鹽酸氨基葡萄糖對膝骨關節(jié)炎膝關節(jié)軟骨下骨Ⅰ型膠原及骨鈣素表達的影響*

張 晨，馬 駿，呂雷鋒，班文瑞，張二洋，黨曉謙，王坤正

西安交通大學第二附屬醫(yī)院骨一科 西安 710004△男，1982年11月生，博士，副研究員，主治醫(yī)師，研究方向：骨壞死疾病的基礎與臨床研究，E-mail：osteozhang@163.com

鹽酸氨基葡萄糖對膝骨關節(jié)炎膝關節(jié)軟骨下骨Ⅰ型膠原及骨鈣素表達的影響*

張 晨△，馬 駿，呂雷鋒，班文瑞，張二洋，黨曉謙，王坤正

西安交通大學第二附屬醫(yī)院骨一科 西安 710004△男，1982年11月生，博士，副研究員，主治醫(yī)師，研究方向：骨壞死疾病的基礎與臨床研究，E-mail：osteozhang@163.com

Ⅰ型膠原；骨鈣素；骨關節(jié)炎；膝；鹽酸氨基葡萄糖

目的：探討鹽酸氨基葡萄糖對膝骨關節(jié)炎膝關節(jié)軟骨下骨Ⅰ型膠原及骨鈣素表達的影響。方法：選取46例因膝關節(jié)骨性關節(jié)炎行人工膝關節(jié)表面置換術的絕經(jīng)后女性患者，其中23例術前半年內(nèi)行鹽酸氨基葡萄糖治療12周，為觀察組，未服用者23例為對照組。術中留取2組膝關節(jié)脛骨平臺截骨后軟骨下骨組織0.5 cm3，分別行骨組織顯微CT檢測、Ⅰ型膠原膠原苦味酸-天狼星紅染色、骨鈣素免疫組化染色、Ⅰ型膠原及骨鈣素Western blot檢測。結(jié)果：經(jīng)顯微CT檢測發(fā)現(xiàn)，觀察組軟骨下骨小梁相對骨體積、骨小梁間隙、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目均較對照組有所改善，且觀察組Ⅰ型膠原和骨鈣素含量均較對照組增加(P<0.05)。Western blot檢測亦證實觀察組軟骨下骨Ⅰ型膠原及骨鈣素表達較對照組增多(P<0.05)。結(jié)論：鹽酸氨基葡萄糖可能通過調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原及骨鈣素的表達，從而改善女性膝關節(jié)骨性關節(jié)炎絕經(jīng)患者膝關節(jié)軟骨下骨的微結(jié)構(gòu)，進而改善膝關節(jié)軟骨下骨功能。

膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以膝關節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關節(jié)病，其病理特點為局灶性關節(jié)軟骨的退行性變，軟骨下骨質(zhì)變密，邊緣性骨軟骨骨贅形成和關節(jié)畸形[1]。近來研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，KOA早期已經(jīng)出現(xiàn)軟骨下骨轉(zhuǎn)化水平增強和骨小梁結(jié)構(gòu)改變，軟骨下骨在骨關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。因此有關軟骨下骨修復的研究已成為KOA研究的熱點。骨修復包括骨基質(zhì)的形成及骨的礦化。在骨的有機質(zhì)中，Ⅰ型膠原含量最高，在骨組織鈣鹽礦化過程中起支架作用[4-5]。Ⅰ型膠原的含量及結(jié)構(gòu)的改變均能影響骨質(zhì)的強度及韌性。骨鈣素作為一種反映骨更新率的指標，具有調(diào)節(jié)骨組織能量代謝的作用，在骨礦化高峰期出現(xiàn)聚集[6-7]。目前，臨床多選擇口服氨基葡萄糖類藥物改善關節(jié)軟骨的代謝。該研究選擇鹽酸氨基葡萄糖治療KOA，通過觀察軟骨下骨小梁微結(jié)構(gòu)、Ⅰ型膠原及骨鈣素的變化，探討KOA軟骨下骨的修復機制，為臨床診療提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 主要試劑及儀器 EDTA-2Na(西安交通大學醫(yī)學院實驗中心)，骨鈣素多克隆抗體、Ⅰ型膠原多克隆抗體及二抗(Abcam公司，美國)，放射免疫沉淀法(RIPA)總蛋白提取試劑盒(TaKaRa公司,日本)，丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、考馬斯亮藍(Amresco公司，美國)，ECL化學發(fā)光試劑盒(BIO-TEK公司，美國)，SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，中國)，膠原苦味酸-天狼星紅染色試劑盒(南京森倍加生物科技，中國)，eXplore Locus SP型顯微CT(GE公司，美國)。

