固定化Bacillus thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶的研究

陳 靜，陳 余，鹿劉奇，陳小娥，方旭波

(1.浙江海洋學院食品與藥學學院、醫(yī)學院，浙江 舟山 316000；2.樂清市樂成鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，浙江 樂清 325600)

固定化Bacillus thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶的研究

陳 靜1，陳 余2，鹿劉奇1，陳小娥1，方旭波1

(1.浙江海洋學院食品與藥學學院、醫(yī)學院，浙江 舟山 316000；2.樂清市樂成鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，浙江 樂清 325600)

采用吸附交聯(lián)技術(shù)，以DEAE-22纖維素為載體、戊二醛為交聯(lián)劑，固定Bacillus thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶，考察固定化酶的制備條件，并研究固定化酶的性質(zhì)。結(jié)果表明B.thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶的最佳固定化條件為：戊二醛體積分數(shù)3.0%、加酶量20mg、固定化時間10h；在此條件下制備的固定化殼聚糖酶的最適pH值和溫度分別為4.83和50℃；與游離酶相比，該固定化酶的熱穩(wěn)定性較好，在40℃和50℃條件下的半衰期(t1/2)分別為36.3h和6.2h，動力學常數(shù)Km值為9.19g/L；該固定化酶重復(fù)使用10批后活力仍可保持初始活力的88.32%。

殼聚糖；殼聚糖酶；固定化；吸附交聯(lián)；DEAE-22纖維素

殼聚糖(chitosan)又稱甲殼胺，是由氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成，其分子鏈上分布著許多羥基、氨基，還有一些N-乙酰氨基的線性大分子，也是自然界最豐富的多糖之一，其分子結(jié)構(gòu)與纖維素相似[1]，在食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的用途[2-4]。但因殼聚糖相對分子質(zhì)量較大，分子內(nèi)氫鍵引力較強，水溶性差，不易被人體吸收，從而使其應(yīng)用受到限制。

殼寡糖為殼聚糖的水解產(chǎn)物，具有水溶性好、易吸收等優(yōu)點，而且還具有抗細菌、真菌、調(diào)節(jié)機體免疫、抗癌及保水保濕等功能，在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域有較好的應(yīng)用前景，因而如何制備殼寡糖已成為人們研究的熱點[5]。目前，殼寡糖的制備方法主要有酸解法和酶解法，其中酸解法得率低，產(chǎn)物純化難，降解產(chǎn)物聚合度小，且對環(huán)境不友好；酶解法以產(chǎn)率高、反應(yīng)條件溫和且易控制、產(chǎn)物安全性好及所得低聚物聚合度適中等優(yōu)點而備受矚目。因此，利用殼聚糖酶降解殼聚糖已成為功能性殼寡糖生產(chǎn)的首選途徑[6-7]，也成為甲殼素工業(yè)的研究熱點和前沿。

盡管目前已經(jīng)在很多真菌、放線菌、細菌中，甚至在植物、病毒中也發(fā)現(xiàn)有此酶的存在[8-9]，而且越來越多的學者通過分離純化步驟得到了純酶，但由于目前殼聚糖酶的酶活力較低，加之游離酶存在一些不足，而采用固定化技術(shù)可以彌補游離殼聚糖酶的這些缺陷，使得酶的穩(wěn)定性增加、產(chǎn)物分離容易，并能實現(xiàn)連續(xù)操作，大幅度提高生產(chǎn)優(yōu)勢[10]。

在前期的研究工作中篩選到一株產(chǎn)殼聚糖酶的菌株Bacillus thuringiensis ZJOU-010，這是一種能以蝦殼粉(SSP)為唯一碳源和氮源產(chǎn)殼聚糖酶的菌株[11]。本實驗選用DEAE-22纖維素為載體、戊二醛為交聯(lián)劑固定化殼聚糖酶。由于DEAE-22纖維素及酶蛋白上均帶有氨基，可以與雙功能試劑戊二醛兩端的醛基發(fā)生Schiff反應(yīng)，從而將酶固定到纖維素上；此外DEAE-22纖維素還可以通過靜電作用和疏水作用對酶蛋白進行吸附。本實驗正是基于上述交聯(lián)和吸附的共同作用原理固定殼聚糖酶，并考察該酶的固定化條件及固定化酶的性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇云金芽孢桿菌(B. thuringiensis ZJOU-010)由本實驗室從水產(chǎn)加工企業(yè)周圍土壤中篩選得到，其16S rRNA的基因序列在Gene Bank 的登錄號為GU384894。作為碳源和氮源的蝦殼粉由浙江興業(yè)集團有限公司饋贈。

