馬錢子水煎液對(duì)肺癌細(xì)胞體內(nèi)外的抑制作用

張舒慧，林玉坤，李海云，段永健，杜鋼軍

1.河南大學(xué)藥學(xué)院 藥物研究所，河南 開封 475004； 2.河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 開封 475004

我國由于工業(yè)發(fā)展，空氣污染加劇，人口老齡化加重，城市人口比較集中等，肺癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人們健康的原因。目前，肺癌已經(jīng)成為我國最常見的惡性腫瘤之一，位居癌癥死因第一名[1]。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療理念注重局部治療，目前治療腫瘤的有效手段主要是化療，但其毒副作用大，是最大的缺點(diǎn)[2]。關(guān)念波等[3]已經(jīng)證明，中醫(yī)藥可以避免現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的缺點(diǎn)。中醫(yī)藥治療疾病注重整體治療，講究陰陽平衡，中醫(yī)藥治療在增強(qiáng)機(jī)體免疫功能、調(diào)節(jié)體內(nèi)各臟腑生理平衡方面有獨(dú)到優(yōu)勢。

肺癌的形成是“正氣不足，而后邪氣踞之”所致。在疾病早期，邪氣壅盛，正氣虧虛，實(shí)多虛少，應(yīng)以攻邪為主、扶正為輔。馬錢子科常綠喬木植物馬錢的成熟種子馬錢子是一味中藥，在本草綱目中就早有記載：苦，寒，有大毒，歸肝、脾經(jīng)。馬錢子具有散結(jié)消腫，通絡(luò)止痛的功效[4]。謝寶仙等[5]研究了馬錢子的主要有效成分是馬錢子堿和的士寧。有文獻(xiàn)[6]稱馬錢子中有效成分可以顯著抑制肺癌細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)為了研究馬錢子水煎液對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和遷移的作用，并驗(yàn)證其在體內(nèi)的過程，建立小鼠Lewis氣管滴注模型，觀察馬錢子水煎液對(duì)體內(nèi)Lewis腫瘤細(xì)胞的影響和小鼠生理病理變化。

1 材料

1.1 試劑及其配制

PBS：NaCl 8 g,KCl 0.2 g,Na2HPO4·12H2O 3.63 g,KH2PO40.24 g,溶于900 mL雙蒸水中,用鹽酸調(diào)pH值至7.4,加蒸餾水定容至1 L;DMEM/1640培養(yǎng)基。

胰蛋白酶消化液：先配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶，取0.5g胰酶充分溶解于200 mL冷浴過的D-Hanks中；再配制體積分?jǐn)?shù)為0.2%的EDTA，即取0.2 g EDTA充分溶解于100 mL D-Hanks中，然后量取質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶2份和體積分?jǐn)?shù)0.2%的EDTA溶液1份混勻，無菌過濾，分裝至小瓶中，密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

MTT：稱取10 mg MTT，加入到2 mL的PBS中，充分溶解，即PBS 5 g/L,避光處理，現(xiàn)用現(xiàn)配。

馬錢子水煎液：馬錢子水煎液離心后，無菌過濾，放置4 ℃冰箱保存，為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用(體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用體積分?jǐn)?shù)為0.5%的CMC-Na配置)。

蘇木精：配制完成之后成熟3 mon后使用。

鹽酸酒精： 取0.75 mL濃鹽酸加入到體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇100 mL中混勻。

伊紅：取體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精100 mL，加入到0.75 g伊紅中，攪拌1 h，靜置，使用上清。

CMC-Na：取CMC-Na 0.5 g和蒸餾水100 mL配置。

馬錢子水煎液的制備：取生馬錢子加水煎煮，濃縮備用。

1.2 動(dòng)物與細(xì)胞

昆明小鼠，體質(zhì)量(20～28)g，河南大學(xué)藥理實(shí)驗(yàn)室提供；小鼠肺癌Lewis細(xì)胞(上海細(xì)胞研究所)，取完全培養(yǎng)基DMEM+體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，在含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