1.2 研究對象的選取和分組 該研究為病例對照研究。所有受試者均為陜西省西安市的漢族絕經(jīng)女性，個體間無遺傳學關系，且在3代之內(nèi)沒有家族遷徙史。所有受試者半年內(nèi)無骨質(zhì)疏松相關藥物治療史、無骨代謝類疾病或相關藥物服用史?？紤]到肥胖是骨性關節(jié)炎的易感因素之一，作者參考亞洲人群體重指數(shù)(body mass index，BMI)的總體水平，在研究中排除了BMI≥27 kg/m2的個體。根據(jù)以上標準，自2014年3月至2015年6月，共從作者所在醫(yī)院骨一科住院患者中收集年齡在65～70歲因KOA行人工膝關節(jié)表面置換術且術前半年內(nèi)服用鹽酸氨基葡萄糖(商品名：步邁新)治療(750 mg/次，2次/d)12周的女性患者23例(觀察組)；收集同期基線資料相匹配的年齡在65～70歲因KOA行人工膝關節(jié)表面置換術但術前半年內(nèi)未服用鹽酸氨基葡萄糖治療的女性患者23例(對照組)。所有參與者簽署書面知情同意協(xié)議，該研究獲西安交通大學醫(yī)學倫理委員會批準。所有入組病例于術前采集基線資料，包括年齡、身高及體重，計算BMI、HSS評分、WOMAC評分及KSS評分。

1.3 標本采集及處理 2組患者均由同一主刀醫(yī)生行人工膝關節(jié)表面置換術。術中留取膝關節(jié)脛骨平臺截骨后軟骨下骨組織0.5 cm3。每組中8例標本即刻置于甲醛溶液中保存，行顯微CT檢測；8例標本即刻置于甲醛溶液中固定3 d，后于EDTA脫鈣液中脫鈣，石蠟包埋切片行膠原苦味酸-天狼星紅及骨鈣素免疫組化染色；7例標本即刻液氮冷凍行Ⅰ型膠原及骨鈣素的Western blot檢測。

1.4 顯微CT檢測 各組軟骨下骨標本置于樣品杯中心軸線，并利用Scan Control軟件實施標本掃描，應用美國GE公司eXplore Locus SP型顯微CT行軟骨下骨CT掃描，掃描分辨率14 μm，旋轉(zhuǎn)角度360°，旋轉(zhuǎn)角度增量0.4°，電壓80 kV，電流80 μA，曝光時間2 960 ms，幀平均數(shù)為4，像素組合為1×1。應用Reconstruction Utility軟件進行標本重建，然后選擇合適的定義框，應用MicroView軟件對重建標本進行三維表現(xiàn)與觀察，最后，應用骨形態(tài)分析軟件Advanced Bone Analysis對定義框內(nèi)的骨質(zhì)行骨小梁相對骨體積、骨小梁間隙、骨小梁厚度及骨小梁數(shù)目檢測。重復3次。

1.5 免疫組化染色法檢測軟骨下骨Ⅰ型膠原及骨鈣素的表達 收集各組待檢測的股骨頭標本，用PBS沖洗后置于體積分數(shù)10%中性甲醛溶液(0.1 mol/L,pH 7.4)內(nèi)固定3 d，之后置于體積分數(shù)15%EDTA緩沖液中脫鈣，每2 d更換1次脫鈣液。待組織脫鈣完全后，逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚切片，置于多聚賴氨酸處理的載玻片上，置于60 ℃烤箱2～3 h后，移入37 ℃烤箱過夜。首先按膠原苦味酸-天狼星紅染色試劑盒步驟行Ⅰ型膠原染色，偏光顯微鏡下觀察；然后行免疫組化SP法染色，應用鼠抗人骨鈣素多克隆抗體檢測骨鈣素的表達。檢測結(jié)果經(jīng)光鏡下拍照后運用FR-200紫外與可見光分析裝置圖像分析系統(tǒng)測量圖像灰度，分析積分光密度并行統(tǒng)計學分析。重復3次。

