基于454 ESTs的麻黃轉(zhuǎn)錄組研究

閆海霞　羅紅梅　李瀅　孫永珍　孫超　錢(qián)忠直　陳士林

[摘要] 該研究應(yīng)用454 GS FLX Titanium高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)5年生草麻黃Ephedra sinica的草質(zhì)莖進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得48 389條表達(dá)序列標(biāo)簽（express sequence tags，ESTs），序列平均長(zhǎng)度為373 bp。所得序列與GenBank中麻黃的EST合并拼接，獲得18 801條一致性序列（unigene）。通過(guò)與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比較分析對(duì)所得轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行功能注釋?zhuān)Y(jié)果表明其中56.0%（10 531條）的unigenes與其他生物的已知基因具有一定程度的同源性。進(jìn)一步分析獲得了19條可能參與麻黃生物堿生物合成的序列（共編碼9個(gè)關(guān)鍵酶），97條細(xì)胞色素P450序列，以及大量轉(zhuǎn)錄因子序列。該研究為麻黃生物堿類(lèi)化合物的生物合成研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為麻黃轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究提供了海量數(shù)據(jù)，對(duì)于麻黃的功能基因組學(xué)研究具有重要意義。

[關(guān)鍵詞] 草麻黃； 454 GS FLX； 表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）； 轉(zhuǎn)錄組

Transcriptome characterization of Ephedra sinica with 454 ESTs

YAN Haixia1，4， LUO Hongmei1， LI Ying1， SUN Yongzhen1， SUN Chao1， QIAN Zhongzhi2*， CHEN Shilin3*

（1. Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100193， China；

2. Chinese Pharmacopoeia Commission， Beijing 100061， China；

3. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China；

4. Beijing Institute for Drug Control， Beijing 102206， China）

[Abstract] Using the latest 454 GS FLX platform and Titanium regent， a substantial expressed sequence tag （ESTs） dataset of Ephedra sinica was produced， and the profile of gene expression and function gene of which were investigated. A total of 48 389 reads with an average length of 373 bp were generated. These 454 reads were assembled into 18 801 unigenes， which were all 454 sequencing identified. A total number of 10 531 unigenes（56.0%） were annotated using BLAST searches （Evalue≤1×10-5） against the Nr， Nt， TAIR， SwissProt and KEGG databases. With respect to genes related to ephedrine biosynthesis， 19 unigenes（encoding 9 enzymes） were found. A total of 97 putative genes encoding cytochrome P450s were also discovered. Data presented in this study will provide an important resource for the scientific community that is interested in the functional genomics and secondary metabolism of E. sinica.

[Key word] Ephedra sinica； 454 GS FLX； expressed sequence tags； transcriptome

doi：10.4268/cjcmm20162212

麻黃Ephedra sinica為裸子植物門(mén)買(mǎi)麻藤綱Gnetopsida麻黃科Ephedraceae麻黃屬草本狀小灌木。麻黃屬是一類(lèi)古老的種子植物，自古生代泥盆紀(jì)演化至今，繁衍出在形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面高度特化的一些類(lèi)型，同時(shí)產(chǎn)生了很多結(jié)構(gòu)特異、生理活性顯著的次生代謝產(chǎn)物。麻黃屬為麻黃科僅有的一個(gè)屬，全世界共有67個(gè)種，我國(guó)有15個(gè)種及2個(gè)變種，主要分布于我國(guó)的內(nèi)蒙古、甘肅、山西、河北、四川、青海等地，生長(zhǎng)在沙丘、干草原、丘陵山地、荒灘等干燥地區(qū)。常見(jiàn)的有草麻黃E. sinica、木賊麻黃E. equisetina、中麻黃E. intermedia等[1]。據(jù)藥典記載，麻黃以干燥草質(zhì)莖入藥，具有發(fā)汗平喘宣肺的功效，而麻黃根具有固表止汗的功效[2]。麻黃也是我國(guó)特產(chǎn)且聞名世界的一種中藥，早在2 000多年前就用作發(fā)汗和止咳平喘藥，并沿用至今[3]。麻黃堿是麻黃中主要活性成分之一，具有收縮支氣管平滑肌、收縮血管、興奮大腦皮層等作用，因此，對(duì)麻黃堿的分析方法及化學(xué)合成、麻黃的組織培養(yǎng)等研究較多[49]，但對(duì)麻黃堿生物合成途徑的研究較為有限。

