• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于金納米顆粒負載的金屬有機骨架材料的癌胚抗原傳感器的研制

    2017-02-06 15:47白茹燕張坤蕾李德蕾張茜劉婷知
    分析化學 2017年1期

    白茹燕+張坤蕾+李德蕾+張茜+劉婷知+劉儀+胡蓉+楊云慧

    摘 要 以負載Au的金屬有機骨架材料(AuNPs/Cu.TPA)標記CEA抗體(Ab2)為信號探針,通過電還原的方法將氧化石墨烯還原到電極上,研制了一種捕獲CEA抗體(Ab1)的電化學免疫傳感器,并將其應(yīng)用于癌胚抗原(CEA)檢測。所合成的MOFs材料中含有大量Cu2+, 且電化學信號比較穩(wěn)定,因此可以通過檢測MOFs材料中Cu2+的信號實現(xiàn)對CEA的檢測。此信號探針不需要預(yù)處理和酸處理,易負載貴金屬從而固定抗體,大大簡化了檢測步驟并縮短了檢測時間。此傳感器對CEA的檢測靈敏度好,操作簡便。在最優(yōu)實驗條件下,此傳感器的線性范圍為0.1~80 ng/mL,檢出限為0.03 ng/mL,線性相關(guān)系數(shù)為0.9887,可用于真實樣品中CEA的測定。

    關(guān)鍵詞 癌胚抗原; 金屬有機骨架材料; 電化學免疫傳感器

    1 引 言

    腫瘤標記物(Tumor marker)是腫瘤細胞產(chǎn)生的,含量遠高于正常細胞的特異性物質(zhì)。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen, CEA)是一種參與細胞粘附的糖蛋白,通常是在胎兒發(fā)育過程中產(chǎn)生。1965年,Gold等從結(jié)直腸腺瘤和胎兒腸中首次分離出CEA[1]。在健康成年人血清中,CEA含量通常很低,在正常組織中,CEA主要分布在胃腸道上皮細胞中。在腫瘤組織中,CEA不僅在結(jié)直腸癌中表現(xiàn)出來[2],而且在其它類型的癌癥,如胃癌[3],肺癌[4]、乳腺癌[5]、甲狀腺癌[6]等癌癥中也表現(xiàn)出來。因此癌胚抗原成為目前公認的一種腫瘤標志物,它的臨床檢測在評估病變范圍、預(yù)測療效、監(jiān)測復(fù)發(fā)等方面具有較高參考價值[7], 檢測CEA有助于提高腫瘤患者的診斷率,監(jiān)測腫瘤早期轉(zhuǎn)移,并可為患者根治性手術(shù)后是否進行輔助化療、療效判斷、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等具有一定的指導(dǎo)意義,對患者的病情預(yù)后判斷有著至關(guān)重要的臨床意義[8]。常用的CEA的檢測方法有實時熒光極化免疫測定法(FPIA)[9]、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)[10]、放射免疫測定(RIA)[11]、免疫金標技術(shù)[12]等方法。但是,熒光免疫測定法的應(yīng)用范圍比較窄,儀器成本較高,而酶聯(lián)免疫吸附測定法靈敏度不高,放射免疫分析法自身存在放射污染,免疫金標技術(shù)法操作較復(fù)雜[13]。這些傳統(tǒng)方法需要具有專門技術(shù)的操作人員,限制了這些方法在普通實驗室的應(yīng)用,難以實現(xiàn)快速檢測。電化學免疫傳感器由于具有操作程序簡單、易于集成化、靈敏度高、成本低等優(yōu)點, 已廣泛應(yīng)用于腫瘤標記物的檢測。隨著電化學免疫傳感器的日趨成熟, 現(xiàn)代檢測技術(shù)也將向微型化、集成化的方向發(fā)展[14]。

    近年來,性能優(yōu)良的新型金屬有機骨架材料(Metal.organic frameworks,MOFs)成為研究者關(guān)注的熱點[15]。 Cu.MOF由苯環(huán)有機連接體和含Cu2+的金屬羧酸配合物團簇組成,含有四方形配位結(jié)構(gòu),是一類比表面積大,且具有納米級規(guī)整孔道結(jié)構(gòu)、呈多維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的多孔材料[16]。這種材料的優(yōu)良特性促使其迅速發(fā)展, 并成為材料、化學、環(huán)境領(lǐng)域的研究熱點,在氫氣儲備、催化反應(yīng)、氣體吸附與分離及電化學傳感器等應(yīng)用領(lǐng)域有著廣闊的研究和應(yīng)用前景[17,18], 其結(jié)構(gòu)如圖1所示。Cueto等[19]以對苯二甲酸和Cu(NO3)2合成了Cu(tpa)·3(H2O) (Cu.TPA),由于其合成方法與MOF.2[20]相似,所以結(jié)構(gòu)類似于MOF.2(Zn.BDC),是一種多孔四方錐形材料,但其性質(zhì)有異于MOF.2。Cu.TPA表現(xiàn)出更高的表面積,它在氣體分離和存儲和以及催化方面具有較高的應(yīng)用價值[21]。