殼聚糖(脫乙酰度83%) 浙江天寶殼聚糖有限公司；DEAE-22纖維素(純度97%) 北京科源齊創(chuàng)生物科技有限公司；Sephadex G-150 Acros Organics公司；CMSephadex Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004電子分析天平 上海精密儀器儀表有限公司；HYG-11回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海新星自動化控制設(shè)備成套廠；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器材廠；UV-754型紫外-可見分光光度計 上海分析儀器廠；X-22 Centrifuge高速離心機 美國Beckman Coulter公司；AKTA快速液相蛋白層析儀(FPLC) 通用電氣(GE)公司。

1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3、蛋白胨10、NaCl 5、瓊脂15；種子培養(yǎng)基(g/L)：SSP 20、(NH4)2SO43、K2HPO40.2、MgSO40.3，pH7.0；產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：SSP 30、(NH4)2SO41、K2HPO40.2、MgSO40.3，pH7.0。

1.4 培養(yǎng)條件

種子培養(yǎng)：從培養(yǎng)好的斜面中，挑取一環(huán)菌種接入裝有40mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，32℃、160r/min培養(yǎng)24h。

產(chǎn)酶培養(yǎng)：將培養(yǎng)24h后的種子液，以3%接種量接種至產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于32℃、160r/min培養(yǎng)48h。

1.5 殼聚糖酶液的制備

將發(fā)酵液4℃、5000r/min冷凍離心15min，得到粗酶液，緩緩加入硫酸銨至飽和度80%，加完后繼續(xù)攪拌1h，沉降過夜，以上操作均在冰浴進行。4℃、12000r/min離心20min，沉淀用50mmol/L 醋酸鹽緩沖液(pH6.0)溶解，使用同樣緩沖液用Sephadex G-25脫鹽柱進行脫鹽處理，然后上CM-Sephadex柱進一步分離純化，按1.8.1節(jié)方法測定每管酶活力，收集酶活管即為殼聚糖酶液。

1.6 DEAE-22纖維素的交聯(lián)

稱取0.5g DEAE-22纖維素，加入一定量的戊二醛，室溫下攪拌4～5h，靜置過夜，離心去除上清液，將載體用蒸餾水反復(fù)沖洗以除去殘存的交聯(lián)劑戊二醛，抽濾，即得交聯(lián)載體。

1.7 殼聚糖酶的固定化

向交聯(lián)后的載體中加入殼聚糖酶液，使得酶蛋白與交聯(lián)載體的醛基發(fā)生Schiff反應(yīng)，同時被吸附于DEAE-22纖維素上。借助這種化學交聯(lián)和吸附作用固定殼聚糖酶，將獲得的固定化顆粒置于冰箱中靜置12h，期間定時取出攪拌一次，離心棄去上清液，沉淀物用蒸餾水反復(fù)沖洗，洗去游離酶，抽濾，即得固定化酶。

1.8 酶活力的測定

1.8.1 游離殼聚糖酶酶活力的測定

取酶液1mL，加入1mL 1g/100mL的殼聚糖溶液(pH5.0，脫乙酰度83%)和0.2mol/L的HAc-NaAc緩沖液(pH 5.0)3.5mL。在40℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)15min，立即加入2mL 3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑，混勻，置沸水浴中反應(yīng)5min，冷卻后定容至25mL，離心去除未水解的殼聚糖，取上清液測OD510nm值[12]。殼聚糖酶酶活力單位定義：在上述條件下，每分鐘水解底物形成相當于1μmol氨基葡萄糖時所用酶量為1個酶活力單位(U)。

1.8.2 固定化殼聚糖酶酶活力的測定

準確稱取1g固定化酶，加入1mL 1g/100mL的殼聚糖溶液(pH5.0，脫乙酰度83%)和0.2mol/L的HAc-NaAc緩沖液(pH 5.0)3.5mL。其他步驟同1.8.1節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固定化殼聚糖酶制備條件優(yōu)化

2.1.1 戊二醛體積分數(shù)對B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶活力的影響

戊二醛作為一種交聯(lián)硬化劑，可增加固定化酶的硬度和機械強度，使載體與殼聚糖酶緊密吸附，延長半衰期。但同時戊二醛對酶蛋白分子有一定的毒性，對酶有滅活作用，從而導(dǎo)致酶活性降低[13-14]。按1.6、1.7節(jié)的方法，取6份0.5g DEAE-22纖維素，分別加入不同體積分數(shù)的戊二醛溶液(1%、2%、3%、4%、5%、6%)20mL，制備固定化酶，并測定固定化酶的活力，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力，結(jié)果如圖1所示。在戊二醛體積分數(shù)較低時，隨著體積分數(shù)的增大，相對酶活力逐漸增大，當戊二醛體積分數(shù)為3%時，相對酶活力最高，之后再增大體積分數(shù)，由于戊二醛的毒性使得相對酶活力下降。

