茯苓菌絲體生物量、多糖含量的測(cè)定

蔡愛群+唐福斌+韓偉

摘要：通過收集經(jīng)液體培養(yǎng)的茯苓1號(hào)[Poria cocos（Schw.）Wolf. Strain 1]、茯苓5.78號(hào)（P. cocos Strain 5.78）菌株菌絲體，并干燥后稱重，比較其生物量產(chǎn)率；采用苯酚-硫酸法，分別測(cè)定茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌株菌絲體的多糖吸光度，從而測(cè)定出其多糖含量。結(jié)果表明，茯苓1號(hào)比茯苓5.78號(hào)生長(zhǎng)速度快，生物量大；茯苓5.78號(hào)菌絲體的多糖含量比茯苓1號(hào)高。說明在相同的液體培養(yǎng)基條件下，茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌株的菌絲體生長(zhǎng)速度不同；茯苓多糖含量也不一樣。

關(guān)鍵詞：茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf.]；液體培養(yǎng)；生物量；多糖

中圖分類號(hào)：S567.3+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）20-5279-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.028

Abstract： Mycelia were collected by liquid culture of Poria cocos（Schw.） Wolf. Strain 1 and P. cocos Strain 5.78， dryed and weighed so as to compare their biomass. The colorimetric method of phenol and sulfuric acid was applied for measuring the polysaccharide absorbance of P. cocos Strain 1 and P. cocos Strain 5.78 to test the content of polysaccharide. The P. cocos Strain 1 grew fasterthan P. cocos Strain 5.78 and had large biomass. But P. cocos Strain 5.78 had higher polysaccharide content. Under the same liquid cultivation conditions， the mycelia of P. cocos Strain 1 and P. cocos Strain 5.78 had different growth rate as well as different content of polysaccharide.

Key words： Poria cocos（Schw.） Wolf.； liquid culture； biomass； polysaccharide

中藥茯苓是多孔菌科（Polyporaceae）茯苓屬（Wolfiporia Ryv.et Gilbn）茯苓[Poria cocos（Schw.）Wolf.]的干燥菌核炮制而成，具有滲濕利尿、健脾寧心等功效。茯苓的化學(xué)成分主要有茯苓多糖、三萜、樹膠、甾醇、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等[1]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者對(duì)茯苓多糖進(jìn)行了大量分析研究，發(fā)現(xiàn)其具有增強(qiáng)免疫能力、延緩衰老、抗病毒、抗腫瘤、降血糖等藥理功效[2]，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療保健等領(lǐng)域，因此市場(chǎng)需求量不斷攀升。然而人工種植茯苓存在許多技術(shù)處理難題，容易受氣候和地域等條件限制，同時(shí)存在產(chǎn)量不高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、病蟲害控制帶來(lái)的殘留等問題，并且要消耗大量木材，因而飽受詬病。用液體培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)茯苓菌絲體、從茯苓菌絲體和發(fā)酵液中提取茯苓多糖等活性物質(zhì)，可以很好地解決人工種植茯苓的替代問題，還能節(jié)省大量木材，這對(duì)于森林資源和生物多樣性的保護(hù)有著重要的意義。液體培養(yǎng)生產(chǎn)茯苓菌絲體可連續(xù)性地進(jìn)行規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)，能大大縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本[3]。這對(duì)于茯苓多糖的測(cè)定、提取及開發(fā)意義重大，所以試驗(yàn)選擇性地對(duì)茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌株菌絲體實(shí)施了生物量、多糖含量的測(cè)定，以期能進(jìn)一步為茯苓藥用品及保健品開發(fā)等提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茯苓菌株 供試茯苓菌株為茯苓1號(hào)和茯苓5.78號(hào)，均引自安徽省岳西多生食用菌專業(yè)合作社。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①斜面、平板培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、水1 000 mL、pH自然。②種子培養(yǎng)基[3]：葡萄糖20 g、蛋白胨4 g、酵母浸膏5 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 0.46 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、水1 000 mL。③發(fā)酵培養(yǎng)基[4]：葡萄糖30 g、蛋白胨4 g、酵母浸膏5.1 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 0.46 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、水1 000 mL，pH 5.5。