    雖然金屬離子已被用作信號標記物,但制備過程普遍費時,如Gao等[22]利用Cu2 +作為標記物檢測樹狀大分子聚合DNA的電化學信號。本研究表明,Cu.TPA材料中的Cu2+氧化還原峰比較穩(wěn)定,可單獨作為一個信號基團,因此將這種Cu.TPA材料用作信號探針,Cu2+的電化學信號可以在緩沖溶液中很容易地檢測出來。此新型信號探針不同于傳統(tǒng)的探針,它不需要用酸溶解富集進行檢測,因此極大地簡化了檢測步驟。此外,由于金屬納米顆粒可以很容易摻入MOFs中,使得隨后偶聯(lián)抗體的步驟也較簡單穩(wěn)定。鑒于這種信號探針的獨特的性能,用其構(gòu)建新型CEA電化學傳感器對于腫瘤的早期診斷具有重要意義。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    Cu(NO3)2·3H2O(天津市風船化學試劑科技有限公司); 對苯二甲酸(C 8H 6O4,薩恩化學技術(shù)(上海 )有限公司); N,N.二甲基甲酰胺(DMF,西隴化工有限公司); CEA酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒及純化CEA抗體(anti.CEA)購于鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司;牛血清白蛋白(BSA,美國Sigma.Aldrich公司);氯金酸(HAuCl4,昆明鉑銳金屬材料有限公司); 冰醋酸(CH3COOH,成都化學試劑廠); 醋酸鈉(CH3COONa, 麥克林試劑有限公司); 無水乙醇(成都格雷西亞化學技術(shù)有限公司);所有試劑均為分析純,所用水為去離子水。

    JEM.2100透射電鏡儀(TEM,日本電子株式會社); S.3000N掃描電子顯微鏡 (SEM, 日本Hitachiscience Systemsltd公司); DX.2700X射線粉末衍射儀 (丹東方圓儀器有限公司); CHI660D電化學工作站(上海辰華公司)。實驗中采用三電極體系。

    2.2 實驗方法

    2.2.1 Cu.TPA材料的合成 參照文獻[21]合成Cu.TPA。將0.5265 g Cu (NO3)2·3H2O和0.724 g對苯二甲酸溶解在43.5 mL N,N.二甲基甲酰胺中,溶液變成藍色;將所得溶液轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中,于110℃下反應(yīng)36 h,自然冷卻,用無水乙醇洗滌3次,于80℃真空干燥12 h, 即制得Cu.TPA。

    2.2.2 金納米顆粒的合成 參照文獻[23]合成金納米顆粒。將 500 μL 1% HAuCl4 加入到50 mL 去離子水中,攪拌加熱至沸騰,快速向沸騰溶液中加入2 mL 1%檸檬酸三鈉,繼續(xù)攪拌20 min,等到溶液變?yōu)榫萍t色,冷卻至室溫,即可得到金納米顆粒。

    2.2.3 AuNPs/Cu.TPA復(fù)合材料的合成 取50 mg Cu.TPA粉末溶于15 mL金納米顆粒溶液中,室溫攪拌12 h,溶液由藍色變?yōu)榈凵?。將反?yīng)產(chǎn)物離心分離,60℃真空干燥6 h。

    2.2.4 AuNPs/Cu.TPA復(fù)合材料標記CEA抗體 取2 mg AuNPs/Cu.TPA復(fù)合材料溶于1 mL去離子水中,用0.2 mol/L Na2CO3調(diào)節(jié)溶液至pH 9,取10 μL 1 mg/mL CEA抗體分5次加入(每隔3 min加一次,每次2 μL )上述溶液中進行標記,然后將溶液在室溫下振搖反應(yīng)2 h ,加入10% BSA 25 μL,繼續(xù)振搖反應(yīng)30 min 以封閉剩余的活性位點。將所得溶液以5000 r/min低溫離心5 min,用PBS溶液洗滌2次,分散在1 mL Eluent 緩沖溶液中,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2.5 免疫傳感器的制備 將玻碳電極(Φ=3 mm)在金相砂紙上打磨后,用 Al2O3粉末將電極表面拋光,依次用HNO3(1∶1)、無水乙醇、蒸餾水各超聲洗滌電極5 min。晾干后,參照文獻[24] 方法還原氧化石墨烯,即將玻碳電極浸入到含有氧化石墨烯的電解質(zhì)溶液中,通過循環(huán)伏安法,將分散液中的氧化石墨烯直接進行電化學還原并沉積在裸電極表面,電壓掃描范圍為

    1.5~1.0 V。在晾干后的沉積有還原石墨烯(rGO)的電極上滴加30 μg/mL CEA抗體10 μL,4℃過夜。將此免疫傳感器用0.01 mol/L PBS溶液滴洗3次,晾干后在37℃下用牛血清白蛋白(1% BSA) 封閉1 h,以封閉電極上的非特異性結(jié)合位點。滴加一定濃度的CEA抗原孵育50 min,沖洗后滴加10 μL AuNPs/Cu.TPA復(fù)合材料標記過的CEA抗體培育50 min,制得免疫傳感器(見圖2)。