1.6 Western blot法檢測軟骨下骨Ⅰ型膠原及骨鈣素的表達 收集各組軟骨下骨，迅速放入含有液氮的研缽中研碎，加入RIPA裂解液在冰上勻漿，待充分裂解后，提取總蛋白。應用Western blot檢測軟骨下骨Ⅰ型膠原及骨鈣素表達。利用FR-200紫外與可見光分析裝置圖像分析系統(tǒng)對電泳結(jié)果進行圖像灰度分析。重復3次。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)。采用兩獨立樣本t檢驗或校正t檢驗比較2組各指標的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組患者基線資料比較 見表1。

表1 2組患者基線資料比較

2.2 Micro-CT形態(tài)計量學測定 結(jié)果見表2。

表2 2組Micro-CT掃描參數(shù)分析

*：校正t檢驗。

2.3 膠原苦味酸-天狼星紅染色結(jié)果觀察 根據(jù)膠原的單軸雙折光性，Ⅰ型膠原在苦味酸-天狼星紅染色中呈現(xiàn)紅色，Ⅲ型膠原呈現(xiàn)綠色。染色結(jié)果示對照組骨小梁已失去正常結(jié)構(gòu)，膠原纖維排列紊亂，Ⅰ型膠原表達量少，Ⅲ型膠原表達較多(圖1A)；觀察組可見骨小梁增厚，仍可見膠原連續(xù)性中斷，但較對照組改善(圖1B)。2組膝關節(jié)軟骨下骨Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達見表3。

A：對照組；B：觀察組。圖1 膝關節(jié)軟骨下骨膠原苦味酸-天狼星紅染色(×200)

2.4 骨鈣素免疫組化染色觀察 骨鈣素陽性表達為棕黃色，位于骨髓及成骨細胞周圍，骨小梁偶見陽性表達。對照組骨中骨鈣素呈弱陽性表達，骨小梁周圍成骨細胞罕見陽性表達(圖2A)；觀察組骨中骨鈣素呈陽性表達，骨小梁周圍成骨細胞也可見陽性表達(圖2B)。2組膝關節(jié)軟骨下骨骨鈣素的表達見表3。

A：對照組；B：觀察組。圖2 2組膝關節(jié)軟骨下骨骨鈣素免疫組化染色(×200)

表3 2組膝關節(jié)軟骨下骨Ⅰ、Ⅲ型膠原及骨鈣素的表達 %

*：校正t檢驗。

2.5 Western blot檢測結(jié)果 見圖3、表4，由圖3、表4可知，對照組及觀察組均可見Ⅰ型膠原及骨鈣素的表達，對照組Ⅰ型膠原、骨鈣素表達低于觀察組。

1：對照組；2：觀察組。圖3 Western blot檢測結(jié)果

組別nⅠ型膠原骨鈣素對照組737．26±6．540．18±0．08觀察組780．32±8．620．62±0．11t28．49021．390P<0．001<0．001

3 討論

KOA是一種以膝關節(jié)軟骨變性、破壞及骨質(zhì)增生為特征的慢性關節(jié)病。以往多認為骨關節(jié)炎始自關節(jié)軟骨細胞合成蛋白多糖的減少, 并逐漸發(fā)展為膠原纖維結(jié)構(gòu)改變, 最終導致關節(jié)軟骨退變[8-10]。然而，近年來有研究[11]認為在骨關節(jié)炎發(fā)病中軟骨下骨起著重要作用；骨關節(jié)炎早期關節(jié)軟骨退變之前,軟骨下骨已經(jīng)出現(xiàn)彈性模量減低、骨量減少的改變。

鹽酸氨基葡萄糖的主要成分2-氨基-2脫氧-葡萄糖鹽酸鹽是一種天然的小分子氨基多糖，是蛋白多糖合成的前體物質(zhì)[12]。目前研究[13-15]表明，氨基葡萄糖是蛋白多糖的構(gòu)成成分，它可同時促進關節(jié)軟骨基質(zhì)中膠原的合成、提高軟骨細胞的修復能力、促進軟骨基質(zhì)的修復和重建，從而延緩骨關節(jié)疼痛的病理過程和疾病的進程，改善關節(jié)活動度，緩解疼痛，延緩和改變骨關節(jié)炎的病理進程。因此，有關診治指南[16]推薦鹽酸氨基葡萄糖作為KOA治療的一線用藥。然而，針對氨基葡萄糖對軟骨下骨結(jié)構(gòu)影響的研究較少，其具體作用機制尚未闡明。

