組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響

孟 亮 余小祥 樊 文 涂 勤 王躍飛 陶 亮

(武漢市第三醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 武漢 430000)

組蛋白去乙酰化酶抑制劑對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響

孟 亮 余小祥 樊 文 涂 勤 王躍飛 陶 亮

(武漢市第三醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北 武漢 430000)

目的 探討組蛋白去乙酰化酶抑制劑(HDACsi)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響。方法 2.0、5.0、10.0、20.0和40.0 nmol/L HDACsi MS-275與U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞共同孵育48 h后，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)U251細(xì)胞增殖能力的變化、Tranwell小室檢測(cè)MS-275對(duì)U251細(xì)胞遷移能力的影響、Annexin V-PI雙染色法檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡程度。結(jié)果 MS-275處理48 h后，與空白組相比，各濃度組U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制，細(xì)胞的遷移能力顯著降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高；隨著MS-275濃度的增加，其抑制U251細(xì)胞增殖和遷移的能力、誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡的能力逐漸增強(qiáng)。結(jié)論 HDACsi MS-275能抑制U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，MS-275有望成為膠質(zhì)瘤的新手段。

組蛋白去乙?；敢种苿?；人膠質(zhì)瘤細(xì)胞；增殖；遷移

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%和全部惡性顱內(nèi)腫瘤的80%〔1〕，術(shù)后復(fù)發(fā)率高〔2〕，并具有局部侵襲性生長(zhǎng)、進(jìn)展迅速、病死率高等特點(diǎn)〔3〕。治療手段主要集中于手術(shù)、化療、放療、γ刀、χ刀等，但其術(shù)后和放療后的復(fù)發(fā)率高、生存期短、5年生存率低等導(dǎo)致其治療仍然是臨床上難破的關(guān)〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)，在癌癥中，組蛋白去乙?；?HDACs)表達(dá)過(guò)量〔5〕，于是便成為目前研究治療腫瘤新的可靠靶點(diǎn)之一，人們發(fā)現(xiàn)其抑制劑(HDACsi)可以通過(guò)控制細(xì)胞增殖和抗凋亡從而達(dá)到治療癌癥的目的〔6〕。本研究旨在探HDACsi恩替司他(Entinostat，MS-275)對(duì)U251人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效果。

1 材料與方法

1.1 材料 HDACsi MS-275(ALEXIS公司)，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞(上海中喬新舟生物科技有限公司)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8試劑盒(CCK-8，Dojindo)，DMEM高糖培養(yǎng)基、小牛血清(FBS)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，細(xì)胞凋亡試劑盒、丙戊酸鈉注射液(VPA)均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。流式細(xì)胞儀(Beckman FC500)，高速離心機(jī)(3300，日本Kubota)，紫外光、可見(jiàn)光分光光度計(jì)(Beckman)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 U251細(xì)胞培養(yǎng)及分組 細(xì)胞置于含10%FBS(V/V)和100 U/ml青霉素-100 mg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱環(huán)境37℃、5%CO2、濕度95%，24 h更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞覆蓋瓶底95%以上則用0.25%胰蛋白酶消化并傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞懸浮于含有二甲基亞砜(10%V/V)、FBS(30%V/V)和DMEM/F12(60%V/V)的培養(yǎng)基中，保存在液態(tài)氮中備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)將細(xì)胞分為空白組(不予任何藥物)、VPA組(VPA 1.0 mmol/L)、MS-275組(2.0、5.0、10.0、20.0和40.0 nmol/L)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)MS-275對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響 取備用細(xì)胞解凍后置于上述培養(yǎng)基中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，按5.0×104密度種于96孔板中，孵育24 h后棄去舊的培養(yǎng)液加入含F(xiàn)BS的新鮮培養(yǎng)液，200 μl/孔，再按上述分組分別加入相應(yīng)濃度的藥物，均培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH 7.4,100 μl/孔)和CCK-8溶液(10 μl/孔)，于37℃避光孵化1 h，經(jīng)酶標(biāo)儀OD480檢測(cè)每組各孔吸光度(A值)，依照公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率(100%)=(1-試驗(yàn)孔A值)/對(duì)照孔A值×100%。