1.1.3 試劑與儀器 主要有石油醚、80%乙醇、5%苯酚、1 mol/L 氫氧化鈉、葡萄糖等。儀器主要有無(wú)菌接種臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱、實(shí)驗(yàn)用冰箱、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)用搖床、電子控溫烘箱、紫外分光光度計(jì)、索氏提取器、布氏漏斗和抽濾瓶等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基接種前檢驗(yàn) 將斜面培養(yǎng)基和平板培養(yǎng)基一起放在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，如無(wú)菌生長(zhǎng)，方可使用。

1.2.2 母種的擴(kuò)接 將茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)母種試管中的菌絲體連帶著培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接入不同斜面培養(yǎng)基的中央，接種好后，塞上膠塞，貼上寫有接種時(shí)間、菌絲體種類的標(biāo)貼，于恒溫培養(yǎng)箱中26 ℃恒溫培養(yǎng)。約一個(gè)星期后，接種的茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌絲體長(zhǎng)滿試管，即可進(jìn)行平板培養(yǎng)基的接種或放入4 ℃冰箱中保存。

1.2.3 平板培養(yǎng)基的接種 先后從茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)斜面菌種中用接種鉤分別挑起1塊約1 cm×1 cm菌塊，接入裝有平板培養(yǎng)基的不同培養(yǎng)皿的中央，每個(gè)菌種接5個(gè)平板，用封口膜封口，于26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d，待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。

1.2.4 種子培養(yǎng)基的接種及培養(yǎng) 按種子培養(yǎng)基配方配制500 mL種子培養(yǎng)基，配好后，分裝入10個(gè)250 mL三角瓶中，每個(gè)三角瓶50 mL，加塞，于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min左右后取出，冷卻至室溫待用。再分別用2個(gè)打孔器把生長(zhǎng)于平板培養(yǎng)基外側(cè)的茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌絲打孔，先后接種到不同的三角瓶種子培養(yǎng)基中，每瓶接種4塊直徑為1 cm的圓形菌塊，貼上寫有接種時(shí)間、菌絲體種類的標(biāo)貼。放于培養(yǎng)溫度為26 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫?fù)u床中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)4 d[3，5]。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的接種與搖床培養(yǎng) 先按配方配好發(fā)酵培養(yǎng)基1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至5.5，分裝入250 mL三角瓶中，每瓶裝液50 mL。于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，滅菌完畢后取出冷卻至室溫。每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基以10%的比例接入液體種子菌種，茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)各接種8瓶，貼標(biāo)貼后放于培養(yǎng)溫度為26 ℃、轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫?fù)u床中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)[6]。

1.3 茯苓生物量測(cè)定

1.3.1 茯苓菌絲體生長(zhǎng)速度的測(cè)定 分別用打孔器打孔接種1塊直徑為1 cm的茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)平板培養(yǎng)基菌種在直徑為95 mm的平板中央，茯苓1號(hào)和茯苓5.78號(hào)各接3個(gè)平板。接種后，用封口膜將平板密封。于26 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h測(cè)定菌塊菌絲生長(zhǎng)的直徑，直至菌絲長(zhǎng)滿平板為止結(jié)束測(cè)量。根據(jù)菌絲體生長(zhǎng)直徑大小的不同，比較茯苓 1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌株菌絲的生長(zhǎng)速度[4]。

1.3.2 茯苓菌絲體干重的測(cè)定 收取的菌絲體發(fā)酵液用布氏漏斗和抽濾瓶真空抽濾。抽濾過程中，用去離子水反復(fù)洗滌菌絲球5～6次，直到洗凈菌絲球中殘留的培養(yǎng)液為止，期間要注意濾液不能加得太滿，以防濾液被抽入真空泵。得到的菌絲球于烘箱中，60 ℃下烘至恒重，稱量，以50 mL發(fā)酵液中菌絲體干重（g/50 mL）作為計(jì)量單位。然后以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲體生物量（干重）為縱坐標(biāo)，繪制茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌絲發(fā)酵過程中菌絲體的生長(zhǎng)曲線[3]。

1.4 茯苓多糖含量的測(cè)定

1.4.1 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，置50 mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度，再用移液管吸取5 mL，置另一個(gè)50 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度，即得濃度為0.100 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于15 mL試管中，編號(hào)為1～7，都加水至1.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.2 mL，待充分混勻后，迅速加入濃硫酸7.0 mL；再充分混勻后，置45 ℃水浴中30 min，然后移至冰水浴中30 min。取出后，在紫外分光光度計(jì)上于490 nm處測(cè)其吸光度值[7]。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，即得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），由此得回歸方程。

