宮頸癌組織中FOXP3、PD-1及PD-L1蛋白的表達(dá)

韓麗萍，劉麗雅，孫曉慧，李 元，余海洋，張慶慶

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)安陽市腫瘤醫(yī)院婦產(chǎn)科 河南安陽 455000 4)鄭州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450007

宮頸癌組織中FOXP3、PD-1及PD-L1蛋白的表達(dá)

韓麗萍1)△，劉麗雅1,2)，孫曉慧3)，李 元1,2)，余海洋4)，張慶慶1,2)

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 2)河南省高等學(xué)校臨床重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052 3)安陽市腫瘤醫(yī)院婦產(chǎn)科 河南安陽 455000 4)鄭州市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450007

△女，1969年8月生，博士，教授，研究方向：婦科腫瘤與婦科內(nèi)分泌，E-mail：hanliping0825@163.com

宮頸癌； PD-1；PD-L1；FOXP3

目的：研究宮頸癌組織中FOXP3、PD-1及PD-L1蛋白的表達(dá)情況及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法：采用免疫組織化學(xué)SP法檢測64例宮頸癌組織、40例宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)組織、18例正常宮頸組織中PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：PD-1 、FOXP3蛋白主要表達(dá)于腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)，PD-L1 蛋白主要表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞及TIL。正常宮頸組織不表達(dá)PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白，宮頸癌組織中PD-1的表達(dá)顯著高于CIN和正常宮頸組織 (P<0.05) ；宮頸癌組織中PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白的表達(dá)與組織分化程度、FIGO分期有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、腫瘤直徑、HPV感染或分型無關(guān)(P>0.05)。宮頸癌組織中PD-L1與PD-1蛋白的表達(dá)呈正關(guān)聯(lián)(rS=0.562,P<0.001)。宮頸癌組織中FOXP3與PD-1 、PD-L1蛋白的表達(dá)無關(guān)聯(lián)(rS=0.218和0.257，P>0.05)。結(jié)論：人子宮頸癌組織高表達(dá)PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤密切相關(guān)。

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，近年來呈現(xiàn)年輕化的趨勢[1]。子宮頸局部微環(huán)境免疫監(jiān)視功能下降是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要原因，而腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)尤其 CD8+T 細(xì)胞數(shù)量減少和免疫無能起關(guān)鍵性作用[2]。TIL是存在于腫瘤間質(zhì)內(nèi)以T淋巴細(xì)胞為主的一種異質(zhì)性淋巴細(xì)胞群體。程序性死亡受體配體-1(programmed death ligand 1，PD-L1)，又稱B7-H1，是免疫反應(yīng)中極其重要的協(xié)同刺激分子。程序性死亡受體-1(programmed death 1，PD-1)屬于 CD28/CTLA-4 受體亞家族，表達(dá)在活化的 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞上。近來文獻(xiàn)[3]報(bào)道，多種惡性腫瘤異常表達(dá) PD-L1，高表達(dá)的PD-L1與TIL上的PD-1相結(jié)合，抑制了周圍淋巴細(xì)胞的活性，從而使腫瘤細(xì)胞逃避了免疫系統(tǒng)的監(jiān)視與攻擊。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)在免疫穩(wěn)態(tài)的維持中扮演者重要的角色[4]。叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead or winged helix transcription factor，F(xiàn)OXP3)目前被認(rèn)為是Treg細(xì)胞獨(dú)立的標(biāo)記物[5]。該研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法檢測PD-1、PD-L1、FOXP3 在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)、宮頸癌組織中的表達(dá)情況，探討它們與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為宮頸癌診斷及治療開拓新的方向。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2012年4月至2014年11月手術(shù)切除或活檢的蠟塊標(biāo)本，經(jīng)3名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師確診。宮頸癌標(biāo)本64例，按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期35例，Ⅲ、Ⅳ期29例；患者年齡33～66歲，中位年齡48歲；組織學(xué)分級：低分化28例，中分化22例，高分化14例。CIN標(biāo)本40例，其中CIN Ⅰ級10例、CIN Ⅱ級15例、CINⅢ級15例，患者年齡32～54歲，中位年齡42歲。正常宮頸組織18例，患者年齡34～51歲，中位年齡49歲。所有納入對象均未接受過放、化療等。

