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    白藜蘆醇對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞葡萄糖代謝的影響

    2010-10-28 07:07:12陳思凡柯梁汝單智銘周妮曼
    食品科學(xué) 2010年23期
    關(guān)鍵詞:抵抗素脂聯(lián)素瘦素

    陳思凡,柯梁汝,鄭 琳,單智銘,周妮曼,馮 翔,*

    (1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,廣東省營養(yǎng)膳食與健康重點實驗室,廣東 廣州 510089;2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510089)

    白藜蘆醇對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞葡萄糖代謝的影響

    陳思凡1,柯梁汝2,鄭 琳1,單智銘2,周妮曼2,馮 翔1,*

    (1.中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,廣東省營養(yǎng)膳食與健康重點實驗室,廣東 廣州 510089;2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院,廣東 廣州 510089)

    目的:研究白藜蘆醇(resveratrol,Res)對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞葡萄糖代謝的影響,并探討其分子機制。方法:用地塞米松誘導(dǎo)3T3-L1細胞建立胰島素抵抗模型,用不同劑量Res進行干預(yù),添加或不添加胰島素刺激,測定各組細胞的葡萄糖消耗量,實時熒光定量PCR檢測各組細胞的脂聯(lián)素(adiponectin)、瘦素(leptin)和抵抗素(resistin)mRNA表達,Western blotting檢測腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的蛋白質(zhì)表達及磷酸化水平。結(jié)果:各組細胞經(jīng)胰島素刺激,0.01、0.1、1μmol/L的Res組的葡萄糖消耗量分別是對照組的1.3、1.5、1.4倍(P<0.05),添加Res可促進脂聯(lián)素、瘦素mRNA的表達,降低抵抗素mRNA表達,增加AMPKα的磷酸化水平。結(jié)論:Res可以明顯改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1細胞葡萄糖代謝。其機制可能是通過增加脂聯(lián)素、瘦素表達,降低抵抗素表達從而介導(dǎo)AMPKα磷酸化實現(xiàn)的。

    白藜蘆醇;胰島素抵抗;脂聯(lián)素;瘦素;抵抗素;脂肪細胞;糖代謝

    白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種多酚類化合物,具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗炎等作用,可廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品和化妝品等領(lǐng)域。研究表明,Res對于組織和細胞能量代謝有廣泛的影響,可通過增加葡萄糖轉(zhuǎn)運子(glucose transporter,Glut)的表達來增加骨骼肌細胞的葡萄糖攝取[1],還可以減少脂肪細胞的脂質(zhì)形成,抑制前脂肪細胞向脂肪細胞分化[2]。然而,有關(guān)Res對于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細胞的葡萄糖代謝的作用及機制研究相對較少。本實驗選取3T3-L1脂肪細胞作為研究對象,旨在探討Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1細胞葡萄糖代謝的作用及其機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    3T3-L1細胞株,購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

    白藜蘆醇、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、合成人胰島素 美國Sigma公司;高糖DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清 美國Gibco公司;葡萄糖診斷試劑盒 瑞士Roche公司;Trizol 美國Invitrogen公司;Real time PCR試劑盒 日本TaKaRa公司;兔抗AMPKα、AMPKα Thr172單克隆抗體 美國CST公司;兔抗GAPDH單克隆抗體 Boster公司;BCA試劑盒、HRP標(biāo)記的抗兔二抗 Beyotime公司。

    1.2 方法

    1.2.1 3T3-L1脂肪細胞的誘導(dǎo)分化

    3T3-L1前脂肪細胞接種于6孔培養(yǎng)板,待細胞匯合后接觸抑制48h,換用含0.5mmol/L IBMX、1μmol/L地塞米松、10mg/L胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h,然后換用含10mg/L胰島素的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h,隨后再換用DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),每2d換液1次,培養(yǎng)4d,90%以上細胞分化為成熟脂肪細胞。

    1.2.2 胰島素抵抗模型的建立

    對3T3-L1脂肪細胞進行分組,添加1μmol/L的地塞米松作為胰島素抵抗模型組,培養(yǎng)24h后給予100nmol/L的胰島素,刺激15min后取培養(yǎng)基,計算培養(yǎng)基中葡萄糖消耗量,與非胰島素抵抗組(100nmol/L胰島素刺激15min)對比,評價胰島素抵抗的程度。