麻黃基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的缺乏制約了麻黃堿類(lèi)化合物的次生代謝研究。表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags， EST）代表了特定組織和特定時(shí)期的基因表達(dá)特征，廣泛用于基因識(shí)別、新基因的發(fā)現(xiàn)、基因克隆、功能分析、基因作圖等方面[1013]。最近幾年，EST技術(shù)也被應(yīng)用于藥用植物次生代謝相關(guān)基因的發(fā)掘中，一些重要的藥用植物已建立了EST文庫(kù)，如西洋參、丹參、蛇足石杉、甘草等[1417]。以454 GS FLX（454 Life of Science， Roche）為代表的新一代高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組研究，大大降低了測(cè)序時(shí)間和成本，促進(jìn)藥用植物轉(zhuǎn)錄組和次生代謝相關(guān)基因的研究高效率開(kāi)展。

本研究利用454 GS FLX Titanium測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于藥用植物麻黃的轉(zhuǎn)錄組研究，試圖從功能基因組水平研究麻黃重要基因的表達(dá)并從中發(fā)掘重要的功能基因，旨在為闡明麻黃堿生物合成途徑提供研究基礎(chǔ)，同時(shí)也為麻黃生物堿類(lèi)化合物的生物合成研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 草麻黃采自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥用植物園，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖教授鑒定。流水洗凈其草質(zhì)莖，用吸水紙吸干表面水分，迅速將其切成結(jié)節(jié)，立即用液氮冷凍，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 采用通用植物總RNA提取試劑盒（百泰克公司）提取麻黃草質(zhì)莖總RNA，Oligotex mRNA kit（Qiagen）分離純化mRNA。以2 μg mRNA為模板，SMARTTM PCR cDNA Synthesis kit（Clontech）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用PCR Advantage Ⅱ polymerase（Clontech）對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增獲得雙鏈cDNA（ds cDNA），擴(kuò)增條件為95 ℃，1 min；94 ℃，15 s，65 ℃，30 s；68 ℃，6 min，13個(gè)循環(huán)。采用PureLinkTM PCR Purification kit（Invitrogen）去除體系中小于300 bp的ds cDNA片段。

1.3 454文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序 應(yīng)用454 GS FLX Titanium對(duì)cDNA樣品測(cè)序，取5 μg ds cDNA打斷為300～800 bp的片段后，兩端添加特異性銜接子A和B，變性為單鏈連接到磁珠上，經(jīng)油包水 PCR（emPCR）富集后，置于Pico Titer Plate板上，上機(jī)測(cè)序。

1.4 序列拼接 采用GSFLX Software去除銜接子區(qū)域和低質(zhì)量序列，屏蔽SMART PCR引物。將測(cè)序序列與GenBank中的一條麻黃EST序列合并，經(jīng)GS De Novo Assembler Software進(jìn)行序列拼接。所有分析使用默認(rèn)參數(shù)。

1.5 功能注釋、分類(lèi)和代謝途徑分析 使用BLAST程序?qū)⑵唇铀靡恢滦孕蛄校╱nigene）與核酸、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)（E≤1×10-5），并選取最佳注釋。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)包括SwissProt，KEGG，擬南芥蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR9和NCBI 非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)Nr；核酸數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBI非冗余核酸數(shù)據(jù)庫(kù)Nt。

根據(jù)TAIR9注釋所含Gene Ontology（GO）信息，對(duì)序列（按照分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)過(guò)程）進(jìn)行分類(lèi)。根據(jù)KEGG注釋的基因功能信息，對(duì)參與次生代謝的序列（按照次生代謝物種類(lèi)）進(jìn)行分類(lèi)。

對(duì)所有注釋信息進(jìn)行整理、搜索麻黃堿類(lèi)化合物生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，以及可能參與或調(diào)控次生代謝的細(xì)胞色素P450和轉(zhuǎn)錄因子等基因。

2 結(jié)果

2.1 454測(cè)序和EST序列拼接 采用454 GS FLX Titanium高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)5年生麻黃草質(zhì)莖的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，見(jiàn)表1，從1/8 run的測(cè)序反應(yīng)即獲得48 389條讀長(zhǎng)序列（reads），序列平均長(zhǎng)度為373 bp。將實(shí)驗(yàn)中所得的454 ESTs與GenBank dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)中的麻黃EST合并，經(jīng)過(guò)軟件拼接，共獲得18 801條unigene，包括5 753個(gè)序列重疊群（contig）和13 048條單一序列（singleton），unigene總長(zhǎng)7.46 Mb，均為由454測(cè)序新鑒定的unigene（因?yàn)镚enbank中只有1條麻黃的EST序列）。

2.2 序列功能注釋 通過(guò)BLAST搜索比對(duì)，見(jiàn)表2，共有10 531條unigene獲得了基因注釋。根據(jù)擬南芥蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)的注釋結(jié)果，被注釋序列大約包含9 752個(gè)轉(zhuǎn)錄本。另有8 270條unigene（44.0%）未被注釋。