1.2 主要試劑與來源 小鼠抗人PD-1、FOXP3單克隆濃縮抗體和兔抗人CD3單克隆濃縮抗體均為英國Abcam公司產(chǎn)品，小鼠抗人PD-L1多克隆抗體購自R&D公司，兔/鼠通用型Streptavidin-HRP試劑盒(帶DAB顯色液)和檸檬酸緩沖液均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 PD-1、PD-L1、FOXP3蛋白表達(dá)的免疫組織化學(xué)SP法檢測 宮頸癌、CIN、正常宮頸組織均4 μm厚連續(xù)切片，按常規(guī)方法脫蠟至水并用微波修復(fù)抗原。采用免疫組織化學(xué)SP法檢測,按試劑說明書進(jìn)行操作。一抗PD-1(稀釋50倍)、PD-L1(稀釋33倍)、FOXP3(稀釋100倍)、CD3(稀釋150倍)單克隆抗體4 ℃孵育切片過夜，生物素標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗工作液室溫孵育30 min。DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染。以PBS代替一抗作為空白對照，采用已知蛋白表達(dá)陽性的結(jié)腸癌組織石蠟切片作為陽性對照。PD-L1、PD-1 陽性物為棕黃色顆粒，均定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)；FOXP3陽性物為黑色顆粒，定位于細(xì)胞核。每張切片中選取癌細(xì)胞數(shù)較多的5個高倍視野(×400)，每個視野計(jì)數(shù)100個細(xì)胞。染色強(qiáng)度：無著色記為0分，淡黃色記為1分，棕黃色記為 2分，棕褐色或黑色記為3分；陽性細(xì)胞百分比：無陽性細(xì)胞記為0分，陽性細(xì)胞小于25%記為1分，陽性細(xì)胞數(shù)在25%～50%記為2分，陽性細(xì)胞數(shù)大于50%記為3分。兩項(xiàng)得分相乘，結(jié)果 0～1 分為(-)，≥2分為(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，多個樣本率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩分類變量間的關(guān)聯(lián)分析采用列聯(lián)系數(shù)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同宮頸組織中PD-1、PD-L1和FOXP3蛋白的表達(dá) 見圖1和表1。正常宮頸組織無PD-1、PD-L1和FOXP3蛋白的表達(dá)。PD-1和FOXP3主要表達(dá)于TIL，宮頸癌細(xì)胞無表達(dá)； PD-L1 主要表達(dá)于宮頸癌細(xì)胞及TIL。CD3為T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD3陽性顆粒定位于TIL，TIL為小圓形，核大質(zhì)少，點(diǎn)樣分布。

A:正常宮頸組織；B:CIN組織；C:宮頸癌組織。圖1 不同宮頸組織中PD-1(1)、PD-L1(2)、FOXP3(3)蛋白的表達(dá)(SP,×400)

2.2 PD-1、PD-L1及FOXP3表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系 見表2。PD-1、PD-L1及FOXP3的表達(dá)與宮頸癌患者的年齡、腫瘤直徑及HPV感染或分型無關(guān)(P>0.05)，但與宮頸癌FIGO分期、組織學(xué)分級有關(guān)(P<0.05)。

2.3 宮頸癌組織中PD-1、PD-L1、FOXP3表達(dá)的關(guān)聯(lián)性分析 結(jié)果見表3～5。

表2 宮頸癌組織中PD-1、PD-L1及FOXP3表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

*：校正χ2檢驗(yàn)。

表3 宮頸癌組織中PD-1與PD-L1的關(guān)系 例

χ2=25.562，rS=0.562，P<0.001。

表4 宮頸癌組織中FOXP3與PD-1之間的關(guān)系 例

χ2=1.866，rS=0.218，P=0.172。

表5 宮頸癌組織中FOXP3與PD-L1之間的關(guān)系 例

χ2=2.788，rS=0.257，P=0.095。

3 討論

宮頸局部微環(huán)境免疫監(jiān)視功能下降及免疫逃逸現(xiàn)象的產(chǎn)生在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡和無反應(yīng)性是腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的主要機(jī)制，協(xié)同刺激分子及其相應(yīng)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與了這一過程。同時Treg細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)中主要發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，其在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中所起的作用逐漸受到了重視。