    1.2.3 葡萄糖消耗量的測定

    建立胰島素抵抗模型后,分別添加0、0.01、0.1、1μmol/L的Res,作用24h,每個劑量組平行分為兩組,給予或不給予100nmol/L的胰島素刺激15min,收集各組的培養(yǎng)基,按照葡萄糖診斷試劑盒說明書,在全自動生化分析儀上測定各實驗組和原DMEM培養(yǎng)基的葡萄糖含量,葡萄糖消耗量為DMEM培養(yǎng)基葡萄糖量與實驗組培養(yǎng)基葡萄糖量之差。以不加任何藥物的組別為對照組,此組的葡萄糖消耗量設(shè)為100,其他組與之相比。

    1.2.4 實時熒光定量PCR檢測脂聯(lián)素、瘦素和抵抗素mRNA表達

    細胞經(jīng)實驗干預(yù)后用Trizol抽提細胞總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT步驟:取1g/L的RNA 1μL,分別加入4μL的5×PrimeScriptTMBuffer、1μL的RT Enzyme Mix Ⅰ、1μL的Oligo dT Primer、1μL的Random 6 mers,補充13μL的DEPC水,RT反應(yīng)液總體積為20 μL,37℃ RT 15min,85℃ 5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶。RT后以cDNA為模板進行擴增。PCR步驟:取2μL的cDNA溶液,分別加入10 μL的2×SYBR Premix Ex TaqTM、0.4μL的Forward Primer、0.4μL的Reverse Primer、0.4μL的50×ROX Reference DyeⅡ,補充6.8μL的dH2O,PCR反應(yīng)液總體積為20μL。擴增條件:95℃預(yù)變性30s,95℃ 5s變性、55℃ 30s退火、72℃ 30s延伸,擴增40個循環(huán)。引物為:脂聯(lián)素正義鏈5'-GTC AGT GGA TCT GAC GAC ACC AA-3'、反義鏈5'-ATG CCT GCC ATC CAA CCT G-3',PCR產(chǎn)物171bp;瘦素正義鏈5'-CCA GGA TCA ATG ACA TTT CAC ACA C-3'、反義鏈5'-AGG TCA TTG GCT ATC TGC AGC AC-3',PCR產(chǎn)物184bp;抵抗素正義鏈5'-TTG GCT TAA ATT GCT GGA CAG TCT C-3'、反義鏈5'-GGA AGC GAC CTG CAG CTT ACA-3',PCR產(chǎn)物191bp;β-actin正義鏈5'-CAT CCG TAA AGA CCT CTA TGC CAA C-3'、反義鏈5'-ATG GAG CCA CCG ATC CAC A-3',PCR產(chǎn)物171bp。Real time PCR反應(yīng)引物由TaKaRa公司設(shè)計并合成。用Sequence Detection System軟件分析各組的循環(huán)閥值(Ct),通過計算2-△△Ct得出各組基因的相對表達水平。

    1.2.5 Western blotting檢測AMPKα蛋白表達及磷酸化水平

    用NP-40裂解細胞,提取細胞總蛋白,采用BCA法進行蛋白定量。灌制10%的分離膠和5%的濃縮膠,恒壓120V、80mA預(yù)電泳10min,上樣,進行SDS-PAGE電泳,半干式轉(zhuǎn)移,5%脫脂奶粉室溫封閉1h,一抗按照1:1000的稀釋度于4℃孵育過夜,二抗(1:5000)室溫孵育1h,暗房中滴加發(fā)光底物混合物2mL于膜上,用X光片曝光、顯影、定影。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

    采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件,各組比較采用單因素方差分析,組間比較用Bonferroni法,檢驗水準(zhǔn)α=0.05,P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響

    正常狀態(tài)下3T3-L1脂肪細胞經(jīng)胰島素刺激后,葡萄糖的消耗量極顯著增加(P<0.01)。添加地塞米松后,加胰島素刺激,與對照組相比,葡萄糖消耗量無明顯變化,說明細胞出現(xiàn)胰島素抵抗(圖1A)。用0、0.01、0.1、1μmol/L的Res處理胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的細胞,經(jīng)胰島素刺激后,各處理組與對照組比較,葡萄糖消耗量均顯著增加(P<0.05),而未經(jīng)胰島素刺激,與對照組比較,0.1μmol/L處理組葡萄糖消耗量增加(P<0.05,圖1B)。

    圖1 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量的影響Fig.1 Effect of resveratrol on glucose consumption of insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

    2.2 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細胞脂聯(lián)素、瘦素和抵抗素mRNA表達的影響

    圖2 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素、瘦素和抵抗素mRNA表達的影響Fig.2 Effect of resveratrol on mRNA expression of adiponectin, leptin and resistin of insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

