HIF—1a、VEGF、MVD在大腸腺癌組織中的表達(dá)及臨床意義

陳寶英+王澤輝+官成濃+張英+王玉洲

[摘要]目的探討HIF-1a、VEGF、MVD（用抗CD34抗體標(biāo)記）在大腸腺癌組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)S-P法檢測(cè)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理檢查證實(shí)的手術(shù)切除標(biāo)本或活檢組織中HIF-1a、VEGF、MVD的表達(dá)情況，其中38例大腸腺癌組織、22例大腸腺瘤組織、29例正常大腸組織。結(jié)果HIF-1a、VEGF在大腸腺癌組的陽性表達(dá)率分別為73.7%、65.8%，明顯高于大腸腺瘤組、正常大腸組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。大腸腺癌、大腸腺瘤、正常大腸組織中MVD值分別是（52.36±9.66）、（30.23±5.22）、（21.37±4.755），MVD值在腺癌中明顯高于腺瘤及正常腸組織（P<0.05）。28例HIF-1a呈陽性表達(dá)的大腸腺癌組織MVD值為（53.22±10.15）；呈陰性表達(dá)的10例中MVD值為（42.75±10.47），呈正相關(guān)關(guān)系（rs=0.392，P<0.05）。VEGF呈陽性表達(dá)的25例大腸腺癌組織MVD值為（54.54±9.60）；呈陰性表達(dá)的10例中MVD值為（42.63±9.80），呈正相關(guān)關(guān)系（rs=0.491，P<0.05）。結(jié)論在大腸腺癌組織中HIF-1a和VEGF的表達(dá)明顯高于大腸腺瘤組織和正常大腸組織，提示HIF-1a和VEGF可能參與大腸腺癌的發(fā)展。MVD值在大腸腺癌中的表達(dá)明顯高于大腸腺瘤組織和正常大腸組織，提示大腸腺癌中血管生成較大腸腺瘤組織和正常大腸組織豐富；MVD值是衡量大腸腺癌發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)。HIF-1a、VEGF的表達(dá)與MVD值在大腸腺癌組織中均呈正相關(guān)，提示HIF-1a、VEGF可能與大癌發(fā)展過程中血管生成密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]大腸腺癌；HIF-1a；VEGF；MVD

大腸癌包括結(jié)腸癌和直腸癌，是最常見的消化道惡性腫瘤之一。雖然目前對(duì)大腸癌采用了以手術(shù)切除為主的綜合治療，但其治療效果仍不夠理想，而術(shù)后的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移則是影響術(shù)后生存率的重要因素。因此，深入研究大腸癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制，從分子水平找到可用于提示大腸癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物，既可預(yù)警大腸癌的術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，及早對(duì)可能復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的大腸癌患者進(jìn)行放化療或靶向治療，亦可研究這些因子可否成為腫瘤治療中的新靶點(diǎn)，對(duì)提高患者生存率、評(píng)估患者的預(yù)后及臨床治療有現(xiàn)實(shí)的意義。本課題運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)HIF-1a、VEGF、MVD在大腸腺癌的表達(dá)情況，并分析其相關(guān)性，探討它們與大腸腺癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系及在大腸腺癌中與血管生成的關(guān)系，旨在對(duì)大腸腺癌惡性程度的判定、預(yù)后分析及生物學(xué)治療提供有效的理論依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

收集廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)病理檢查證實(shí)的手術(shù)切除標(biāo)本或活檢組織，其中大腸腺癌38例；正常大腸組織29例（距腫瘤邊緣>5cm處的正常黏膜）；大腸腺瘤組織22例。所有標(biāo)本均經(jīng)40g/L緩沖中性福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，每個(gè)標(biāo)本蠟塊行4μm厚度連續(xù)切片。所有患者手術(shù)前未接受放療、化療，每例有詳細(xì)的臨床資料、手術(shù)記錄。38例大腸腺癌中男21例，女17例；年齡在29～84歲（其中≤60歲20例，>60歲18例，平均年齡59.42歲）；直腸癌16例，結(jié)腸癌22例；病理學(xué)分級(jí)：高分化5例，中分化25例，低分化8例；大腸腺癌TMN分期根據(jù)2002美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）的分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期：Ⅰ期6例，Ⅱ16期例，Ⅲ期15例，Ⅳ期1例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

采用鏈菌素抗生物素蛋白一過氧化物酶法（S-P法）檢測(cè)μm、VEGF、CD34蛋白的表達(dá)，一抗為兔抗人HIF-1a多克隆抗體（1：50），兔抗人VEGF多克隆抗體（1：50），兔抗人CD34多克隆抗體（1：50），試劑均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.3結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