1.2.3 Tranwell小室檢測(cè)MS-275對(duì)U251細(xì)胞遷移的影響 用不含血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整各組細(xì)胞密度為2.0×105/ml，上室加100 μl細(xì)胞懸液，下室加600 μl預(yù)先加10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，24 h后棄上室培養(yǎng)液，取800 μl無(wú)水甲醇室溫固定30 min，棉簽輕輕拭去底膜上室側(cè)的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，于倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，取底膜下室側(cè)左、右、中、上、下5處高倍視野(×400)的細(xì)胞總數(shù)，重復(fù)3次，并取平均值。

1.2.4 Annexin V-PI雙染色法檢測(cè)MS-275對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響 按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，用不含EDTA的胰蛋白酶(0.25%)消化并收集各組細(xì)胞，冷PBS洗滌2次，buffer懸浮并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106，流式管加入加100 μl細(xì)胞懸液，分別加入10 μl Annexin V和5 μl PI，混勻，常溫避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Ex=488 nm，Em=530 nm，計(jì)算總凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 CCK-8法檢測(cè)MS-275對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響 隨著MS-275藥物濃度不斷增加，其對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制率明顯加強(qiáng)，2.0 nmol/L組(30.57±2.26)%，5.0 nmol/L組(47.21±4.28)%，10.0 nmol/L組(63.76±5.24)%，20.0 nmol/L組(66.81±3.76)%，40.0 nmol/L組(77.17±7.36)%，與空白組〔(6.98±4.91)%〕相比差異顯著(P<0.01)，而且MS-275對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制率與藥物濃度呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.2 Tranwell小室檢測(cè)MS-275對(duì)U251細(xì)胞遷移的影響 MS-275藥物處理U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞48 h后，各濃度組U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力受到明顯的抑制(P<0.05，P<0.01)，而且MS-275藥物對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的抑制能力具藥物濃度依賴性，其中空白組遷移(44.6±1.5)個(gè)，VPA組(34.2±1.1)個(gè)，MS-275 2.0 nmol/L組(21.1±1.3)個(gè)，5.0 nmol/L組(10.4±2.0)個(gè)，10.0 nmol/L組(9.8±1.7)個(gè)，20.0 nmol/L組(5.7±2.4)個(gè)，40.0 nmol/L(3.2±1.2)個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 MS-275藥物對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

2.3 Annexin V-PI雙染色法檢測(cè)MS-275對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響 各濃度的MS-275藥物處理后U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率明顯增加，VPA組(9.52±1.20)%，MS-275 2.0 nmol/L組(12.58±1.12)%，5.0 nmol/L組(18.16±2.71)%，10.0 nmol/L組(26.78±1.96)%，20.0 nmol/L組(30.35±1.27)%，40.0 nmol/L組(46.01±1.08)%，與空白組〔(7.56±1.23)%〕比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)。