PD-1屬于免疫球蛋白超家族中的一員。許多腫瘤組織的淋巴細(xì)胞，尤其是T淋巴細(xì)胞中均可檢測到 PD-1 蛋白的表達(dá)[3]。PD-1表達(dá)于人多種類型細(xì)胞中，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞[6]。正常人淋巴組織生發(fā)中心中的T淋巴細(xì)胞表面可以檢測到PD-1的表達(dá)[7]。PD-1的結(jié)合配體是PD-L1。PD-L1通常表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面[8]。PD-L1也表達(dá)在其他類型的細(xì)胞中，如T細(xì)胞和B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓來源的肥大細(xì)胞[9]。正常情況下，組織細(xì)胞表面的 PD-L1 與淋巴細(xì)胞表面的 PD-1 結(jié)合后，可抑制淋巴細(xì)胞功能，誘導(dǎo)活化的淋巴細(xì)胞凋亡，從而在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[10]。PD-L1 與 PD-1 的結(jié)合可產(chǎn)生多種生物學(xué)作用，如能夠抑制淋巴細(xì)胞的增殖和活化、抑制CD4+T 細(xì)胞向 Th1 和 Th17 細(xì)胞分化、抑制炎性細(xì)胞因子的釋放，這些都起到了免疫負(fù)調(diào)控的作用[11]。

該研究結(jié)果表明PD-L1在宮頸癌組織的陽性表達(dá)率為81.3%，與Karim 等[12]報(bào)道的宮頸癌 PD-L1陽性表達(dá)率19%存在差異，原因可能與作者采用不同方法觀察以及宮頸癌患者來源于不同人種有關(guān)。該研究結(jié)果亦表明PD-1和PD-L1在正常宮頸、宮頸CIN及宮頸癌組織中的表達(dá)逐漸升高，可能是PD-L1 與 PD-1結(jié)合后抑制了間質(zhì)中淋巴細(xì)胞的功能及活性，從而促進(jìn)了腫瘤發(fā)生發(fā)展。同時，作者還發(fā)現(xiàn)PD-L1和PD-1在Ⅲ、Ⅳ期宮頸癌組織中的表達(dá)較Ⅰ、Ⅱ期宮頸癌組織高，提示PD-1/PD-L1通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移中的重要作用。Shi等[3]研究發(fā)現(xiàn),PD-1/PD-L1在腫瘤免疫逃逸中起著舉足輕重的作用，而阻斷PD-1/PD-L1通路則會增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞清除腫瘤的能力。

該研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中PD-1與PD-L1的表達(dá)有正關(guān)聯(lián)。馬薇等[13]認(rèn)為肺癌中癌間質(zhì)PD-L1表達(dá)與 PD-1 陽性淋巴細(xì)胞浸潤程度呈正相關(guān)。吳圣等[14]認(rèn)為PD-1和PD-L1在胃癌中的表達(dá)無顯著相關(guān)性。劉書漫等[15]則認(rèn)為胃癌中 PD-L1 表達(dá)與 PD-1 陽性的TIL數(shù)目呈負(fù)相關(guān)性。腫瘤組織中關(guān)于PD-1和PD-L1之間的相關(guān)性還沒有統(tǒng)一的結(jié)論，提示 PD-L1 的受體可能不僅僅只有 PD-1，可能還存在其他受體參與淋巴細(xì)胞功能的調(diào)控，有待于進(jìn)一步的研究。

