超聲提取法的提取效果較好，提取效率較高，比較分析后選擇該方法提取地榆總黃酮；在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，確定地榆根總黃酮的最佳提取工藝條件為原料粒度40～60目、液料比20∶1、乙醇體積分?jǐn)?shù)47.78%、超聲功率374.25 W、超聲時(shí)間33.70 min。在此工藝條件下，地榆根中總黃酮提取率為10.565%；按照最佳工藝條件超聲提取地榆粉3次，所得提取液總黃酮提取率為11.035%。綜合研究結(jié)果，可以得出地榆總黃酮適于采用超聲波法提取，提取時(shí)間短，提取率較高。

黃酮類(lèi)化合物可防治心腦血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病，有降血糖、抗氧化、抗癌、增強(qiáng)免疫能力等功效，具有良好的開(kāi)發(fā)前景和研究意義。通過(guò)研究所確定的超聲輔助提取最佳工藝條件，可為地榆黃酮的進(jìn)一步深入研究及產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供良好的技術(shù)支撐和研究基礎(chǔ)。

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