3 討 論

組蛋白是存在于真核生物細(xì)胞核中、與DNA結(jié)合的分子量約10 000～20 000的堿性蛋白質(zhì)，它的甲基化修飾與異染色質(zhì)形成、基因印記、X染色體失活及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種生理功能相關(guān)。組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(HATs)通過(guò)將乙酰輔酶A的乙?；D(zhuǎn)移到組蛋白氨基末端特定的賴氨酸殘基上完成乙?；喾碒DACs則使組蛋白的賴氨酸殘基去乙?；?〕；組蛋白乙?；梢约せ钐囟ɑ虻霓D(zhuǎn)錄，而組蛋白去乙?；瘎t使基因啟動(dòng)子不易靠近轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄被抑制，催化組蛋白乙?；腍ATs/去乙?；腍DACs通過(guò)與癌基因或抑癌基因產(chǎn)物互相作用，從而修飾/介導(dǎo)該產(chǎn)物影響與細(xì)胞分化或增殖的相關(guān)基因，若這二者的平衡被打破將使基因表達(dá)失控，導(dǎo)致發(fā)生腫瘤。細(xì)胞失控性增殖、遷移都是惡性腫瘤的重要特征，瘤細(xì)胞從原發(fā)灶入侵至血管、淋巴管或體腔，隨血液、淋巴液進(jìn)入另一個(gè)部位或器官，并在該處增殖生長(zhǎng)，繼而發(fā)生與原發(fā)瘤同一類(lèi)型的腫瘤。HDACs作為一種轉(zhuǎn)錄抑制因子參與有機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，目前被發(fā)現(xiàn)的共有18種人類(lèi)HDACs，包括Ⅰ型(HDAC1、2、3、8)、Ⅱ型(HDAC4、5、6、7、9、10)、Ⅲ型(SIRT1～7)和Ⅳ型(HDAC11)，其中主要高度相似的HDAC1和HDAC2在機(jī)體發(fā)育過(guò)程中參與細(xì)胞增殖、周期調(diào)控和細(xì)胞凋亡等多個(gè)細(xì)胞進(jìn)程〔8〕，HDAC3在細(xì)胞周期調(diào)控和DNA損傷修復(fù)過(guò)程中也扮演重要角色。眾多研究結(jié)果顯示，HDACs在多種癌癥中都高表達(dá)，且它的作用機(jī)制對(duì)腫瘤發(fā)生的影響更顯著于其在腫瘤細(xì)胞中的高表達(dá)〔9〕，所以HDACi成為癌癥治療藥物的研究熱點(diǎn)，它作為新型的化療藥物提供了治療腫瘤的新方向，其抗腫瘤的分子機(jī)制有〔10〕：(1)阻滯細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，HDACi通過(guò)調(diào)節(jié)異常增生和凋亡基因的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，如果腫瘤細(xì)胞DNA受損傷或有絲分裂異常，HDACi便中斷細(xì)胞周期，啟動(dòng)修復(fù)途徑進(jìn)行損傷修復(fù)。(2)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，加速腫瘤細(xì)胞死亡，HDACi可上調(diào)腫瘤細(xì)胞死亡受體與配體的表達(dá)，啟動(dòng)凋亡程序而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；也可通過(guò)活化腫瘤細(xì)胞中的促凋亡蛋白Bax和Bak，抑制抗凋亡蛋白Bcl-2和bcl-xL的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。(3)抑制血管生成，防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，HDACi通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF-A)的表達(dá)，抑制腫瘤血管的生成而防止腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移。(4)抑制腫瘤細(xì)胞遷移活性、誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生、誘導(dǎo)腫瘤免疫等其他抗腫瘤效應(yīng)。

MS-275屬于苯甲酰胺類(lèi)HDACi，是小分子化合物，分子量?jī)H有376.4 kD，此藥通過(guò)抑制HDAC1和HDAC3的活性〔11〕，使細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；⒑藘?nèi)染色質(zhì)機(jī)構(gòu)改變、影響特異性基因表達(dá)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，且其具有在體內(nèi)穩(wěn)定、可口服給藥、毒副作用相對(duì)小等特點(diǎn)，任亞嬋等〔12〕研究MS-275對(duì)胃癌細(xì)胞增殖能力的抑制，閆洪亮等〔13〕觀察到MS-275能抑制人宮頸癌SiHA細(xì)胞遷移，曲巍等〔14〕報(bào)道MS-275有效誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡。本文也和細(xì)胞增殖抑制結(jié)果相符，而且MS-275的藥物作用呈濃度依賴性，另外，MS-275對(duì)U251的作用均比陽(yáng)性對(duì)照藥VPA的作用強(qiáng)，具有一定的研究?jī)r(jià)值。

綜上，MS-275有望成為治療腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤的有效途徑，可能與抑制U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力、誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)，我們將進(jìn)一步探索MS-275對(duì)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用機(jī)制，為其治療提供更充足的理論依據(jù)。

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〔2016-10-27修回〕

(編輯 李相軍/滕欣航)

孟 亮(1984-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的基礎(chǔ)和臨床研究。

R3

A

1005-9202(2017)02-0309-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.021