基于氯化血紅素復(fù)合材料的過氧亞硝酸陰離子電化學(xué)傳感器的構(gòu)建

任聚杰+于聰聰+崔敏+李亞清+武聰+籍雪平

摘 要 構(gòu)建了一種基于氯化血紅素/金納米粒子/聚三聚氰胺/多壁碳納米管復(fù)合材料修飾玻碳電極的過氧亞硝酸陰離子電化學(xué)傳感器，并成功用于過氧亞硝酸陰離子的檢測。采用循環(huán)伏安法和電流.時(shí)間曲線考察了過氧亞硝酸陰離子在傳感器上的電化學(xué)行為，并對傳感器的制備條件及過氧亞硝酸陰離子的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，碳納米管滴涂量為5 μL，金沉積時(shí)間為20 s，工作電位為0.8 V時(shí)，所制傳感器對過氧亞硝酸陰離子的響應(yīng)最大。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，此傳感器檢測過氧亞硝酸陰離子的線性范圍為1.0×105～3.5×104 mol/L和3.5×104～1.1×103 mol/L，靈敏度為0.13 A/（mol/L），檢出限為1.2×107 mol/L（S/N=3）。

關(guān)鍵詞 過氧亞硝酸陰離子； 氯化血紅素； 聚三聚氰胺； 金納米粒子； 碳納米管； 電化學(xué)傳感器

1 引 言

在有氧代謝的過程中，生物體會產(chǎn)生多種自由基，活性氮[1]（RNS）是其中重要的一類，它主要是指一氧化氮（NO）與包括活性氧（ROS）在內(nèi)的化合物相互作用，衍生出一系列具有高度氧化活性的自由基和硝基類化合物，包括過氧亞硝酸陰離子（ONOO）、一氧化氮（NO）、亞硝酸根離子（NO-2）和二氧化氮（NO2）等。在生物體內(nèi)，ONOO由一氧化氮和超氧陰離子兩種自由基快速結(jié)合產(chǎn)生，一氧化氮和超氧陰離子本身都不是強(qiáng)氧化劑，但生成的ONOO卻具有極強(qiáng)的氧化性和硝化性[2，3]。ONOO

能氧化巰基蛋白和脂質(zhì)、誘導(dǎo)單鏈DNA的斷裂、引起一些DNA或蛋白質(zhì)的氨基酸殘基的硝化[4～7]等，參與諸多疾病的病理過程，主要包括心血管疾病、癌癥、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病等。因此，準(zhǔn)確定量檢測ONOO在疾病的早期診斷和治療方面具有重要意義[8，9]。

目前，檢測ONOO的方法主要有紫外分光光度法[10]、熒光法[11～13]、化學(xué)發(fā)光法[14，15]、電子自旋共振光譜法[16，17]、電子自旋與液相色譜.質(zhì)譜聯(lián)用法[18]和電化學(xué)方法[19～24]等。與電化學(xué)方法相比，其它方法存在著一些不足，如電子自旋共振法或與其它技術(shù)聯(lián)用的方法只是對ONOO氧化生物活性物質(zhì)的機(jī)理進(jìn)行了一些研究； 熒光法則是通過合成熒光探針間接地測定ONOO，但是有些探針的合成比較困難，成本較高； 而電化學(xué)方法操作簡單，靈敏度高，選擇性好，成本低。利用電化學(xué)方法檢測ONOO的報(bào)道較少，2007年， Cortés等采用聚錳酞菁膜修飾的鉑微電極實(shí)現(xiàn)了對ONOO的實(shí)時(shí)安培檢測[19]，但是電極表面的電荷轉(zhuǎn)移可能會受pH值的影響。Wang等[8]采用聚氰鈷氨膜修飾的玻碳電極成功構(gòu)建了一種ONOO電化學(xué)傳感器，并實(shí)現(xiàn)了人體血清樣品中ONOO的檢測，但靈敏度有待提高。近幾年，Peteu等利用導(dǎo)電聚合物聚3，4.乙烯二氧噻吩（PEDOT）或者石墨烯復(fù)合材料構(gòu)建了幾種過氧亞硝酸陰離子電化學(xué)傳感器 [21～24]，并且對ONOO的檢測能達(dá)到較低的檢出限，但未給出工作曲線。氯化血紅素是人工合成的一種具有π共軛結(jié)構(gòu)的卟啉分子，它能模擬超氧化物歧化酶與ONOO反應(yīng) [9，18]。多壁碳納米管具有離域的大π鍵結(jié)構(gòu)，使得多壁碳納米管與卟啉分子之間存在強(qiáng)烈的π.π相互作用[25]，本研究利用這種相互作用將氯化血紅素固定到多壁碳納米管修飾的電極表面，同時(shí)修飾具有特殊形貌的金納米粒子來提高傳感器的靈敏度，構(gòu)建了一種新型的過氧亞硝酸陰離子電化學(xué)傳感器。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)工作站（上海辰華儀器有限公司），采用傳統(tǒng)的三電極體系：直徑為3 mm的玻碳電極（Glassy carbon electrode， GCE）或修飾的玻碳電極作為工作電極，飽和銀.氯化銀電極為參比電極，鉑片電極為對電極； BT125D電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）； UV5200.PC紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）； S.4800冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM， 日本日立公司）； 石英自動雙重純水蒸餾器（江蘇金壇宏華儀器廠）； 雷磁PHS.2F型pH計(jì)（雷磁.上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）； 移液槍10 μL、100 μL（北京青云卓立精密儀器有限公司）。