圖1 戊二醛體積分數(shù)對固定化B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶酶活力的影響Fig.1 Effect of glutaraldehyde concentration on enzyme activity of immobilized chitosanase

2.1.2 加酶量對B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶酶活力的影響

在0.5g DEAE-22纖維素、3%戊二醛的條件下，分別加入不同量的殼聚糖酶液，進行固定化，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力，加酶量對固定化酶相對酶活力的影響如圖2所示。

圖2 加酶量對固定化B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶酶活力的影響Fig.2 Effect of enzyme loading on enzyme activity of immobilized chitosanase

由于殼聚糖酶的固定化是交聯(lián)與吸附共同作用的結(jié)果，交聯(lián)載體上未進行Schiff反應(yīng)的醛基(可與酶蛋白的氨基反應(yīng))以及DEAE-22纖維素上的蛋白吸附位點作為殼聚糖酶固定時的結(jié)合位點，對酶的固定化起關(guān)鍵作用。由圖2可知，當加酶量比較小時，即結(jié)合位點達到飽和之前，所得固定化酶的相對酶活力隨加酶量的增加而增大；當加酶量高于20mg時，結(jié)合位點達到飽和，繼續(xù)增加的殼聚糖酶無法固定于載體上。

2.1.3 固定化時間對B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶酶活力的影響

在0.5g DEAE-22纖維素、3%戊二醛、20mg加酶量的條件下，4℃，不同固定化時間，以最高酶活力為100%，計算相對酶活力，結(jié)果如圖3所示。

圖3 固定化時間對固定化B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶酶活力的影響Fig.3 Effect of immobilization time on enzyme activity of immobilized chitosanase

由圖3可知，固定化時間對殼聚糖酶的活力產(chǎn)生顯著影響。固定化時間越長，載體DEAE-22纖維素上的活性結(jié)合位點與酶發(fā)生反應(yīng)越徹底，所得固定化酶的強度也越高，但是隨著時間的過度延長，固定化酶內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變的越緊密，不利于基質(zhì)的傳遞，從而使酶失活率增大。實驗表明，固定時間在10h左右比較合適，此時交聯(lián)載體上的所有醛基已與酶蛋白上的氨基發(fā)生Schiff反應(yīng)，且DEAE-22纖維素的吸附位點也已被酶蛋白所飽和。

2.2 固定化酶反應(yīng)條件優(yōu)化

2.2.1 pH值對B. thuringiensis ZJOU-010固定化酶活力的影響

分別用0.2mol/L不同pH值的HAc-NaAc (pH3.6～5.8)、Na/K 磷酸鹽 (pH5.8～8.0)和甘氨酸-NaOH (8.6～10.6)的緩沖溶液配制殼聚糖底物。取lmL上述不同pH值緩沖液配制的底物加入3.5mL對應(yīng)的緩沖液作為反應(yīng)體系，分別添加游離酶和固定化酶后于40℃反應(yīng)15min測定酶活力。以最高酶活力為100%，計算相對酶活力，pH值對游離殼聚糖酶和固定化酶相對酶活力的影響見圖4。

由圖4可知，游離B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶的最適pH值為5.5，而利用吸附交聯(lián)法所得的固定化酶最適pH值為4.83，相對于游離酶，固定化酶的最適pH值往酸性偏移，這是因為當酶被結(jié)合到DEAE-22纖維素這一聚合陽離子載體上時，固定化酶外面包裹了一層正電荷，由于氫離子和氫氧根離子在固定化酶的表面和體相溶液中不相等的分布，即氫氧根離子聚集于固定化酶的表面，因此固定化酶表面的pH值就高于體相的pH值，為了抵消這一影響，外部溶液的pH值向酸性偏移，才能使固定化酶的活力達到最大[15]。

圖4 pH值對B. thuringiensis ZJOU-010游離殼聚糖酶和固定化殼聚糖酶酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on activities of immobilized and free chitosanase

2.2.2 溫度對固定化B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶酶活力的影響

圖5 溫度對B. thuringiensis ZJOU-010游離殼聚糖酶和殼聚糖酶酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on immobilized and free chitosanase