顯微CT掃描結(jié)果表明治療組軟骨下骨骨小梁相對骨體積、骨小梁間隙、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)目均較對照組有所改善，推測氨基葡萄糖在促進軟骨下骨骨形成及礦化過程中起到了積極的作用。

在正常骨組織中，Ⅰ型膠原約占骨基質(zhì)有機物質(zhì)的90%以上，其余為少量的Ⅲ型、微量的Ⅴ型及Ⅹ型膠原。Ⅰ型膠原的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)決定了其經(jīng)鈣鹽礦化后能夠提供強有力的支撐，其含量的改變決定了骨的強度與韌性。該研究結(jié)果顯示，對照組及觀察組Ⅰ型膠原均存在斷裂、粗細不等的改變，并可見Ⅲ型膠原的填充。觀察組Ⅰ型膠原含量較正常稍有下降，而對照組明顯低于觀察組。推測KOA的軟骨及軟骨下骨結(jié)構(gòu)的改變可能與Ⅰ型膠原含量及結(jié)構(gòu)的失穩(wěn)引起礦化作用減弱，骨小梁稀松，最終導致骨質(zhì)疏松微觀改變，在膝關節(jié)負重狀態(tài)下微結(jié)構(gòu)塌陷有關。而觀察組在一定程度上，通過氨基葡萄糖的作用促進關節(jié)軟骨下骨基質(zhì)中膠原的合成，以及軟骨下骨基質(zhì)的修復和重建，起到了一定的治療作用。

骨鈣素是成骨細胞分化的重要標記因子以及礦化和骨形成中至關重要的分泌蛋白，其在骨組織中含量較為豐富，主要作用是通過礦化作用與羥基磷灰石結(jié)合。該研究結(jié)果顯示，對照組膝關節(jié)軟骨下骨中骨鈣素含量下降，其可能的機制為關節(jié)軟骨下骨受損，骨細胞及成骨細胞活性降低使骨鈣素分泌減少。該研究結(jié)果表明，氨基葡萄糖可使軟骨下骨骨鈣素分泌增多，關節(jié)軟骨下骨的支撐能力增強，從而起到了一定的治療作用。

綜上所述，KOA軟骨下骨的生物力學改變是KOA發(fā)病過程中重要的病理學過程，其中Ⅰ型膠原及骨鈣素的表達異常與其具有一定的關系。鹽酸氨基葡萄糖能有效改善絕經(jīng)女性KOA患者膝關節(jié)軟骨下骨微結(jié)構(gòu)，可能通過調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原及骨鈣素表達，實現(xiàn)改善膝關節(jié)軟骨下骨功能的目的。但該研究未在基因?qū)用孢M行研究，未進一步探討Ⅲ型膠原的改變，仍需在后續(xù)研究中對相關機制進行深入研究。

[1]ARDEN NK,CRO S,SHEARD S,et al.The effect of vitamin D supplementation on knee osteoarthritis, the VIDEO study: a randomised controlled trial[J].Osteoarthritis Cartilage,2016,24(11):1858

[2]劉明,余曦,黃富國,等.組織工程雙相支架修復關節(jié)軟骨及軟骨下骨缺損研究進展[J].華西醫(yī)學,2014,29(4):783

[3]李西海,梁文娜.軟骨下骨骨重塑與骨關節(jié)炎的關系[J].國際骨科學雜志,2007,28(1):35

[4]PARK YJ,JUNG IH,KIM YK,et al.Guided bone regeneration using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide(EDC)-cross-linked type-Ⅰ collagen membrane with biphasic calcium phosphate at rabbit calvarial defects[J].Biomater Res,2015,19:15

[5]MANLEY E JR,PEROSKY JE,KHOURY BM,et al.Thrombospondin-2 deficiency in growing mice alters bone collagen ultrastructure and leads to a brittle bone phenotype[J].J Appl Physiol(1985),2015,119(8):872