多壁碳納米管（Multiple.walled carbon nanotubes， MWCNTs，深圳市納米港有限公司）； Na2HPO4、N，N.二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、MnO2（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 氯化血紅素（Hemin）、三聚氰胺（Melamine， Mel）、四氯金酸（HAuCl4·3H2O）、H2O2（30%，w/w）、NaOH、NaNO2（上海晶純生化科技股份有限公司）； 其它試劑均為分析純； 實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水，所有實(shí)驗(yàn)都是在氮?dú)夥諊逻M(jìn)行的。

2.2 部分所需溶液的配制

稱取多壁碳納米管1.5 mg，溶于1 mL DMF中，超聲分散30 min，得到分散均勻的MWCNTs懸浮液。配制0.05 mol/L Na2HPO4溶液，并用NaOH調(diào)節(jié)至pH 11，作為PBS溶液。實(shí)驗(yàn)中的過氧亞硝酸陰離子儲備液（Peroxynitrite， PON）采用文獻(xiàn)[26]中的方法制備，制得的PON于18℃保存。在電化學(xué)測試前，采用紫外分光光度計(jì)在λ=302 nm下測其吸光度，利用朗伯.比爾定律，計(jì)算PON濃度。

2.3 修飾電極的制備

本研究以玻碳電極為基礎(chǔ)電極，圖1為修飾電極的制備過程圖。首先，玻碳電極依次采用1.0，0.3和0.05 μm的三氧化二鋁粉末在拋光板上打磨，每次打磨后依次在水、無水乙醇、水中超聲清洗，并用氮?dú)獯蹈伞?/p>

用移液槍吸取MWCNTs懸浮液5 μL，滴涂到預(yù)處理好的玻碳電極上，過夜晾干待用，作為MWCNTs/GCE。將得到的MWCNTs/GCE電極置于含1.00 mmol/L Mel的0.1 mol/L HCl溶液中，采用循環(huán)伏安法電聚合10圈，電位區(qū)間為0.2～1.5 V，掃速為50 mV/s，取出后用大量水沖洗，以去除電極表面未聚合的三聚氰胺，室溫下以氮?dú)獯蹈纱茫鳛镻Mel/MWCNTs/GCE。將PMel/MWCNTs/GCE電極插入到1.00 mmol/L HAuCl4+0.5 mol/L H2SO4溶液中，恒電位

0.2 V下電沉積20 s，得到的電極用水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?，作為AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE。將電極AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE插入到含1.00 mmol/L Hemin的DMSO溶液中浸泡15 h，得到的電極用大量水沖洗干凈并用氮?dú)獯蹈桑鳛镠emin/AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE。

2.4 電化學(xué)測量

在測定PON時(shí)，采用循環(huán)伏安法（Cyclic voltammetry， CV）在PBS溶液中掃描，電位區(qū)間為0.4～1.2 V，掃速為50 mV/s。電化學(xué)交流阻抗（Electrochemical impedance spectroscopy， EIS）在[Fe（CN）6]34（含0.1 mol/L KCl）溶液中進(jìn)行，頻率范圍為0.1～100000 Hz， 振幅為5 mV。電流.時(shí)間曲線（Amperometric i.t Curve， i.t）在0.05 mol/L PBS溶液中進(jìn)行，并采用磁力攪拌儀恒速微攪拌。