HIF-1a、VEGF表達(dá)水平采用Fromowitz陽性細(xì)胞半定量分級(jí)法。首先根據(jù)陽性細(xì)胞占整個(gè)腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)記分：≤5%記為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。再根據(jù)陽性細(xì)胞染色深淺記分，陰性為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分，棕褐色為3分。最后將二者分?jǐn)?shù)相加，0～1分記為（一），2～3分記為（+）；4～5分記為（++）；6～7分記為（+++），其中（-）～（+）視為陰性，（++）～（+++）視為陽性。

微血管計(jì)數(shù)參照Weidner的方法：任何與鄰近的微血管、腫瘤細(xì)胞及其它相連組織有明顯分界的被CD34染成棕黃色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇均視為一個(gè)血管計(jì)數(shù)，首先在低倍鏡（40和100倍）下選取癌視野中微血管最密集的3個(gè)區(qū)域，然后在高倍鏡（400倍）進(jìn)行血管計(jì)數(shù)，取其平均值作為該例腫瘤的MVD值，結(jié)果以（x±s）表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理在SPSS17.0軟件包上進(jìn)行。計(jì)數(shù)資料采用x²檢驗(yàn)、計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)、方差分析，分析HIF-1a、VEGF、MVD在大腸腺癌、正常大腸組織、大腸腺瘤中的表達(dá)水平，以及它們與大腸腺癌的臨床病理因素的相關(guān)性，用spearman等級(jí)相關(guān)分析HIF-1a、VEGF、MVD的相互關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1HIF-1a、VEGF和MVD在各種腸組織中的表達(dá)情況

2.1.1HIF-1a在各種腸組織中的表達(dá)情況HIF-1a陽性產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要著色在細(xì)胞核和細(xì)胞漿，以細(xì)胞漿為主，在腫瘤壞死明顯的區(qū)域和腫瘤浸潤(rùn)邊緣的表達(dá)明顯增多。在大腸腺癌、大腸腺瘤和正常大腸組織中均有表達(dá)，但表達(dá)程度不一。HIF-1a在大腸腺癌組織、大腸腺瘤組織、正常大腸組織中陽性表達(dá)率分別為：73.7%（28/38）、45.5%（10/22）、13.8%（4/29），在腺癌組織陽性表達(dá)率高于腺瘤組織和正常大腸組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在腺瘤組織與正常大腸組織間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.1.2 VEGF在各種腸組織中的表達(dá)情況VEGF主要表達(dá)在細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，以胞漿為主，某些血管內(nèi)皮細(xì)胞也可見表達(dá)，呈棕黃色顆粒，大腸腺癌組織、大腸腺瘤組織和正常大腸組織中都有表達(dá)，但表達(dá)程度不一，高表達(dá)主要見于大腸腺癌組織。38例大腸腺癌組織中有25例VEGF表達(dá)陽性，占65.8%（25/38），VEGF在大腸腺瘤組織中陽性表達(dá)率為31.8%（7/22）及正常大腸組織中陽性率表達(dá)為10.3%（3/29）。VEGF在腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于腺瘤與正常大腸組織（P<0.05），在腺瘤組織與正常大腸組織間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.1.3CD34在各種腸組織中的表達(dá)情況CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上，呈棕黃色顆粒，主要分布于癌間質(zhì)區(qū)，在腫瘤周邊區(qū)含量相對(duì)高。在大腸腺癌中CD34標(biāo)記的微血管形態(tài)多呈成熟狀態(tài)，管腔大，管壁比較完整，在大腸正常組織中的微血管多為單細(xì)胞形成，管腔小，形狀多不完整。大腸腺癌、大腸腺瘤、正常大腸組織中MVD值分別是（52.36±9.66）、（30.23±5.22）、（21.37±4.755）。MVD值在腺癌中明顯高于腺瘤及正常腸組織（P<0.05），腺瘤組織與正常大腸組織間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

2.2HIF-1a、VEGF和MVD的表達(dá)與大腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.2.1HIF-1a的表達(dá)與大腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系HIF-1a在大腸腺癌中的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腸壁浸潤(rùn)深度相關(guān)，Ⅲ期+Ⅳ期陽性表達(dá)率高于Ⅰ期+Ⅱ期（P<0.05），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，腫瘤浸潤(rùn)達(dá)漿膜及漿膜外組陽性表達(dá)率高于腫瘤浸潤(rùn)未及漿膜組；HIF-1a表達(dá)與年齡、性別、腫瘤最大直徑、腫瘤部位、病理學(xué)分級(jí)無關(guān)（P>0.05）。見表4。