[6]OKAMURA H,YOSHIDA K,OCHIAI K,et al.Reduction of protein phosphatase 2A Cα enhances bone formation and osteoblast differentiation through the expression of bone-specific transcription factor osterix[J].Bone,2011,49(3):368

[7]郭曉強. 骨鈣素:一種重要的能量代謝調(diào)節(jié)激素[J]. 生命科學,2011,23(1):102

[8]姜俊良,周予婧,林海丹,等. 膝骨關節(jié)炎運動療法國內(nèi)研究進展[J]. 華西醫(yī)學,2015,30(12):2373

[9]DEEP K,PICARD F,CLARKE JV.Dynamic knee alignment and collateral knee laxity and its variations in normal humans[J].Frontiers Surg,2015,2:62

[10]LI Q,DUAN WP,CAO XM,et al.Case-control study on the relationship between body mass index and lower limb alignment of patients with knee osteoarthritis[J].Zhongguo Gu Shang,2011,24(11):911

[11]ZHEN GH,CAO X.Targeting TGFβ signaling in subchondral bone and articular cartilage homeostasis[J].Trends Pharmacol Sci,2014,35(5):227

[12]BLIDDAL H,CHRISTENSEN RD,KRISTENSEN PK,et al.Glucosamine effectiveness in the treatment of knee osteoarthritis. Presentation of a Cochrane analysis with the perspective on the GAIT trial[J].Ugeskr Laeger,2006,168(50):4405

[13]HENROTIN Y,MARTY M,MOBASHERI A.What is the current status of chondroitin sulfate and glucosamine for the treatment of knee osteoarthritis?[J].Maturitas,2014,78(3):184

[14]KANG YH,PARK S,AHN C,et al.Beneficial reward-to-risk action of glucosamine during pathogenesis of osteoarthritis[J].Eur J Med Res,2015,20:89

[15]HENROTIN Y,LAMBERT C.Chondroitin and glucosamine in the management of osteoarthritis: an update[J].Curr Rheumatol Rep,2013,15(10):361

[16]中華醫(yī)學會骨科學分會.骨關節(jié)炎診治指南:2007年版[J].中華關節(jié)外科雜志(電子版),2007,1(4):281

(2016-04-25收稿 責任編輯徐春燕)

Effect of glucosamine hydrochloride on type I collagen and osteocalcin level in knee subchondral bone of patients with osteoarthritis

ZHANGChen,MAJun,LYULeifeng,BANWenrui,ZHANGEryang,DANGXiaoqian,WANGKunzheng

DepartmentofOrthopedics,theSecondAffiliatedHospital，Xi′anJiaotongUniversity,Xi'an710004

type Ⅰ collagen;osteocalcin;osteoarthritis;knee;glucosamine hydrochloride

Aim: To research the effect of glucosamine hydrochloride on type Ⅰcollagen and osteocalcin level in knee subchondral bone of patients with knee osteoarthritis.Methods: Forty-six postmenopausal female patients with knee osteoarthritis underwent TKA surgery were allocated into 2 groups, those accepted glucosamine hydrochloride oral administration for 12 weeks during the half year before surgery were observation group, and those without the glucosamine hydrochloride treatment were control group. The subchondral bone tissue(0.5 cm3) of tibial in the 2 groups was collected and detected by micro-CT, collagen picric acid sirius red staining, osteocalcin immunohistochemical staining, as well as collagen Ⅰ and osteocalcin Western blot detection. Results: Compared with control group, the relative bone volume, intertrabecular spaces, trabecular thickness and numbers of trabecular all improved in the observation group. According to collagen picric acid sirius red staining and immunohistochemical staining, the contents of type Ⅰ collagen and osteocalcin in the observation group were higher than those in control group(P<0.05). According to the results of Western blot，the expression levels of type Ⅰ collagen and osteocalcin in the observation group were higher than those in control group(P<0.05).Conclusion: Glucosamine hydrochloride can effectively improve the subchondral bone microstructure and function of knee in female patients with knee osteoarthritis by regulating the expressions of type Ⅰ collagen and osteocalcin in subchondral bone tissue.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.01.003

*國家自然科學基金資助項目 81301562；西安交通大學第二附屬醫(yī)院人才培養(yǎng)專項科研基金 RC(XM)201501

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