溫度是催化反應(yīng)的重要條件，固定化酶要適應(yīng)生產(chǎn)，溫度也是重要參數(shù)。以最高酶活力為100%，計算相對酶活力。由圖5可知，游離殼聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，固定化酶的最適反應(yīng)溫度都為50℃，游離酶的溫度曲線走向更為陡峭，當反應(yīng)溫度為60℃時，游離酶僅保持了最初酶活力的45.31%，而經(jīng)過固定化后，殼聚糖酶酶活力還能保持74.62%，說明該酶經(jīng)過固定化后，熱穩(wěn)定性得到提高，對溫度的敏感性也有所下降。

2.2.3 固定化B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶的熱穩(wěn)定性

圖6 B. thuringiensis ZJOU-010游離殼聚糖酶和固定化殼聚糖酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of immobilized and free chitosanase

熱穩(wěn)定性是固定化酶的一個重要指標，將游離B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶和固定化酶分別置于40℃和50℃的水浴中保溫，每隔一定時間，取樣測定酶活力。以0h的酶活力為標準，計算各時刻的相對酶活力(RA)，以ln(RA)對時間作圖(圖6)。 B. thuringiensis ZJOU-010游離殼聚糖酶在40℃和50℃條件下的失活速率常數(shù)KD(各直線的斜率)分別為－0.046h-1和－0.256h-1，而固定化B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶在40℃ 和50℃下的失活速率常數(shù)KD分別為－0.020 h-1和－0.129h-1，由此可得出，該游離酶在40℃和50℃條件下的半衰期(t1/2)分別為15.6h和3.3h，該游離酶經(jīng)過固定化后的半衰期(t1/2)分別為36.3h和6.2h。說明該酶經(jīng)過固定化后熱穩(wěn)定性得到較大提高。

2.2.4 固定化B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶動力學參數(shù)的測定

圖7 雙倒數(shù)法求B. thuringiensis ZJOU-010游離殼聚糖酶和固定化殼聚糖酶的KmFig.7 Lineweaver-Burk plot for the determination of Km of free and immobilized chitosanase

分別測定游離殼聚糖酶及固定化酶在不同殼聚糖質(zhì)量濃度下的酶活性，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，即以1/V對1/[S]作圖，結(jié)果如圖7所示。經(jīng)線性擬合，得出游離酶的米氏常數(shù)Km值為1.53g/L，固定化酶的米氏常數(shù)Km值為9.19g/L，說明該殼聚糖酶經(jīng)過固定化后，表觀米氏常數(shù)增大，這是由于游離酶在固定的過程中，由于酶所處的微觀環(huán)境發(fā)生改變，同時酶的空間結(jié)構(gòu)受到限制，其活性部位無法完全與底物接觸，使得酶-底物復(fù)合體穩(wěn)定性下降，造成表觀米氏常數(shù)增大[16]。

2.2.5 固定化B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶反應(yīng)批次實驗

將0.5g固定化酶與10mL 1g/100mL殼聚糖溶液在50℃下連續(xù)反應(yīng)10次，每次反應(yīng)時間為6h，每次反應(yīng)后分別測定酶活力，以初始酶活力為100%，計算相對酶活力，結(jié)果如圖8所示。固定化酶的酶活力基本保持穩(wěn)定，反應(yīng)10批后，相對酶活還保持在88.32%，活力損失小于15%，由此可見，該固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性。

圖8 B. thuringiensis ZJOU-010固定化殼聚糖酶的操作穩(wěn)定性Fig.8 Repeated usability of immobilized chitosanase

3 結(jié) 論

B. thuringiensis ZJOU-010殼聚糖酶可以采用吸附交聯(lián)法進行固定，最佳的固定化條件為：戊二醛體積分數(shù)3.0%、加酶量20mg、固定化時間10h，制備的固定化酶的性質(zhì)包括最適pH值、最適溫度、米氏常數(shù)、熱穩(wěn)定性都發(fā)生了改變。固定化后殼聚糖酶的熱穩(wěn)定性得到了較大提高，此外，該固定化酶表現(xiàn)了較佳的操作穩(wěn)定性。本研究證明，固定化殼聚糖酶催化殼聚糖生產(chǎn)功能性殼寡糖是切實可行的，不僅能夠減少環(huán)境污染，而且增加了酶的使用批次，大大降低了生產(chǎn)成本，而且，本實驗所用的酶源B. thuringiensis ZJOU-010可以通過水產(chǎn)企業(yè)日益增多的副產(chǎn)物——SSP為唯一碳源和氮源大量增殖培養(yǎng)獲得，更增加了生物法生產(chǎn)殼寡糖的競爭力，應(yīng)用前景十分廣闊。

[1] 蔣挺大．殼聚糖[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2001: 33.