    2.2.6 檢測方法 將在不同濃度CEA抗原溶液中培育過的免疫傳感器放入10 mL HAc.NaAc緩沖溶液(0.2 mol/L, pH 4.5)中,連接好三電極體系,在0.3~

    0.4 V電位范圍內(nèi)采用示差脈沖伏安法(DPV)進行檢測,振幅50 mV, 脈沖時間0.05 s,脈沖周期0.2 s。實驗結(jié)束后, 用0.01 mol/L PBS清洗電極,并置于4 mol/L尿素溶液中攪拌浸泡30 min, 洗脫電極上結(jié)合的抗原,使電極再生。當電極不用時,于4℃保存。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 Cu.TPA材料的表征

    3.1.1 Cu.TPA材料的XRD表征 對合成的Cu.TPA材料進行了X射線粉末衍射表征, 并與文獻[18]及XRD數(shù)據(jù)庫所得的Cu.TPA單晶數(shù)據(jù)圖進行對比,如圖3所示。得到的衍射面數(shù)據(jù)分別為(110), (001), (020), (11, (20

    1), (021), (111), (130), (131)。經(jīng)過實驗值計算,證實本實驗所合成的材料Cu.TPA與文獻[18]報道的一致,為MOF材料。

    3.1.2 Cu.TPA微觀形貌表征 采用掃描電鏡、透射電鏡表征了Cu.TPA的微觀形貌結(jié)構(gòu)。從圖4可見,Cu.TPA呈均勻的棒狀,長度約為200 nm。

    3.1.3 Cu.TPA/AuNPs材料的表征 為了確定AuNPs/Cu.TPA的微觀形貌結(jié)構(gòu),采用TEM對其形貌進行了表征。從圖5可以清晰看出AuNPs被均勻地負載到 Cu.TPA材料上。

    3.2 氧化還原峰電流與掃描速度的關(guān)系

    為進一步了解AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE免疫傳感器的電化學行為,實驗還考察了掃描速度對AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE的峰電流的影響,當掃描速度在10~100 mV/s 范圍內(nèi)變化時,傳感器在HAc.NaAc緩沖溶液 (0.2 mol/L,pH 4.5)中的循環(huán)伏安行為如圖6所示,峰電流與掃描速度的平方根成正比,說明該電化學反應(yīng)過程受擴散控制,這可能是因為在合成Cu.TPA過程中,Cu的價態(tài)發(fā)生了改變。然而,陰極峰電流較小,說明此電化學過程是不可逆的[25]。

    3.3 不同修飾電極界面的交流阻抗行為

    交流阻抗常被用于表征電極修飾過程。 圖7為不同修飾電極在5 mmol/L K3Fe(CN) 6/K4Fe(CN) 6溶液中的交流阻抗圖。曲線a為裸玻碳電極的阻抗圖,近似呈直線,說明電子傳遞幾乎沒有阻礙;曲線b為修飾了石墨烯后玻碳電極的阻抗圖,阻抗改變很小。曲線c為固定抗體在修飾了石墨烯的玻碳電極上的阻抗圖,阻抗有所增加(R et=500 Ω),這是由于不導(dǎo)電的抗體阻礙了電子在電極表面的傳遞,說明抗體已固定在電極表面上。曲線d是培育CEA抗原后的電極的交流阻抗圖,與曲線c相比,半圓直徑顯著增大(R et=700 Ω),這是由于抗體和抗原的特異性結(jié)合阻礙了電子的傳遞。曲線e是培育了AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA之后的電極交流阻抗圖,阻抗值進一步增大(R et=1450 Ω),這說明免疫復(fù)合物對電子的阻礙作用增強。

    3.4 實驗條件優(yōu)化

    3.4.1 緩沖溶液pH值對傳感器峰電流的影響 溶液的pH值會影響標記材料中Cu的峰電流信號,從而影響免疫傳感器的檢測,實驗考察了pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5的HAc.NaAc緩沖溶液對標記抗體材料中Cu的峰電流響應(yīng)的影響。如圖8所示,當pH值從3.0增加到4.5,還原峰電流也隨之增加; pH值繼續(xù)增加,還原峰電流反而減小,在pH 4.5時,免疫傳感器的電流響應(yīng)值最大。故選擇pH 4.5的HAc.NaAc緩沖溶液作為最佳測試底液。

    3.4.2 固定抗體的濃度對傳感器峰電流的影響 固定抗體濃度是影響免疫傳感器靈敏度和檢測范圍的重要因素,實驗對固定抗體濃度進行了優(yōu)化,濃度優(yōu)化范圍為10~60 μg/mL,結(jié)果如圖9所示,隨著固定抗體濃度增大,傳感器的響應(yīng)電流逐漸增大,當抗體濃度達到30 μg/mL時,響應(yīng)電流最大,繼續(xù)增大濃度。響應(yīng)電流有所減小。因此選擇30 μg/mL作為最佳固定抗體濃度。