3 結(jié)果與討論

3.1 修飾電極的電化學(xué)行為

電化學(xué)交流阻抗（EIS）是研究電極過程動力學(xué)、電極表面現(xiàn)象等的重要手段[27] 。在實(shí)驗(yàn)中，采用EIS表征各階段修飾電極的電化學(xué)性能。由圖2A可見，裸電極GCE（曲線a）的電子轉(zhuǎn)移電阻（Rct）約為200 Ω，修飾了碳納米管后的MWCNTs/GCE電極（曲線b）的Rct值幾乎為零，這是因?yàn)樘技{米管具有優(yōu)良的導(dǎo)電性能，同時(shí)也說明碳納米管成功修飾到了電極表面； 由插圖可以看出，再修飾聚三聚氰胺得到的PMel/MWCNTs/GCE電極（曲線c）的Rct又稍有增大，推測這是因?yàn)榫廴矍璋返膶?dǎo)電性不及碳納米管，同時(shí)也說明聚三聚氰胺成功修飾到了電極表面； 再沉積金得到的AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE電極（曲線d）的Rct值又幾乎為零，說明金納米粒子成功修飾到電極上，并且電極上修飾的納米復(fù)合材料AuNPs/PMel/MWCNTs的導(dǎo)電性非常好，它們之間的協(xié)同作用共同促進(jìn)了電子傳遞； 修飾Hemin后得到的Hemin/AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE電極（曲線e）的Rct值再無明顯變化，說明最終的修飾電極的阻抗較小，有利于電子在電極與電解液之間的傳遞。

圖2B為電極AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE（曲線d）和電極Hemin/AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE（曲線e）在PBS溶液里的循環(huán)伏安曲線，掃描圈數(shù)為3圈，Hemin/AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE（曲線e）電極在0.6 V附近出現(xiàn)了一對可逆的氧化還原峰，這是Hemin中Fe3+/Fe2+的峰，與文獻(xiàn)[28，29]報(bào)道一致，進(jìn)一步說明Hemin成功修飾到了電極上。

3.2 修飾電極的SEM表征

采用掃描電子顯微鏡對不同修飾電極表面的形態(tài)進(jìn)行表征。由圖3可見，Hemin/AuNPs/MWCNTs/GCE電極（圖3a）上的金納米粒子分散不均勻，出現(xiàn)了嚴(yán)重的團(tuán)聚現(xiàn)象； 修飾有聚三聚氰胺的電極Hemin/AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE（圖3b）上的金納米粒子分散比較均勻； 金納米粒子形成了很多小的粒子簇，具有特殊的花朵形貌（圖3c），推測這是由于聚三聚氰胺對碳納米管的修飾，改善了金納米粒子在碳納米管上的分散狀況，與文獻(xiàn)[30，31]報(bào)道的氨基修飾的碳材料在預(yù)防納米粒子團(tuán)聚方面是有幫助的說法一致。

3.3 PON在不同修飾電極的電化學(xué)行為

圖4為0.7 mmol/L PON在不同修飾電極上的循環(huán)伏安（CV）曲線。由圖可知，CV曲線只出現(xiàn)氧化峰，無還原峰，說明在此電位范圍內(nèi)PON的氧化是一個(gè)不可逆過程，與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的ONOO的氧化是不可逆的一致。在GCE（曲線a）上，PON的氧化峰電位約在1.0 V，且峰形較緩，電流較小。在Hemin/MWCNTs/GCE（曲線b）上，PON的氧化電位負(fù)移了約150 mV，峰電流增大約1.5倍，這可能是因?yàn)樘技{米管具有良好的導(dǎo)電性，Hemin對PON具有選擇催化作用，兩者的修飾促進(jìn)了電子傳遞的速率； 在Hemin/PMel/MWCNTs/GCE（曲線c）上，PON的氧化電流值相對于GCE幾乎無明顯變化，但是在修飾有金納米粒子的Hemin/AuNPs/MWCNTs/GCE（曲線d）和Hemin/AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE（曲線e）上，PON的氧化峰電流相對于GCE分別增大了2倍和3倍，這說明金納米粒子的修飾，可以促進(jìn)PON在電極表面的氧化，使得PON的氧化峰電流增大，并且在修飾了聚三聚氰胺的電極上PON的氧化峰電流更大，推測這是因?yàn)樾揎椨芯廴矍璋返碾姌O表面的金納米粒子分散比較均勻，使得Hemin/AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE的比表面積更大，因此，對PON的催化效果更好。