2.3 EST文庫(kù)中的高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本 Unigene所包含的EST數(shù)目代表了其表達(dá)豐度，麻黃草質(zhì)莖中表達(dá)豐度最高的前10個(gè)轉(zhuǎn)錄本見(jiàn)表3。表達(dá)豐度最高的轉(zhuǎn)錄本編碼過(guò)氧化氫酶（Catalase3 sp|Q42547|CATA3_ARATH），該酶在藥用植物體內(nèi)參與氨基酸、色氨酸代謝及能量代謝等。表達(dá)豐度排在第二位的轉(zhuǎn)錄本編碼碳酸酐酶（Carbonic anhydrase sp|P27141|CAHC_TOBAC），它參與能量代謝和氮代謝，與植物的光合成有關(guān)。其他高表達(dá)轉(zhuǎn)錄本包括氧化還原酶家族蛋白、參與糖酵解的果糖二磷酸醛縮酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酰胺合成酶、硫基蛋白酶、絲氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶等。表達(dá)豐度最高的前10個(gè)轉(zhuǎn)錄本中有4個(gè)注釋到已知的酶類(lèi)。表達(dá)豐度位于第8位的轉(zhuǎn)錄本未得到注釋?zhuān)赡苁切禄颉?/p>

2.4 功能分類(lèi)研究 通過(guò)與擬南芥的蛋白質(zhì)組序列比對(duì)，獲得麻黃unigene的GO分類(lèi)信息。其中，8 926條unigene歸入“分子功能”（molecular function），8 743條歸入“生物學(xué)過(guò)程”（biological process），8 693條歸入“細(xì)胞組分”（cellular component）。在GO分類(lèi)體系中，分子功能、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞組分三大類(lèi)別被劃分為更詳細(xì)的45個(gè)小類(lèi)別，這一分類(lèi)結(jié)果顯示了麻黃草質(zhì)莖基因表達(dá)譜的總體特征，見(jiàn)圖1。

2.5 代謝途徑分析 在麻黃草質(zhì)莖EST文庫(kù)中，與次生代謝相關(guān)的unigene共130條。根據(jù)KEGG注釋結(jié)果，可將次生代謝途徑按照代謝物分為15類(lèi)，包括生物堿（alkaloid biosynthesis）、油菜甾醇類(lèi)（brassinosteroid biosynthesis）、咖啡因（caffeine metabolism）、類(lèi)胡蘿卜素（carotenoid biosynthesis）、二萜類(lèi)化合物（diterpenoid biosynthesis）、黃酮和黃酮醇（flavone and flavonol biosynthesis）、類(lèi)黃酮（flavonoid biosynthesis）、吲哚和吐根生物堿（indole and ipecac alkaloid biosynthesis）、檸檬烯和蒎烯降解（limonene and pinene degradation）、新生霉素生物合成（novobiocin biosynthesis）、苯丙烷類(lèi)生物合成（phenylpropanoid biosynthesis）、鏈霉素生物合成（streptomycin biosynthesis）、萜類(lèi)生物合成（terpenoid biosynthesis）、四環(huán)素生物合成（tetracycline biosynthesis）、玉米素生物合成（zeatin biosynthesis）。參與各類(lèi)次生代謝的unigene數(shù)目見(jiàn)圖2。

麻黃主要藥理活性成分麻黃堿類(lèi)化合物的生物合成途徑見(jiàn)圖3，麻黃生物堿的生物合成途徑屬于苯丙氨酸/酪氨酸途徑，在圖中以苯丙氨酸的合成及其代謝為麻黃生物堿為例，展示了麻黃生物堿的可能生源途徑。麻黃堿生物合成過(guò)程目前仍有幾個(gè)關(guān)鍵步驟和相關(guān)酶類(lèi)未得到闡明，在作者所得到的麻黃EST數(shù)據(jù)中，通過(guò)同源性搜索，找到19條unigene可能編碼麻黃堿生物合成途徑的9個(gè)關(guān)鍵酶。

2.6 轉(zhuǎn)錄因子分析 轉(zhuǎn)錄因子是一種序列特異的DNA結(jié)合蛋白，在調(diào)節(jié)響應(yīng)植物發(fā)育和環(huán)境變化過(guò)程中的基因表達(dá)發(fā)揮了重要作用。在對(duì)TAIR9自動(dòng)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行搜索之后，得到109條麻黃的unigene，見(jiàn)表4，它們代表了屬于不同轉(zhuǎn)錄因子家族的同源染色體，包括ARF，AUX/IAA，B3，MYB，basic HelixLoopHelix（bHLH），bZIP，Homeobox，Homeodomainlike/related，pathogenesisrelated/ERF，WRKY和Zinc finger家族蛋白。在麻黃的EST數(shù)據(jù)集中，表達(dá)豐度最高的轉(zhuǎn)錄因子家族是CCCH型鋅指蛋白aroD.3脫氫奎尼酸脫水酶 I；aroE.莽草酸脫氫酶；aroK.莽草酸激酶；aroA.3磷酸化莽草1羧基乙烯基轉(zhuǎn)移酶；aroC.分支酸合成酶；E5.4.99.5.分支酸變位酶；E4.2.1.91.羧基環(huán)己二烯基脫水酶；E2.6.1.1.天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；hisC.組氨酸磷酸轉(zhuǎn)氨酶；E4.3.1.24.笨丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；PTAL.苯丙氨酸/酪氨酸轉(zhuǎn)氨酶。