    3.4.3 抗原培育時間和標記抗體培育時間對傳感器峰電流的影響 為了考察抗原培育時間對免疫傳感器響應(yīng)電流的影響,采用不同時間培育10 ng/mL CEA抗原, 測定傳感器的響應(yīng)電流值,結(jié)果如圖10a所示, 響應(yīng)電流隨抗原培育時間延長而增大,50 min以后響應(yīng)電流近似平臺,因此選擇50 min作為最佳抗原培育時間。標記抗體培育時間也是影響免疫傳感器的重要因素,將修飾有相同濃度抗原的免疫傳感器在37℃的條件下采用不同時間培育標記抗體,結(jié)果如圖10b所示, 20~50 min,傳感器響應(yīng)電流的絕對值隨著培育時間的延長而逐漸增大; 50~60 min, 電流基本不變,出現(xiàn)平臺,說明此時CEA抗原和AuNPs/Cu.TPA標記的CEA抗體結(jié)合形成了穩(wěn)定的復(fù)合物。因此,最佳標記抗體的培育時間選擇為50 min。

    3.5 免疫傳感器的校正曲線 在最佳實驗條件下,獲得了傳感器對不同濃度的CEA響應(yīng)的曲線。從圖11可見,AuNPs/Cu.TPA labeled anti.CEA/CEA/anti.CEA/石墨烯/GCE免疫傳感器的峰值電流隨CEA濃度的增加而增大,峰電流在0.1~80 ng/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)為0.9887,檢出限為0.03 ng/mL, 正常人體內(nèi)CEA含量為0~25 ng/mL, 所以此CEA免疫傳感器可用于真實樣品的檢測。

    比較了幾種檢測CEA方法的性能。從表1可知,本研究制備的傳感器具有較高的靈敏度、良好的線性范圍和較低的檢出限。

    3.6 免疫傳感器的選擇性

    選擇200 ng/mL的丙氨酸(Ala)、C.反應(yīng)蛋白(CRP)和人絨毛促性腺激素(HCG)以及BSA(1%)作為干擾物質(zhì),與40 ng/mL CEA的響應(yīng)電流作對比,檢測傳感器的抗干擾情況。如圖12所示,在相同條件下,丙氨酸、BSA(1%)、CRP和HCG的濃度遠大于CEA,但所得響應(yīng)電流較小,說明丙氨酸、BSA(1%)、CRP和HCG對CEA的檢測基本不造成干擾,傳感器對CEA具有較高的選擇性。

    3.7 回收率的測定

    采用標準加入法,對CEA免疫傳感器進行回收測定。在血清樣品中加入3種不同濃度的

    CEA抗原,按本方法進行測定,平均回收率為97.5%~102.7%(表2),結(jié)果令人滿意,說明此傳感器可用于實際樣品中CEA含量的測定。

    3.8 免疫傳感器的穩(wěn)定性

    為了考察免疫傳感器的穩(wěn)定性,將所制備的免疫傳感器檢測一次后置于4℃保存,分別在7、15、30天后再次對相同濃度的CEA抗原進行檢測, 測得的電流I與初始電流I0的比值7天后下降到98%,15天后下降到87%,30天后下降到66%, 表明此傳感器的穩(wěn)定性良好。4 結(jié) 論

    采用還原石墨烯作為固定基質(zhì),研制了一種新型CEA免疫傳感器,并用于血清中CEA的檢測。合成了Cu.TPA/AuNPs復(fù)合材料,此材料中的Cu在一定的電位范圍內(nèi)可以通過DPV直接檢測到,以Cu.TPA/AuNPs復(fù)合納米材料為標記材料,制備了夾心型CEA免疫傳感器。此傳感器具有成本低、靈敏度高,抗干擾能力強,檢出限低等特點。將此傳感器用于測定血清樣品中的CEA,結(jié)果令人滿意。

    References

    1 Gold P, Freedman S O. J. Exp. Med., 1965, 121(3): 439-462

    2 Duffy M J. Clin. Chem., 2001, 47(4): 624-630

    3 Shimada H, Noie T, Ohashi M, Oba K, Takahashi Y. Gastric Cancer, 2014, 17(1): 26-33

    4 Grunnet M, Sorensen J B. Lung Cancer, 2012, 76(2): 138-143

    5 Molina R, Barak V, van Dalen A, Duffy M J, Einarsson R. Biomed. Pharm., 2005, 26(6): 281-293

    6 Juweid M, Sharkey R M, Behr T, Swayne L C, Rubin A D, Herskovic T, Hanley D, Markowitz A, Dunn R, Siegel J, Kamal T, Goldenberg D M. J. Clin. Oncol., 1996, 14(4): 1209-1217