OptiMairTM垂直流超凈工作臺(tái)(新加坡藝思高科技有限公司)；GX71/GX51倒置金相系統(tǒng)顯微鏡(奧林巴斯中國有限公司)；電熱恒溫烘干箱(旭朗機(jī)械設(shè)備企業(yè))；立式高壓蒸汽滅菌鍋(濟(jì)南博鑫生物技術(shù)有限公司)；立式超大容量冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)；海爾冰箱BCD-329WDVL(海爾集團(tuán))；細(xì)胞培養(yǎng)箱(浙江賽德儀器設(shè)備有限公司)；西馬力/BMA 非接觸式點(diǎn)溫儀(北京西馬力檢測儀器有限公司)；電子天平(舜宇恒平上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；XPE504精密電子天平(梅特勒-托利多國際有限公)；YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀(北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)；英泰TD4B迷你型低速離心機(jī)(長沙英泰儀器有限公司)；90-2恒溫磁力攪拌器(北京浩開科技有限公司)；CUT6062全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(SLEE醫(yī)療有限公司)；HH-S4多孔恒溫水浴鍋(上海況勝實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)；美國BIOTEK ELx808吸收光酶標(biāo)儀(上海珂淮儀器有限公司)。

2 方法

2.1 體外實(shí)驗(yàn)

2.1.1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，以每孔6×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板上，每個(gè)藥物濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，24 h之后加入不同濃度的馬錢子水煎液(設(shè)置濃度梯度為0、2.5、5、10、20 g/L)。用馬錢子水煎液分別處理48 h后加入配好的MTT(5 g/L，PBS配)在培養(yǎng)箱里培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入100 μL二甲基亞砜(DMSO)，結(jié)晶充分溶解后用酶標(biāo)儀在490 nm處測量其吸光度，計(jì)算抑制率和生長指數(shù)。

存活率(%)=A(加藥組)/A(對(duì)照組)×100%。

2.1.2 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 選擇對(duì)數(shù)生長期的Lewis細(xì)胞，胰蛋白酶消化，用完全培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基)調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于3孔板中，每孔200μL，在體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2、37 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞單層鋪滿6孔板底部，用無菌的10μL槍頭在孔中劃平行的劃痕，用無菌PBS沖洗劃落的細(xì)胞3次，設(shè)置模型組和給藥組，模型組加入完全培養(yǎng)基，給藥組加入馬錢子水煎液和低濃度血清的DMEM培養(yǎng)基，于0、12、24h進(jìn)行觀察，拍照，檢測其遷移能力。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 建立小鼠Lewis氣管滴注模型 小鼠腋下接種約1×106個(gè)Lewis細(xì)胞0.2mL，待20d后腫瘤形成后用頸椎脫臼法處死荷瘤小鼠，用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡小鼠消毒，無菌條件下剝離腫瘤組織塊，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈剪碎，用研磨器研磨組織制備細(xì)胞懸液，之后在1 000r/min，離心5min,重復(fù)兩次，用生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/mL，此即瘤細(xì)胞懸液。取體質(zhì)量為(18～28)g的20只昆明鼠腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為0.5%的戊巴比妥鈉(0.1mL/10g)，麻醉生效后即進(jìn)行氣管滴注，每只小鼠滴注Lewis細(xì)胞懸液10μL，從而建立Lewis氣管滴注模型。

2.2.2 分組 接種后對(duì)20只小鼠進(jìn)行分組，每組10只分成2組，分別標(biāo)記為：給藥組、模型組。

2.2.3 給藥 接種當(dāng)日開始灌胃給藥，1次/d(給藥濃度0.1g/kg)，連續(xù)給藥七周后處死。

2.2.4 腫瘤生長監(jiān)測和體征監(jiān)測 間隔4d記錄小鼠體質(zhì)量、自主活動(dòng)、體溫1次，連續(xù)7周，觀察小鼠造模后的生存質(zhì)量差異。

2.2.5 馬錢子水煎液對(duì)小鼠病理特征的影響 對(duì)解剖的肺組織進(jìn)行石蠟包埋，切片，HE染色，封片，在高級(jí)正置金相顯微鏡下觀察Lewis氣管滴注模型在馬錢子水煎液的作用下的病理學(xué)變化。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Graphpadprism軟件處理，兩組間差異性比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05，表示有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 MTT法測定馬錢子水煎液對(duì)細(xì)胞增殖的影響