Treg是一類多免疫調(diào)節(jié)T細(xì)胞。Treg細(xì)胞可以抑制其他T細(xì)胞的活化，阻礙機(jī)體的免疫系統(tǒng)對腫瘤的監(jiān)視[16]，并防止腫瘤相關(guān)抗原-抗體的有效的免疫反應(yīng)，從而為腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸提供有利環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。FOXP3是Treg細(xì)胞最特異的標(biāo)志，參與Treg細(xì)胞的激活及功能的調(diào)節(jié)[17]，是動態(tài)免疫平衡調(diào)節(jié)必不可少的因子。FOXP3缺失是導(dǎo)致自身免疫性疾病的重要因素[18]。以往的研究發(fā)現(xiàn)[19-20]，肺、乳腺、卵巢、結(jié)腸腫瘤患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平顯著高于健康受試者，且與臨床分期和荷瘤狀態(tài)密切相關(guān)。該研究發(fā)現(xiàn)FOXP3在宮頸癌和CIN組織中表達(dá)均高于正常宮頸組織，說明FOXP3+Treg細(xì)胞參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。Scott等[21]研究也發(fā)現(xiàn)FOXP3在宮頸癌及CIN組織中的表達(dá)明顯升高，且FOXP3的表達(dá)隨著CIN級別的升高而升高。該研究也發(fā)現(xiàn)FOXP3與PD-1及PD-L1的表達(dá)無關(guān)聯(lián)，另外該研究發(fā)現(xiàn)PD-1、PD-L1和FOXP3與患者HPV感染狀態(tài)無關(guān)，可能是與研究樣本數(shù)較少有關(guān)。

綜上所述，PD-1、PD-L1和FOXP3在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起到了一定的作用。PD-L1和PD-1分子有望成為有效的抗宮頸癌免疫治療靶點(diǎn)，但PD-L1 與 PD-1 在腫瘤免疫逃逸中的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。而FOXP3與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，已成為腫瘤研究中的重要因子，有望成為宮頸癌篩查及診療的重要標(biāo)志物。

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(2016-08-01收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Expression and correlation analysis of FOXP3, PD-1 and PD-L1 in the cervical cancer

HANLiping1)，LIULiya1,2),SUNXiaohui3),LIYuan1,2),YUHaiyang4),ZHANGQingqing1,2),

1)DepartmentofGynaecology,theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryofClinical-MedicineofHenan,Zhengzhou450052 3)DepartmentofGynaecology,TumorHospitalofAnyang,Anyang,Henan455000 4)DepartmentofGynaecology,ZhengzhouCentralHospitalAffiliated，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007

cervical cancer；PD-1；PD-L1；FOXP3

Aim: To explore the expression of PD-1, PD-L1 and FOXP3 proteins in human normal cervical tissues, cervical intraepithelial neoplasia，cervical cancer, and their relationship with clinical features. Methods: Immuno-histochemical SP method was used to detect the expressions of PD-1, PD-L1, FOXP3 in tissue obtained from 64 cases of cervical cancer, 40 cases of cervical intraepithelial neoplasia (CIN),18 cases of normal cervical tissue. Results: FOXP3, PD-1 was mainly expressed on TIL, PD-L1was mainly expressed in cervical cancer cells and TIL. There were no expression of PD-1, PD-L1,FOXP3 in normal cervical tissues. The positive expression rate of PD-1, PD-L1, FOXP3 in cervical cancer tissues was significantly higher than that in cervical CIN tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05); The expression of PD-1, PD-L1 and FOXP3 in cervical carcinoma was related to the degree of differentiation ，F(xiàn)IGO stage, the difference being statistically significant (P<0.05), and without any correlation with age, tumor size, HPV infection (P>0.05). The expression of PD-L1 and PD-1 in cervical carcinoma cells was positively correlated (rS=0.562,P<0.001). The expression of FOXP3 and PD-1 ，PD-L1 in cervical cancer tissue had no significant correlation(rS=0.218,0.257，P>0.05). Conclusion: The expression of PD-L1 and PD-1 in human cervical cancer tissues is increased, which is closely related to the occurrence, development, infiltration and metastasis of the tumor.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.022

R711.74