1.4.3 樣品茯苓多糖的提取 用索氏提取器提取樣品的茯苓多糖，茯苓多糖采用文獻(xiàn)[7]的苯酚-硫酸比色法測(cè)定。用紫外分光光度計(jì)，在490 nm處測(cè)其吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌絲體多糖的百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓生物量

2.1.1 茯苓菌絲體生長(zhǎng)速度的測(cè)定和分析 茯苓菌絲體生長(zhǎng)速度測(cè)定結(jié)果見圖2。由圖2可見，將活化的茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)同時(shí)采用打孔器接種到平板上培養(yǎng)后，其菌絲體生長(zhǎng)速度是茯苓1號(hào)比茯苓5.78號(hào)快，且生長(zhǎng)更旺盛，說明茯苓1號(hào)比茯苓5.78號(hào)更適應(yīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)。

2.1.2 茯苓菌絲體生物量（干重）的測(cè)定和分析 茯苓菌絲體生物量測(cè)定結(jié)果見圖3。從圖3可見，茯苓菌絲體經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)后，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù)，茯苓菌絲體生物量逐漸增加，培養(yǎng)8 d時(shí)，茯苓1號(hào)菌絲體生物量最大，為0.310 g/50 mL；當(dāng)生長(zhǎng)到12 d時(shí)，茯苓1號(hào)菌絲球已經(jīng)開始自溶，生物量轉(zhuǎn)為下降趨勢(shì)。茯苓5.78號(hào)的生長(zhǎng)則稍微緩慢一點(diǎn)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間到10 d時(shí)，生物量達(dá)到最大值，為0.305 g/50 mL；繼續(xù)生長(zhǎng)到14 d時(shí)，茯苓5.78號(hào)菌絲球自溶，生物量轉(zhuǎn)為下降趨勢(shì)。

2.2 茯苓多糖含量

樣品溶液多糖含量的測(cè)定結(jié)果表明，茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌絲體中多糖含量都很高，茯苓1號(hào)菌絲體多糖含量達(dá)到82.4%，茯苓5.78號(hào)菌絲體多糖含量達(dá)到86.2%。與李真鹍等[7]報(bào)道的發(fā)酵茯苓菌絲體中多糖的含量不低于55%，最高可達(dá)87%的結(jié)果相差不大。

3 小結(jié)與討論

目前，傳統(tǒng)的茯苓栽培法仍是茯苓生產(chǎn)的主要方式，但該方式受氣候和地域等條件限制，存在產(chǎn)量不高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等不足。而用液體發(fā)酵培養(yǎng)方法生產(chǎn)茯苓，可不受氣候、地域、病蟲害等條件的制約，生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量大，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[8]。茯苓多糖是近年來(lái)研究較多的一種真菌多糖，其質(zhì)量約占整個(gè)茯苓菌核干重的70%～90%[9]。由茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌絲體多糖含量的比較可推測(cè)出，茯苓多糖含量可能與發(fā)酵時(shí)間有關(guān)，在發(fā)酵終點(diǎn)內(nèi)，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，多糖的產(chǎn)量越高。茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌絲體多糖含量都超過了80%，具有很好的開發(fā)前景，可以通過液體培養(yǎng)技術(shù)大量生產(chǎn)茯苓1號(hào)、茯苓5.78號(hào)菌絲體，再用菌絲體來(lái)提取茯苓多糖，加工成營(yíng)養(yǎng)保健品或生物藥劑等終端產(chǎn)品，從而造福人類。

目前多數(shù)真菌發(fā)酵主要依據(jù)菌絲體的產(chǎn)量、培養(yǎng)液中的pH、還原糖、含氮量、培養(yǎng)液的顏色變化以及菌絲球的形態(tài)變化等因素來(lái)判斷[10]，所以在茯苓菌絲體液體發(fā)酵過程中，發(fā)酵終點(diǎn)的判斷還需深入研究；另外本試驗(yàn)的茯苓菌絲體產(chǎn)量低于文獻(xiàn)報(bào)道，需進(jìn)一步作培養(yǎng)基優(yōu)化、培養(yǎng)條件優(yōu)化的正交設(shè)計(jì)或響應(yīng)面試驗(yàn)來(lái)探究。

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