    7 Adam J K, Odhav B, Bhoola K D. Pharmacol. Therapeut, 2003, 99(1): 113-132

    8 LI Ou.Lian, LIU Cui, TONG Yan.Li, LI Xiang, CHEN Zuan. Mod. Med. Sci. Apparatus and Appl., 2008, 20(2): 48-51

    李偶連, 劉 翠, 童艷麗, 李 想, 陳 纘. 現(xiàn)代醫(yī)學儀器與應(yīng)用, 2008, 20(2): 48-51

    9 Tian J N, Zhou L J, ZhaoY C, Wang Y, Peng Y, Hong X, Zhao S L. J. Fluorescence, 2012, 22(6): 1571-1579

    10 Haidopoulos D, Konstadoulakis M M, Antonakis P T, Alexioun D G, Manouras A M, Katsaragakis S M, Androulakis G F. Eur. J.Sur. Oncol., 2000, 26(8): 742-746

    11 LI Yuan, FAN Qiu.Hong, LIU Yu.Long, ZHU Shi.Hao. Acta Academ. Med. Suzhou, 1995, 15(2): 225-226

    李 元, 范秋虹, 劉玉龍, 朱世浩. 蘇州醫(yī)學院學報, 1995, 15(2): 225-226

    12 Zhang S S, Yang J, Lin J H. Bioelectrochemistry, 2008, 72(1): 47-52

    13 YANG Jing, ZENG Zhao.Wei, WANG Xue.Qian, ZHAO Qian, SUN Hui, LI Hui.Qiang. Chinese J. Cell and Mole. Immun., 2012, 28(8): 871-873

    楊 靜, 曾昭偉, 王學謙, 趙 倩, 孫 輝, 李會強. 細胞與分子免疫學雜志, 2012, 28(8): 871-873

    14 CHEN Feng.Mei, LI Juan, QU Yuan.Jun, NIU Zhong.Xiang. Chinese J. Vet. Drug, 2004, 38(8): 33-35

    陳鳳梅, 李 娟, 曲原君, 牛鐘相. 中國獸藥雜志, 2004, 38(8): 33-35

    15 LIU Zhi.Hua, JI Yong.Sheng, ZHANG Jing, HUANG Hua.Yu, LIANG Bei. Journal of Instrumental Analysis, 2015, 34(8): 939-943

    劉志華, 紀永升, 張 靜, 黃華宇, 梁 蓓. 分析測試學報, 2015, 34(8): 939-943

    16 Vishnyakov A, Ravikovitch P I, Neimark A V. Nano Lett., 2003, 1(6): 713-718

    17 Yan B, Ma R, Chu Z, Ding L Q, Long Y, Chen L L, Lyu X Q, Bao F J. J. Inorg. Organomet P, 2010, 20(4): 809-815

    18 Yao J, Dong D, Li D, He L, Xu G, Wang H. Chem. Commun., 2011, 47(9): 2559-2561

    19 Cueto S, Gramlich V, Petter W, Rys F S, Rys P. Acta Crystallogr. Sect. C: Cryst. Struct. Commun., 1991, 47(1): 75-78

    20 Carson C G, Hardcastle K, Schwartz J, Liu X, Hoffmann C, Gerhardt R A, Tannenbaum R. Eur. J. Inorg. Chem., 2009, (16): 2338-2343

    21 Li H, Eddaoudi M, Groy T L, Yaghi O M. J. Am. Chem. Soc., 1998, 120(33): 8571-8572

    22 Gao H, Jiang X, Dong Y J, Tang W X, Hou C, Zhu N N. Biosens. Bioelectron., 2013, 48: 210-215

    23 FENG Ren.Qing, GUO Zhen.Quan, MI Jie.Bo. Modern Antibody Technology and its Application. Beijin: Peking University Press, 2006

    馮仁青, 郭振泉, 宓捷波. 現(xiàn)代抗體技術(shù)及其應(yīng)用, 北京: 北京大學出版社, 2006

    24 RAO Hong.Hong, XUE Zhong.Hua, WANG Xue.Mei, ZHAO Guo.Hu, HOU Hui.Hui, WANG Hui. Prog. Chem., 2016, 28(2.3): 337-352

    饒紅紅, 薛中華, 王雪梅, 趙國虎, 侯輝輝, 王 暉. 化學進展, 2016, 28(2.3): 337-352

    25 WANG Ke, JIANG De.Chen, LIU Bao.Hong, ZHANG Song, LYU Tai.Ping, KONG Ji.Lie. Chinese J. Anal. Chem., 2005, 33(3): 411-416

    王 珂, 江德臣, 劉寶紅, 張 松, 呂太平, 孔繼烈. 分析化學, 2005, 33(3): 411-416

    26 Fleisher M, Nisselbaum J S, Loftin L, Smith C, Schwartz M K. Clin. Chem., 1984, 30(2): 200-205

    27 Zhao L, Xu S, Fjaertoft G, Pauksen K, Hakansson L, Venge P. J. Immunol. Methods, 2004, 293(1): 207-214

    28 Tang D Q, Zhang D J, Tang D Y, Ai H. J. Immunol. Methods, 2006, 316(1): 144-152

    Abstract A novel and simple electrochemical immunoassay for carcino.embryonic antigen (CEA) was developed using Au nanoparticles loaded.metal.organic frameworks (AuNPs/Cu.TPA) as signal unit and electrochemical reduction of graphene oxide on the surface of electrode to capture CEA antibody (Ab1). MOFs contain large amounts of Cu2+ ions, which can be used as stable electrochemical signals to achieve the detection of CEA. This new class of signal probe differs from traditional probe because it does not require pre.treatment and acid treatment, and easy to load noble metal for the immobilization of antibody, which will greatly simplify the detection steps and reduce the detection time. This immunosensor has good sensitivity and ease to operate. Under the optimized experimental conditions, the proposed sensing strategy provides a linear dynamic range from 0.1 ng/mL to 80 ng/mL with a detection limit of 0.03 ng/mL and linear correlation coefficient of 0.9887. The developed CEA immunosensor can be used to detect CEA in real sample.