[2] MUZZARELLI R A A. Chitosan-based dietary foods[J]. Carbohydr Polym,1996, 29: 309-316.

[3] KNORR D. Recovery and utilization of chitin and chitosan in foodprocessing waste management[J]. Food Technology, 1991, 45(1): 114-118.

[4] 季更生, 陳愛春. 微生物殼聚糖酶的研究進展[J]. 食品科學, 2010,31(3): 297-301.

[5] MOON J S, KIM H K, KOO H C, et al. The antibacterial and immunostimulative effect of chitosan-oligosaccharides against infection by Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 75(5): 989-998.

[6] 曾嘉, 鄭連英. 幾丁質(zhì)固定化殼聚糖酶的研究[J]. 食品科學, 2001,22(10): 21-24.

[7] ADACHI W, SAKIHAMA Y, SHIMIZU S, et al. Crystal structure of family GH-8 chitosanase with subclass II specificity from Bacillus sp.K17[J]. Journal of Molecular Biology, 2004, 343(3): 785-795.

[8] PARK J K, SHIMONO K, OCHIAI N, et al. Purification, characterization,and gene analysis of a chitosanase (ChoA) from Matsuebacter chitosanotabidus 3001[J]. Journal of Bacteriology, 1999, 181(21):6642-6649.

[9] SUN Y Y, LIU W S, HAN B Q, et al. Purification and characterization of two types of chitosanase from a Microbacterium sp[J]. Analytical Chemistry, 2006, 28(17): 1393-1399.

[10] 王揚, 婁永江, 楊文鴿, 等. 酶法制備幾丁寡糖和殼寡糖研究現(xiàn)狀與進展[J]. 東海海洋, 2001, 19(4): 40-45.

[12] MILLER L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry, 1959, 31(4): 426-428.

[13] CHEN Jing, ZHENG Yuguo, SHEN Yinchu. Biosynthesis of pmethoxyphenylacetic acid from p-methoxyphenylacetonitrile by immobilized Bacillus subtilis ZJB-063[J]. Process Biochemistry, 2008, 43(9): 978-983.

[14] COOLING F B, FAGER S K, FALLON R D, et al. Chemoenzymatic production of 1, 5-dimethyl-2-piperidone[J]. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2001, 11(4/6): 295-306.

[15] 潘曉榕, 王艷糕, 周培根. 吸附交聯(lián)法和包埋法固定殼聚糖酶的比較研究[J]. 中國海洋大學學報, 2007, 37(3): 419-422.

[16] MIGNEAULT I, DARTIGUENAVE C, BERTRAND M J.G1utaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins,and application to enzyme crosslinking[J]. Biotechniques, 2004, 37(5):790-802.

Immobilization and Enzymatic Properties of Chitosanase from Bacillus thuringiensis ZJOU-010

CHEN Jing1，CHEN Yu2，LU Liu-qi1，CHEN Xiao-e1，F(xiàn)ANG Xu-bo1
(1. College of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316000, China；2. Agricultural Union Service Center of Yuecheng Town, Yueqing 325600, China)

The chitosanase in the fermentation broth of B.thuringiensis ZJOU-010 was immobilized by adsorption onto DEAE-22 cellulose and cross-linking with glutaraldehyde. The immobilization conditions of this enzyme were investigated. Apart from this, its enzymatic properties after the immobilization were characterized. The optimal enzyme immobilization process determined was that the immobilization was allowed to proceed for 10 h under the conditions of 3.0% glutaraldehyde concentration and 20 mg enzyme loading. The optimal pH and temperature of the immobilized enzyme obtained under these conditions were 4.83 and 50 ℃, respectively. It had better thermostability than its free counterpart, displaying half-lives of 36.3 h at 40 ℃ and 6.2 h at 50 ℃ and a kinetic parameter Km of 9.19 g/L. After being repeatedly used for 10 times, the residual activity of the immobilized enzyme as percentage of original activity was 88.32%.

chitosan；chitosanase；immobilization；cross-linking；DEAE-22 cellulose

TS210.1

A

1002-6630(2010)23-0326-05

2010-09-21

浙江省自然科學基金項目(Y305119)；浙江省優(yōu)先主題農(nóng)業(yè)項目(2008C12029)；2009年浙江省大學生科技創(chuàng)新活動計劃(新苗人才計劃)項目

陳靜(1979—)，女，講師，博士，研究方向為食品微生物學、海洋生物資源綜合利用。E-mail：chenjing1979@126.com