以濃度為2.5、5、10、20g/L的馬錢子水煎液處理Lewis細(xì)胞,48h后計(jì)算抑制率，分別為20.31%、24.42%、38.55%、57.37%。半數(shù)抑制濃度為IC50=15.57g/L。見圖1。

3.2 對(duì)細(xì)胞遷移的影響

劃痕試驗(yàn)采用濃度為5g/L的馬錢子水煎液處理細(xì)胞，結(jié)果如圖2所示，馬錢子水煎液處理Lewis細(xì)胞，在12h時(shí)給藥組細(xì)胞的遷移距離明顯小于模型組遷移距離，在24h時(shí)更明顯。

圖1 馬錢子水煎液對(duì)細(xì)胞增殖的影響

3.3 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

模型組小鼠體質(zhì)量有逐漸減輕趨勢，給藥組小鼠體質(zhì)量有上升趨勢，給藥組的體質(zhì)量相比模型組有顯著性差異(P<0.01)。見圖2。

圖2 馬錢子水煎液作用下的生長曲線

3.4 對(duì)小鼠體溫的影響

模型組和給藥組背溫、腹溫、尾溫均下降，給藥組體溫更接近正常組。給藥組和模型組的背溫、尾溫和腹溫均有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)果見圖3。

3.5 對(duì)小鼠自主活動(dòng)的影響

給藥組小鼠自主活動(dòng)和正常組相比次數(shù)少，但與模型組比較次數(shù)多，具有顯著性差異(P<0.01)。見圖4。

3.6 馬錢子水煎液對(duì)小鼠Lewis氣管滴注小鼠肺癌模型的生理特性的影響

正常組肺癌組織的細(xì)胞核明顯小于模型組和馬錢子水煎液給藥組，模型組可見明顯的細(xì)胞核增大，細(xì)胞核距離緊密，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核比例失調(diào)，核仁增大增多，空洞縮??；而馬錢子水煎液給藥組細(xì)胞核明顯小于模型組，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核比例接近正常組，空洞大于模型組但小于正常組。見圖5。

圖3 馬錢子水煎液對(duì)小鼠體溫的影響

圖4 實(shí)驗(yàn)期間小鼠自主活動(dòng)的變化

圖5 馬錢子水煎液對(duì)小鼠Lewis原位肺癌模型病理變化的影響

4 討論

惡性腫瘤是威脅人類健康的嚴(yán)重疾病之一[7]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療腫瘤的手段主要有化療、手術(shù)、放療等，而化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的選擇性差，化療藥物毒副作用限制了化療的發(fā)展[8-9]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，應(yīng)察病機(jī)而定治則，根據(jù)病變發(fā)展之階段，詳審邪正盛衰，辯清虛實(shí)，以及虛實(shí)的多少，辯證地使用攻補(bǔ)之法。陳劍鋒[10]提出，中藥具有多成分多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。由于中藥的成分較多，可以通過多種途徑達(dá)到抑制腫瘤發(fā)展的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過體內(nèi)、體外兩種途徑驗(yàn)證了馬錢子水煎液的抗Lewis肺癌細(xì)胞的作用。體外實(shí)驗(yàn)用MTT法和劃痕試驗(yàn)證明馬錢子水煎液對(duì)腫瘤細(xì)胞Lewis有抑制增殖和遷移的作用并呈劑量、時(shí)間依賴；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過體質(zhì)量、體溫、自主活動(dòng)的變化曲線初步得出馬錢子水煎液能改善小鼠Lewis氣管滴注模型的生長狀態(tài)。組織HE染色進(jìn)一步證明馬錢子水煎液可以改善小鼠肺癌模型的病理狀態(tài)。

腫瘤在體內(nèi)表現(xiàn)為積聚癓瘕，盤根錯(cuò)節(jié)，腫塊日漸增大，易用消瘤攻堅(jiān)，通利破積之峻藥。馬錢子具有細(xì)胞毒性，古書記載其具有散血熱，消腫毒之功效[11]。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，給予馬錢子水煎液0.1g/kg劑量，小鼠并未出現(xiàn)馬錢子中毒癥狀，說明給予劑量不足以使小鼠出現(xiàn)驚厥。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，降低馬錢子濃度可以降低毒性。建議應(yīng)該通過降低馬錢子中毒性成分的濃度來尋求發(fā)展馬錢子抗腫瘤的途徑。

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