2.2.2 VEGF的表達(dá)與大腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系VEGF在大腸腺癌中的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理學(xué)分級(jí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），分期晚VEGF陽性表達(dá)率高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，低分化VEGF陽性表達(dá)率高于中分化和高分化組；VEGF表達(dá)與年齡、性別、腫瘤最大直徑、腫瘤部位、腸壁浸潤(rùn)深度無關(guān)（P>0.05）。見表5。

2.2.3MVD的表達(dá)與大腸腺癌臨床病理特征的關(guān)系MVD值與大腸腺腸癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腸壁浸潤(rùn)深度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），分期晚MVD值高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性組，腫瘤浸潤(rùn)達(dá)漿膜及漿膜外組高于腫瘤浸潤(rùn)未及漿膜組，低分化組高于中分化和高分化組；與年齡、性別、腫瘤最大直徑、腫瘤部位無關(guān)（P>0.05）。見表5。

2.3大腸腺癌組織中HIF-1a、VEGF和MVD表達(dá)的相互關(guān)系

28例HIF-1a呈陽性表達(dá)的大腸腺癌組織MVD值為（53.22±10.15）；呈陰性表達(dá)的10例中MVD值為（42.75±10.47），呈正相關(guān)關(guān)系（rs=0.392，P<0.05）。VEGF呈陽性表達(dá)的25例大腸腺癌組織MVD值為（54.54±9.60）；呈陰性表達(dá)的10例中MVD值為（42.63±9.80），呈正相關(guān)關(guān)系（rs=0.491，P<0.05）。見表6。

3討論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HIF-1a在大腸腺癌組織中表達(dá)水平為73.7%（28/38）明顯高于大腸腺瘤組織45.5%（10/22）、正常大腸組織13.8%（4/29），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），尤其是在腫瘤壞死明顯的區(qū)域和腫瘤浸潤(rùn)邊緣。這提示HIF-1a的高表達(dá)與大腸腺癌的發(fā)生有相關(guān)性，這與國(guó)內(nèi)外大多數(shù)相關(guān)報(bào)道基本一致。其表達(dá)水平增高可能是因?yàn)槟[瘤組織氧濃度降低，也可能是抑癌基因突變或癌基因激活，從而導(dǎo)致一系列基因的表達(dá)水平增高，使腫瘤細(xì)胞耐受缺氧，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。另外HIF-1a表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸腺癌HIF-1a的陽性表達(dá)率為93.8%（15/16）高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組59.1%（13/22）；在腫瘤腸壁浸潤(rùn)達(dá)漿膜或漿膜外組HIF-1a的陽性表達(dá)率為86.2%（25/27）高于腸壁浸潤(rùn)未達(dá)漿膜層組的45.5%（5/11）；在大腸腺癌Ⅰ～Ⅱ和Ⅲ～Ⅳ病例中，HIF-1a的陽性表達(dá)率分別是59.1%（13/22）、93.8%（15/16），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示HIF-1a表達(dá)異常與腺癌的淋巴結(jié)形成、腸壁浸潤(rùn)深度及臨床分期有關(guān)，而且腫瘤腸壁浸潤(rùn)越深、TNM分期越晚陽性表達(dá)率越高；HIF-1a的表達(dá)與患者性別、年齡、病理學(xué)分級(jí)、腫瘤部位、腫瘤大小無關(guān)（P>0.05）。Schindl等對(duì)206例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的乳腺癌標(biāo)本的HIF-1a表達(dá)進(jìn)行免疫組化分析，顯示HIF-1a陽性表達(dá)率為76.2%（157/206），也提示HIF-1a是高度侵襲性疾病的一個(gè)生物標(biāo)志。本研究提示腫瘤細(xì)胞通過增強(qiáng)HIF-1a表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。其可能的機(jī)制為HIF-1a調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)，VEGF進(jìn)而作用于存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的兩種受體VEGFR1和VEGFR2，從而激活了一系列的缺血轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)新生血管的生成，增高毛細(xì)血管通透性，來促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