    Keywords Carcino.embryonic antigen; Metal organic framework; Electrochemical immunosensor

    国产 一区精品| 亚洲国产欧美人成| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 久久久久久伊人网av| 久久综合国产亚洲精品| 国产69精品久久久久777片| 美女被艹到高潮喷水动态| av天堂中文字幕网| 黄片wwwwww| 99在线人妻在线中文字幕| 插阴视频在线观看视频| 99热这里只有精品一区| 黄色配什么色好看| 3wmmmm亚洲av在线观看| 久久韩国三级中文字幕| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产av不卡久久| 99riav亚洲国产免费| 人妻久久中文字幕网| 午夜日韩欧美国产| 欧美日本亚洲视频在线播放| 天美传媒精品一区二区| 欧美另类亚洲清纯唯美| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 麻豆av噜噜一区二区三区| 啦啦啦韩国在线观看视频| 插逼视频在线观看| 波多野结衣高清作品| 一级毛片我不卡| 国产久久久一区二区三区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 精品免费久久久久久久清纯| 成人亚洲精品av一区二区| 搞女人的毛片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 天堂√8在线中文| 最近在线观看免费完整版| 成人美女网站在线观看视频| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲精品久久国产高清桃花| 成人美女网站在线观看视频| 中文字幕av成人在线电影| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产毛片a区久久久久| 国产一区二区三区av在线 | 欧美中文日本在线观看视频| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 亚洲真实伦在线观看| 综合色av麻豆| 国产精品伦人一区二区| .国产精品久久| 一区福利在线观看| av卡一久久| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲av五月六月丁香网| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美zozozo另类| 人妻久久中文字幕网| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久精品国产自在天天线| 国产高清有码在线观看视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 看免费成人av毛片| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产精华一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 少妇熟女欧美另类| 99热全是精品| 精品人妻熟女av久视频| 久99久视频精品免费| 国产 一区 欧美 日韩| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产精品,欧美在线| 日韩高清综合在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久热精品热| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 久久久久久久午夜电影| 欧美中文日本在线观看视频| av免费在线看不卡| 午夜老司机福利剧场| 级片在线观看| 一进一出抽搐gif免费好疼| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产免费男女视频| 日日啪夜夜撸| 久久韩国三级中文字幕| 国产av麻豆久久久久久久| 日韩一本色道免费dvd| 淫秽高清视频在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 欧美日韩精品成人综合77777| 91久久精品国产一区二区成人| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线观看66精品国产| 美女黄网站色视频| 麻豆成人午夜福利视频| 欧美高清成人免费视频www| 午夜福利18| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲美女搞黄在线观看 | 午夜福利在线在线| 看黄色毛片网站| 少妇高潮的动态图| 亚洲美女黄片视频| av视频在线观看入口| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 综合色av麻豆| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产午夜福利久久久久久| 深夜精品福利| 少妇人妻精品综合一区二区 | 精品一区二区三区av网在线观看| 在线观看av片永久免费下载| 99国产精品一区二区蜜桃av| 成人综合一区亚洲| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩欧美三级三区| aaaaa片日本免费| 国产成人freesex在线 | 亚洲性久久影院| 无遮挡黄片免费观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| av在线老鸭窝| 国产 一区精品| 中国美女看黄片| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲真实伦在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日韩欧美国产在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 99国产精品一区二区蜜桃av| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲精品一区av在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 又爽又黄a免费视频| 成人毛片a级毛片在线播放| 嫩草影院精品99| 晚上一个人看的免费电影| 高清午夜精品一区二区三区 | 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美激情国产日韩精品一区| 免费高清视频大片| 内地一区二区视频在线| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲成a人片在线一区二区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久精品94久久精品| 国产av一区在线观看免费| 成人av一区二区三区在线看| 偷拍熟女少妇极品色| 亚洲国产精品国产精品| 99国产极品粉嫩在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 99热这里只有是精品50| 91av网一区二区| 春色校园在线视频观看| 欧美+日韩+精品| www.