    由圖2可知,給予或不給予胰島素刺激,與相應(yīng)的對照組比較,Res組脂聯(lián)素的mRNA表達均顯著增加(P<0.05,圖2A);不給予胰島素刺激,與對照組比較,0.1、1μmol/L的Res組瘦素的mRNA表達顯著增加(P<0.05),而給予胰島素刺激,3個劑量組瘦素的mRNA表達均顯著增加(P<0.05,圖2B);給予或不給予胰島素刺激,與對照組比較,0.1、1μmol/L的Res組抵抗素的mRNA表達顯著下降(P<0.05,圖2C)。

    2.3 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細胞AMPKα蛋白表達及磷酸化水平的影響

    圖3 Res對胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下脂肪細胞AMPKα的蛋白表達及磷酸化水平的影響Fig.3 Effect of resveratrol on the phosphorylation of AMPK|á in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

    由圖3可知,給予或不給予胰島素刺激,與相應(yīng)的對照組比較,R es組的p-A MPKα表達升高,即AMPKα Thr172的磷酸化水平增加,而AMPKα的總蛋白表達無明顯變化。

    3 討 論

    胰島素與細胞膜上的胰島素受體結(jié)合后,激活受體的內(nèi)源性酪氨酸激酶活性,導(dǎo)致自身磷酸化和胰島素受體底物(IRS)的酪氨酸磷酸化。活化的IRS可磷酸化下游的PI3K和akt,從而促進Glut4遷移到胞膜上介導(dǎo)組織細胞利用葡萄糖[3]。體內(nèi)和體外研究證明,Res可以增加依賴或非依賴胰島素的葡萄糖轉(zhuǎn)運[4],其機制尚不完全清楚。本實驗結(jié)果顯示,無論胰島素存在與否,Res均能增加胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞葡萄糖的攝取,但在有胰島素刺激時,3種濃度的Res組均正向促進葡萄糖轉(zhuǎn)運,而在缺乏胰島素刺激的條件下,只有0.1μmol/L的Res組增加胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下細胞葡萄糖的攝取,提示Res改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下細胞的葡萄糖代謝可能通過IRS-PI3K-akt- Glut4通路,而且可能還存在其他不依賴胰島素的通路,有待進一步的探討。

    脂聯(lián)素、瘦素和抵抗素都是脂肪細胞分泌的因子。研究顯示,脂聯(lián)素可增加胰島素的敏感性和脂肪組織的氧化,最終減少循環(huán)中脂肪酸水平和減少肝臟和脂肪細胞的TG水平[5],從而改善胰島素抵抗。有研究證明,恒河猴自發(fā)展為2型糖尿病的過程中,脂聯(lián)素含量下降,高胰島素鉗夾實驗顯示,隨著胰島素抵抗的加重,血中脂聯(lián)素水平逐漸降低[6]。本實驗結(jié)果顯示,無論胰島素存在與否,Res都可使胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下的3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素的mRNA表達增加,提示Res可能通過增加脂聯(lián)素的表達水平來改善胰島素抵抗。

    瘦素主要是由白色脂肪組織分泌的,且只有在成熟的脂肪細胞中才表達[7]。瘦素通過中樞神經(jīng)遞質(zhì)抑制食欲,促進糖脂代謝,參與多種內(nèi)分泌激素的相互協(xié)調(diào),以控制肥胖的發(fā)生發(fā)展[8]。在對3T3-L1細胞的研究中發(fā)現(xiàn),瘦素不能直接誘導(dǎo)脂肪細胞凋亡,但能直接抑制前脂肪細胞的成熟分化,減少細胞中的脂質(zhì)堆積[9]。本實驗結(jié)果顯示,Res組瘦素mRNA表達增加,提示Res改善胰島素抵抗可能與增加瘦素的表達有關(guān)。

    抵抗素是由脂肪細胞分泌的多肽類激素。研究表明,在胰島素抵抗的動物體內(nèi)抵抗素水平明顯高于正常個體,降低血清抵抗素水平能減少脂肪沉積,提高胰島素的敏感性[10]。抵抗素通過降低胰島素刺激的葡萄糖攝取來降低脂肪細胞、骨骼肌細胞和肝細胞以及胰腺β細胞的胰島素敏感性,誘導(dǎo)產(chǎn)生胰島素抵抗。本實驗結(jié)果顯示,經(jīng)過或不經(jīng)過胰島素刺激,0.1、1μmol/L的Res組抵抗素的mRNA表達都下降,因此推測Res改善胰島素抵抗可能與下調(diào)抵抗素的表達有關(guān)。