本研究發(fā)現(xiàn)在38例大腸腺癌組織中VEGF的陽性表達(dá)率為65.8%（25/38）明顯高于腺瘤組織31.8%（7/22）和正常大腸組織10.3%（3/29），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示VEGF高表達(dá)可能與大腸腺癌的發(fā)生有一定相關(guān)性。這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道基本一致。本實(shí)驗(yàn)還分析了VEGF表達(dá)與大腸腺癌臨床病理學(xué)及其相關(guān)因素的關(guān)系，在大腸腺癌組織中VEGF的表達(dá)與患者性別、年齡、腸壁浸潤(rùn)深度、腫瘤部位、腫瘤大小無關(guān)（P>0.05）。與大腸腺癌的淋巴結(jié)形成、病理學(xué)分級(jí)及臨床分期有關(guān)，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，VEGF的陽性表達(dá)率分別是50.0%（11/22）、87.5%（14/16）；在病理分級(jí)高分化、中分化及低分化組中VEGF的陽性表達(dá)率分別是20.0%（1/5）、68.0%（17/25）、87.5%（7/8）；在Ⅰ～Ⅱ組和Ⅲ～Ⅳ組病例中，VEGF的陽性表達(dá)率分別是50.0%（11/22）、87.5%（14/16），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。提示大腸腺癌組織中VEGF的表達(dá)明顯增高且與腫瘤的侵襲能力密切相關(guān)。VEGF是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原，能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞外基質(zhì)溶解、內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增生和管腔形成，能直接刺激新生血管形成；VEGF還能增加血管尤其是微血管的通透性，為血管形成過程中多種細(xì)胞遷移提供一個(gè)纖維網(wǎng)絡(luò)，部分腫瘤細(xì)胞也可以穿過血管壁進(jìn)入血管向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，加速了腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移；VEGF亦可上調(diào)或誘導(dǎo)各種血管源因子和抗凋亡因子，促進(jìn)腫瘤血管生成并提高腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力。

本實(shí)驗(yàn)中，在38例大腸腺癌中，MVD值為52.36±9.66，在22例大腸腺瘤中MVD值為30.23±5.22，而29例大腸正常組織中MVD值為21.37±4.75，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這與其他研究者對(duì)乳腺癌、肺癌、前列腺癌、子宮鱗癌等腫瘤組織MVD檢測(cè)的結(jié)果一致，這說明大腸腺癌組織的血管生成能力明顯增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)還分析了MVD值與大腸腺癌臨床病理學(xué)及其相關(guān)因素的關(guān)系，在大腸腺癌組織中MVD值與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小無關(guān)（P>0.05）；而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，MVD值分別是（44.97±10.00）、（58.02±7.75）；在腫瘤腸壁浸潤(rùn)達(dá)漿膜或漿膜外組MVD值為55.09±9.24高于腸壁浸潤(rùn)未達(dá)漿膜層組的（39.13±6.06）；在病理分級(jí)高分化、中分化及低分化組中MVD值分別是（43.12±13.19）、（49.20±8.90）、（59.00±12.47）；在Ⅰ～Ⅱ組和Ⅲ～Ⅳ組病例中，MVD值分別是（44.97±10.00）、（58.02±7.75），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。MVD值與大腸腺癌的淋巴結(jié)形成、腸壁浸潤(rùn)深度、病理學(xué)分級(jí)及臨床分期有關(guān)，可能因?yàn)槟[瘤的快速生長(zhǎng)，使其處于相對(duì)缺氧的狀態(tài)，促使了大腸腺癌血管新生，維持了腫瘤生長(zhǎng)，同時(shí)新生的腫瘤血管又加速了腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。因此說明血管生成在大腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。

研究已證實(shí)VEGF是刺激腫瘤血管形成最關(guān)鍵的生長(zhǎng)因子，其表達(dá)受許多外部因子調(diào)控，HIF-1a為其中之一，有研究表明HIF-1a可上調(diào)多種血管生成因子的表達(dá)來介導(dǎo)缺氧狀態(tài)下的血管形成反應(yīng)，可介導(dǎo)VEGF和其他缺氧反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄活性。大量的研究證明HIF-1與VEGF存在正相關(guān)關(guān)系，Bos等研究表明在乳腺癌的形成中，HIF-1a的表達(dá)與血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子VEGF的表達(dá)、腫瘤細(xì)胞的高增殖狀態(tài)呈正相關(guān)，認(rèn)為HIF-1a可作為乳腺癌患者新的預(yù)后指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)與國(guó)內(nèi)外的研究相一致。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)HIF-1a、VEGF均與MVD值存在正相關(guān)關(guān)系。提示兩種因子均可通過各種的信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)大腸腺癌血管的生成，并與大腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展與侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此深入研究HIF-1a可能將為大腸腺癌的放化療及基因治療提供新的靶點(diǎn)。