色视频.com| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产黄片美女视频| 精品久久国产蜜桃| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲精品日韩av片在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 日本黄色视频三级网站网址| 综合色丁香网| 国产精品一区二区免费欧美| 一级a爱片免费观看的视频| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 免费av不卡在线播放| 免费高清视频大片| 国产精品久久久久久久久免| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国内精品久久久久精免费| 2021天堂中文幕一二区在线观| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美高清成人免费视频www| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 简卡轻食公司| 亚洲av二区三区四区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 18禁在线播放成人免费| 级片在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 高清毛片免费观看视频网站| 99热这里只有精品一区| 亚洲欧美日韩高清专用| 嫩草影院入口| 啦啦啦啦在线视频资源| 高清午夜精品一区二区三区 | 一本久久中文字幕| 黄色配什么色好看| 俄罗斯特黄特色一大片| 99精品在免费线老司机午夜| 国产精品一及| 午夜福利成人在线免费观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产精品久久视频播放| 免费av观看视频| 日日撸夜夜添| 校园春色视频在线观看| 色在线成人网| 国产美女午夜福利| 寂寞人妻少妇视频99o| 亚洲七黄色美女视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 在线观看一区二区三区| 久久精品国产亚洲网站| 在线观看免费视频日本深夜| 欧美激情在线99| 欧美潮喷喷水| 精品乱码久久久久久99久播| 亚洲美女搞黄在线观看 | 日本黄色片子视频| 日韩一本色道免费dvd| 国产精品久久视频播放| 久久久久国产网址| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 成人特级av手机在线观看| 级片在线观看| 久久这里只有精品中国| 男人狂女人下面高潮的视频| 日韩欧美 国产精品| 日韩av在线大香蕉| 伦精品一区二区三区| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 在线观看免费视频日本深夜| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 真人做人爱边吃奶动态| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲国产精品国产精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 18禁在线无遮挡免费观看视频 | 亚洲av免费在线观看| 一进一出抽搐动态| 亚洲欧美日韩东京热| 丰满的人妻完整版| 久久久久国内视频| 中文字幕久久专区| 久久人人精品亚洲av| 日本爱情动作片www.在线观看 | 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 国产淫片久久久久久久久| 成年版毛片免费区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲欧美成人精品一区二区| 成年女人永久免费观看视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久亚洲精品不卡| 色av中文字幕| 国产 一区精品| 久久精品夜色国产| 国产精品综合久久久久久久免费| 一本一本综合久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲精品国产av成人精品 | 久久午夜亚洲精品久久| 久久精品91蜜桃| 日本免费a在线| 看片在线看免费视频| 久久中文看片网| 免费黄网站久久成人精品| av中文乱码字幕在线| 午夜爱爱视频在线播放| 亚洲一区二区三区色噜噜| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 色哟哟·www| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲av免费在线观看| 亚洲图色成人| 日本 av在线| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产精品福利在线免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 不卡一级毛片| 午夜精品在线福利| 不卡视频在线观看欧美| 久久久成人免费电影| 三级毛片av免费| 黄色日韩在线| 日韩成人av中文字幕在线观看 | 男女视频在线观看网站免费| 又黄又爽又免费观看的视频| 69av精品久久久久久| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产精品三级大全| 国产欧美日韩精品一区二区| 变态另类丝袜制服| 国产精品野战在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 老女人水多毛片| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成年女人毛片免费观看观看9| 蜜臀久久99精品久久宅男| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 变态另类成人亚洲欧美熟女| 午夜福利在线观看吧| 亚洲国产精品合色在线| 日本a在线网址| 亚洲无线观看免费| 久久综合国产亚洲精品| 搞女人的毛片| 一级毛片久久久久久久久女| 97超碰精品成人国产| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 婷婷精品国产亚洲av| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产伦一二天堂av在线观看| 一个人免费在线观看电影| 日韩在线高清观看一区二区三区| av在线天堂中文字幕| 18+在线观看网站| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品一区二区三区av网在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 国产激情偷乱视频一区二区| 男女边吃奶边做爰视频| 99精品在免费线老司机午夜| 一级毛片电影观看 | 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 日韩 亚洲 欧美在线| 免费观看在线日韩| 国模一区二区三区四区视频| av.在线天堂| 午夜免费激情av| 九九在线视频观看精品| 最近手机中文字幕大全| 三级国产精品欧美在线观看| 成人性生交大片免费视频hd| 久久欧美精品欧美久久欧美| 在线看三级毛片| 日本五十路高清| 国产日本99.免费观看| 嫩草影视91久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久久午夜欧美精品| 最近的中文字幕免费完整| 91久久精品电影网| 久久精品夜色国产| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲av成人av| 男插女下体视频免费在线播放| 天堂网av新在线| 22中文网久久字幕| 国产精品女同一区二区软件| 亚洲国产精品久久男人天堂| 91久久精品电影网| 毛片一级片免费看久久久久| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲四区av| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久久久久国产a免费观看| 99热这里只有精品一区| 97碰自拍视频| 国内精品宾馆在线| 99久久九九国产精品国产免费| 成人特级av手机在线观看| 午夜久久久久精精品| 村上凉子中文字幕在线| 久久九九热精品免费| 亚洲av五月六月丁香网| 日韩强制内射视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 99热6这里只有精品| 久久精品91蜜桃| 亚洲高清免费不卡视频| 久久久久久久久久成人| 欧美日韩乱码在线| 又黄又爽又免费观看的视频| 成人无遮挡网站| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 亚洲va在线va天堂va国产| 成年女人看的毛片在线观看| 久99久视频精品免费| 久久久午夜欧美精品| 欧美3d第一页| 午夜a级毛片| 又爽又黄a免费视频| 黑人高潮一二区| 可以在线观看毛片的网站| 