3.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

對傳感器的制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，由圖5A可見， 金沉積時(shí)間對Hemin/AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE的影響，當(dāng)金沉積時(shí)間小于20 s時(shí)，電極對PON的循環(huán)伏安峰電流隨著金沉積時(shí)間的延長而增大，金沉積20 s時(shí)，峰電流達(dá)到最大值； 當(dāng)金沉積時(shí)間大于20 s后，電極對PON的循環(huán)伏安峰電流隨金沉積時(shí)間的延長而減小。因此，最佳金沉積時(shí)間為20 s。

由圖5B可見，不同的碳納米管滴涂量對Hemin/AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE的影響，當(dāng)碳納米管的滴涂量小于5 μL時(shí)，電極對PON的電流響應(yīng)隨碳納米管滴涂量的增加而增大； 滴涂量為5 μL時(shí)峰電流達(dá)到最大值； 當(dāng)?shù)瓮苛看笥? μL后，電極對PON的電流響應(yīng)隨碳納米管滴涂量的增加而減小。因此，最佳碳納米管滴涂量為5 μL。

3.5 傳感器對PON的響應(yīng)

采用電流.時(shí)間曲線，研究了Hemin/AuNPs/PMel/MWCNTs/GCE對PON的催化性能。

如圖7所示，在0.80 V的工作電位下，向PBS溶液中連續(xù)加入PON溶液，結(jié)果表明，PON濃度在1.0×105～ 3.5×104 mol/L以及3.5×104～ 1.1×103 mol/L區(qū)間時(shí)，PON的電流與其濃度均滿足線性關(guān)系，對應(yīng)的線性方程分別為I1（μA）=0.13C（μmol/L）-0.714（R2=0.994）和I2（μA）=0.074C（μmol/L）+20.66（R2=0.990），如圖7B所示。此傳感器的靈敏度可達(dá)0.13 A/（mol/L），計(jì)算得到的檢出限為1.2×107 mol/L（S/N=3），與其它修飾方法的比較結(jié)果見表1。由表1可知，本方法制得的傳感器具有較寬的線性范圍、較低的檢出限和較高的靈敏度。

3.6 傳感器的抗干擾性測定

3.7 電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性測定

采用相同的實(shí)驗(yàn)條件下制備的修飾電極，在0.05 mol/L PBS（pH 11）溶液中對0.7 mmol/L PON進(jìn)行循環(huán)伏安測定5次，計(jì)算PON的峰電流的標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%，說明制得的傳感器有良好的重現(xiàn)性。對修飾電極的穩(wěn)定性進(jìn)行了測定，結(jié)果表明，將傳感器在4℃保存兩天后，在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，再次測得電極對0.7 mmol/L PON的循環(huán)伏安電流響應(yīng)值為初始電流的80%。

4 結(jié) 論

構(gòu)建了一種基于氯化血紅素復(fù)合材料修飾玻碳電極的過氧亞硝酸陰離子電化學(xué)傳感器，結(jié)果表明，制備的傳感器靈敏度高，檢出限低，線性范圍較寬，抗干擾性好，成本低，為PON的檢測提供了一種新方法。

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Abstract A peroxynitrite electrochemical sensor based on hemin/gold nanoparticles/poly（melamine）/multi.walled carbon nanotube composite modifying glassy carbon electrode was successfully constructed for the detection of peroxynitrite. The electrochemical behavior of peroxynitrite on the sensor was investigated by cyclic voltammetry and amperometric i.t curve， and the conditions for preparation of the sensor and detection of peroxynitrite were optimized. The results showed that the amperometric response of the sensor for peroxynitrite reached the maximum when the amount of carbon nanotubes was 5 μL， the deposition time of gold was 20 s， and the working potential was 0.8 V. Under the optimized experimental conditions， the sensor could detect peroxynitrite in a linear range from 1.0×105 mol/L to 3.5×104 mol/L and from 3.5×104 mol/L to 1.1×103 mol/L， with a sensitivity of 0.13 A/（mol/L） and a detection limit of 1.2×107 mol/L （S/N=3）.

Keywords Peroxynitrite； Hemin； Poly（melamine）； Gold nanoparticles； Multi.walled carbon nanotubes； Electrochemical sensor