    AMPK廣泛存在于真核細胞中,屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶家族成員,是一個異源三聚體,由具有催化作用的α亞基和具有調(diào)節(jié)作用的β和γ亞基構(gòu)成,α亞基對整個激酶的活性是必需的。當(dāng)代謝性應(yīng)激引起細胞內(nèi)AMP/ATP比值升高時,AMPK發(fā)生磷酸化并激活其下游靶分子,減少ATP的消耗和增加ATP的生成,即促進分解代謝;當(dāng)AMP/ATP比值降低時,AMPK則促進合成代謝。對2型糖尿病患者和正常對照組進行的體外實驗顯示,5-氨基-4-咪唑甲酰胺核苷酸(AICAR,AMPK的激活劑)通過增加細胞表面Glut4含量,增加葡萄糖轉(zhuǎn)運,這一過程依賴AMPK途徑[11]。在大鼠原代脂肪細胞中,脂聯(lián)素可通過磷酸化AMPK和ACC,促進細胞攝取葡萄糖[12]。在骨骼肌細胞中,瘦素可激活A(yù)MPKα2 亞單位的活性,加速脂肪酸氧化作用[13]。抵抗素可通過抑制AMPK活性而作用于脂肪、肝臟及骨骼肌等胰島素靶器官,促進肝糖輸出,導(dǎo)致產(chǎn)生胰島素抵抗[14-15]。本實驗結(jié)果顯示,無論胰島素存在與否,Res都增加胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞AMPKα的磷酸化水平。提示Res可能通過增加細胞脂聯(lián)素與瘦素的表達,減少抵抗素的表達,從而增加AMPKα磷酸化,活化AMPKα經(jīng)或不經(jīng)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(IRSPI3K-akt),促進Glut4的轉(zhuǎn)位,增加葡萄糖轉(zhuǎn)運,改善胰島素抵抗。

    綜上所述,Res增加胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下3T3-L1脂肪細胞的葡萄糖代謝,改善其胰島素抵抗。Res可能通過增加脂聯(lián)素和瘦素的表達并下調(diào)抵抗素的表達,進而增加AMPK的磷酸化水平,經(jīng)過或不經(jīng)過胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,增加葡萄糖攝取。本研究結(jié)果可為Res防治2型糖尿病及其他代謝綜合征提供理論依據(jù)。

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    Effect of Resveratrol on Glucose Metabolism in Insulin-resistant 3T3-L1 Adipocytes

    CHEN Si-fan1,KE Liang-ru2,ZHENG Lin1,SHAN Zhi-ming2,ZHOU Ni-man2,F(xiàn)ENG Xiang1,*
    (1. Guangdong Provincial Key Laboratory of Food, Nutrition and Health, School of Public Health, Sun Yat-sen University,Guangzhou 510089, China;2. Zhongshan School of Medicine, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510089, China)

    Objective: To explore the effect and mechanism of resveratrol on glucose metabolism in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes. Methods: Insulin-resistant model was established by the induction of dexamethasone in 3T3-L1 adipocytes. The glucose consumption of insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes with and without resveratrol stimulation was determined. The mRNA expression of leptin, adiponectin and resistin was determined by real time PCR, and the expression and phosphorylation of AMPK α were determined by Western blotting. Results: After insulin stimulation with the concentration of 0.01, 0.1μmol/L and 1μmol/L, resveratrol could increase the glucose consumption by 1.3, 1.5 folds and 1.4 folds compared with the control (P < 0.05).Meanwhile, resveratrol could increase mRNA expression of adiponectin and leptin and decrease mRNA expression of resistin.Moreover, resveratrol increased the phosphorylation of AMPKα. Conclusion: Resveratrol can improve glucose metabolism in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes. The molecular mechanism may be the phosphorylation of AMPK α by increasing the expression of adiponectin and leptin and inhibiting the expression of resistin.

    resveratrol;insulin resistance;adiponectin;leptin;resistin;fat cells;AMPK

    Q946.8

    A

    1002-6630(2010)23-0285-04

    2010-03-22

    廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項目(A2010143)

    陳思凡(1984—),男,碩士,研究方向為營養(yǎng)與健康。E-mail:dishi1984@126.com

    馮翔(1969—),男,副教授,博士,研究方向為營養(yǎng)與健康。E-mail:fengx@mail.sysu.edu.cn

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