（zinc finger CCCH）家族，鋅指蛋白是在生物體中廣泛存在的具有典型鋅指結(jié)構(gòu)特征的超蛋白家族，幾乎參與了生物體生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段，主要分為9類(lèi)，其中CCCH型鋅指蛋白約占所有鋅指蛋白的0.8%，CCCH鋅指蛋白在生物與非生物脅迫、生長(zhǎng)發(fā)育、疾病方面都行使著不同的功能，表明CCCH是一類(lèi)極具研究?jī)r(jià)值的鋅指蛋白。此外，在麻黃的EST數(shù)據(jù)集中，生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（ARF）的表達(dá)豐度也比較高，ARF能夠與生長(zhǎng)素反應(yīng)原件特異性地結(jié)合并調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的表達(dá)，在激素介導(dǎo)的生長(zhǎng)刺激響應(yīng)中具有關(guān)鍵作用，這為深入研究生長(zhǎng)素的作用機(jī)制提供了分子層面的著眼點(diǎn)。從麻黃454EST數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的這些候選轉(zhuǎn)錄因子將有助于麻黃生長(zhǎng)發(fā)育及環(huán)境應(yīng)答相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)一步研究。

3 討論

本研究采用454 GS FLX Titanium高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)草麻黃5年生草質(zhì)莖的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序和功能分析，發(fā)掘其活性次生代謝物生物合成相關(guān)基因。GeneBank已有麻黃EST僅為1條，拼接得到的18 801條unigene，全部為本實(shí)驗(yàn)454測(cè)序所得。表明高通測(cè)序技術(shù)是大量發(fā)現(xiàn)麻黃功能基因的有效手段。

通過(guò)同源性搜索，獲得麻黃堿生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄本19條，編碼9個(gè)關(guān)鍵酶。由于對(duì)麻黃堿生物合成研究較少，其生物合成途徑中的2步關(guān)鍵反應(yīng)（反式肉桂酸鹽苯甲酸酯苯基丙烷二酮）的反應(yīng)機(jī)制及相關(guān)催化酶類(lèi)尚未得到闡明，因此對(duì)麻黃EST文庫(kù)的深入研究，將為麻黃堿生物合成研究提供良好的分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)和研究線索。此外，細(xì)胞色素P450家族在麻黃堿類(lèi)生物合成途徑中具有非常重要的作用，從麻黃EST文庫(kù)中，找到97條可能編碼細(xì)胞色素P450的unigene，這為篩選參與次生代謝的細(xì)胞色素P450酶相關(guān)基因提供了足夠的候選序列。

在麻黃草質(zhì)莖EST文庫(kù)中，與次生代謝相關(guān)的unigene共130條，其中與苯丙烷類(lèi)次生代謝相關(guān)的unigene多達(dá)47條，苯丙烷次生代謝途徑通過(guò)合成木質(zhì)素、類(lèi)黃酮等多種次生物質(zhì)而影響植物的許多重要性狀[18]，由此推測(cè)，麻黃草質(zhì)莖中，除了生物堿類(lèi)活性成分外，還可能含有較大量的黃酮類(lèi)和/或木質(zhì)素類(lèi)；與檸檬烯和蒎烯降解相關(guān)的unigene多達(dá)23條，由此推測(cè)，麻黃中可能含有揮發(fā)油類(lèi)。以上推論，得到了麻黃相關(guān)化學(xué)成分研究的證明[1921]。表明EST數(shù)據(jù)從分子生物學(xué)角度為藥用植物有效成分的研究提供了依據(jù)和研究基礎(chǔ)，這不僅為藥用植物有效成分生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的發(fā)現(xiàn)和克隆提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為麻黃堿生物合成途徑和調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，從而使采用生物技術(shù)手段進(jìn)行有效成分的在體或離體合成成為可能，也可為有效成分的分離分析提供佐證，減少藥用植物化學(xué)成分研究的盲目性，并促進(jìn)其生物學(xué)上的復(fù)雜行為的進(jìn)一步深入研究。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]