男女边吃奶边做爰视频| 国产伦在线观看视频一区| 国产高清有码在线观看视频| 99视频精品全部免费 在线| 日本欧美国产在线视频| 此物有八面人人有两片| 亚洲精品456在线播放app| 黄片wwwwww| 久久久久久久久久久丰满| 久久久久久久久久黄片| 国产激情偷乱视频一区二区| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲专区国产一区二区| 国产片特级美女逼逼视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 啦啦啦啦在线视频资源| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 天堂动漫精品| 人人妻人人看人人澡| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 内射极品少妇av片p| 一个人观看的视频www高清免费观看| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产一区二区三区在线臀色熟女| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日本黄大片高清| 99热6这里只有精品| 一级a爱片免费观看的视频| 直男gayav资源| 日韩欧美三级三区| 久久久欧美国产精品| а√天堂www在线а√下载| 亚洲经典国产精华液单| 最近在线观看免费完整版| 99国产极品粉嫩在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 亚洲第一区二区三区不卡| 99久国产av精品国产电影| 日本免费一区二区三区高清不卡| 一级av片app| 精品一区二区免费观看| 欧美潮喷喷水| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美区成人在线视频| 成人av在线播放网站| 日本与韩国留学比较| 人妻久久中文字幕网| 99久久中文字幕三级久久日本| 青春草视频在线免费观看| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产精品国产高清国产av| 男人的好看免费观看在线视频| 悠悠久久av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产高清激情床上av| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲最大成人av| 少妇高潮的动态图| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产一区二区三区av在线 | 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 国产高清有码在线观看视频| 久久精品91蜜桃| 少妇熟女欧美另类| 热99在线观看视频| 亚洲三级黄色毛片| 嫩草影院新地址| 亚洲成人av在线免费| 精品人妻熟女av久视频| 精品久久久久久久久亚洲| 老女人水多毛片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久精品人妻少妇| 国产91av在线免费观看| 99在线人妻在线中文字幕| 成人永久免费在线观看视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 中文字幕av成人在线电影| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲av.av天堂| 人人妻人人看人人澡| 99久久无色码亚洲精品果冻| 成人av一区二区三区在线看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲av美国av| 国产免费男女视频| 日本欧美国产在线视频| 国产一区二区三区av在线 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 一个人免费在线观看电影| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 在线看三级毛片| 久久久久久伊人网av| 亚洲人成网站在线观看播放| ponron亚洲| 免费看日本二区| 深夜精品福利| 伊人久久精品亚洲午夜| 一本一本综合久久| av国产免费在线观看| 国产色婷婷99| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产v大片淫在线免费观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产成人freesex在线 | 亚洲乱码一区二区免费版| 中文在线观看免费www的网站| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩av在线大香蕉| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 成人亚洲精品av一区二区| 床上黄色一级片| 久久久久国产网址| 久99久视频精品免费| 日韩精品有码人妻一区| 波多野结衣巨乳人妻| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 波多野结衣高清无吗| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲无线在线观看| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲成a人片在线一区二区| 美女黄网站色视频| 内射极品少妇av片p| 久久久色成人| av在线观看视频网站免费| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 综合色丁香网| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 22中文网久久字幕| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 亚洲最大成人av| 国产熟女欧美一区二区| 成人二区视频| 国产黄a三级三级三级人| 看十八女毛片水多多多| 精品无人区乱码1区二区| 国产私拍福利视频在线观看| 久久久久久久久久成人| 麻豆国产av国片精品| 一区福利在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 久久久久九九精品影院| 日本色播在线视频| 国产探花在线观看一区二区| 色播亚洲综合网| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产在视频线在精品| 最近视频中文字幕2019在线8| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一级av片app| 精品久久久久久久久av| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 韩国av在线不卡| 亚洲av美国av| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产老妇女一区| 女人被狂操c到高潮| 九色成人免费人妻av| 黄色日韩在线| 国产69精品久久久久777片| 十八禁网站免费在线| 国语自产精品视频在线第100页| 欧美色欧美亚洲另类二区| 99热只有精品国产| 国产毛片a区久久久久| 久久人人爽人人片av| 99热只有精品国产| 婷婷亚洲欧美| 亚洲成a人片在线一区二区| 十八禁网站免费在线| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 日本黄色片子视频| 变态另类丝袜制服| 国产老妇女一区| 极品教师在线视频| 男女边吃奶边做爰视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 干丝袜人妻中文字幕| 精品久久国产蜜桃| 插逼视频在线观看| 色av中文字幕| 我要看日韩黄色一级片| 永久网站在线| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美日韩乱码在线| 久久精品人妻少妇| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品久久久久久av不卡| 无遮挡黄片免费观看|