陳釀過程對獼猴桃酒多酚及其抗氧化活性的影響

黃佳，程拯艮，樊明濤

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100）

陳釀過程對獼猴桃酒多酚及其抗氧化活性的影響

黃佳，程拯艮，樊明濤*

（西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌712100）

為探究陳釀期間獼猴桃酒中酚類物質與體外抗氧化活性之間的相關性，分析了獼猴桃酒酚類物質種類及其含量、總酚含量以及體外抗氧化能力的變化。結果表明：獼猴桃酒中共檢測出11種單體酚，其中兒茶素與表兒茶素的含量較高。隨著陳釀時間的延長，獼猴桃酒的抗氧化能力及酚類物質含量均有所降低。原兒茶酸、根皮苷與ABTS+·清除力之間呈顯著正相關（P＜0.01），原兒茶酸、鞣花酸、根皮苷與還原能力之間呈顯著正相關（P＜0.01），阿魏酸與羥基自由基清除能力顯著相關（P＜0.01），而沒食子酸、原兒茶酸與DPPH·清除力之間的相關性較低。酚類物質與體外抗氧化活性之間的相關性表明酚類物質對獼猴桃酒體外抗氧化能力起主導作用。

獼猴桃酒；陳釀；酚類物質；抗氧化活性

獼猴桃（Kiwi fruit）為獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia Lindl）植物[1]。獼猴桃除富含鈣、鉀、硒、鋅等微量元素和人體必需的氨基酸外，還富含生育酚、檸檬酸等天然活性物質[2]。研究表明，獼猴桃具有預防癌癥，提高免疫力，促進消化吸收，降血壓，降血脂以及抗炎、抗病毒等多種生理活性功能[3-4]。

獼猴桃酒中的酚類物質對其品質具有重要作用，決定其體外抗氧化能力的高低。果酒中的酚類物質主要來源于果酒原料本身，其次由發(fā)酵過程中的微生物產生。剛發(fā)酵后的獼猴桃新酒，渾濁不清，味不醇和，有辛辣味，缺乏芳香，不適飲用，一般都需要經過貯存一定時間，使不良風味消除或減少，同時生成新的芳香物質，使酒體綿軟適口，醇厚香濃，口味比較協調，這種現象在釀酒行業(yè)里稱為陳釀[5]。陳釀過程中發(fā)生復雜且緩慢的物理化學和生物化學變化[6]。

在陳釀過程中，獼猴桃酒中的酚類物質發(fā)生動態(tài)的變化，對獼猴桃酒的體外抗氧化活性及其品質產生影響。豆一玲等[7]研究了不同陳釀方式對赤霞珠干紅葡萄酒中酚類物質的影響。李阿敏等[8]研究了獼猴桃白酒陳釀期間的香氣成分變化。但關于獼猴桃酒陳釀期間多酚類的變化鮮有報道。本研究采用HPLC-外標法對陳釀期間獼猴桃酒的酚類物質種類及含量進行了分析；采用 4種抗氧化試驗（DPPH·、ABTS+·、羥基自由基清除力和還原能力）對陳釀期間獼猴桃酒的體外抗氧化能力的變化進行了分析，以期為獼猴桃酒品質改善提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選用陜西楊凌區(qū)產華優(yōu)獼猴桃為原料，于2014年采用獼猴桃酒發(fā)酵工藝進行發(fā)酵，灌裝前，經檢測獼猴桃酒各項理化指標均符合國家標準，灌裝后移至儲藏室，保持15℃～18℃進行陳釀。

2，2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、三吡啶三吖嗪（TPTZ），1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、福林酚試劑：北京索萊寶公司；沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、根皮苷、綠原酸、阿魏酸、鞣花酸、對香豆酸、金絲桃苷：美國Sigma公司；抗壞血酸、冰乙酸、乙醇、碳酸鈉等均為分析純。

UV-2000紫外可見分光光度計：龍尼柯（上海）儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；R-120型旋轉蒸發(fā)儀：瑞士BüCHI公司；Waters高效液相色譜：美國Waters公司；Milli-Q超純水儀：美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 總酚含量的測定

采用Folin-Ciocalteu比色法[7]測定總酚含量。

1.2.2 體外抗氧化能力的測定

DPPH·清除率的測定參考DuM等[9]的方法；ABTS+·清除率的測定參考Towantakavanit K等[10]的方法；羥基自由基清除率的測定參考Burin V等[11]的方法；還原能力的測定參考Monagas M等[12]的方法。

1.2.3 酚類物質分析

色譜柱：WatersSymmetryC18柱（100mm×2.1mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：20 μL。梯度洗脫：流動相A：1%乙酸溶液，流動相B（色譜甲醇）；0～10 min，5%～30%B；10 min～25 min，30%～50%B；25 min～35 min，50%～70%B；35 min～40 min，70%～5%B；流速：1.0 mL/min。

定性：將11種單酚分別配成甲醇溶液，在上述色譜條件下進行檢測，確定標準物質的保留時間。

定量：準確稱取0.001 0 g各標樣于甲醇中，分別定溶于10 mL容量瓶，稀釋成不同的濃度梯度，在上述色譜條件下進行檢測，以濃度x為橫坐標，峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線。相同色譜條件下對樣品進行檢測，在標準曲線上，依據各峰面積得到對應的含量。

1.3 數據分析

所有數據均以平均值±標準差表示，采用SPSS 19.0 Duncan法進行分析，顯著性分析，鄧肯氏（Duncan’s）法進行差異性分析。

2 結果與分析

2.1 陳釀期間獼猴桃酒總酚含量的變化

果酒中總酚含量通常采用福林酚法測定，結果見圖1。

圖1 陳釀期間獼猴桃酒總酚含量的變化Fig.1 Change of total phenols content of kiwi wine during aging

由圖1可知，華優(yōu)獼猴桃新酒的總酚含量約為2 420.58 mg GAE/L，這與 Towantakavanit K 等[10]的研究結果一致。在陳釀期間，獼猴桃酒總酚含量緩慢下降。陳釀180 d后，獼猴桃酒的總酚含量減少了27.39%。這可能是因為在陳釀期間，酚類物質之間發(fā)生縮合反應或氧化反應生成新的化合物，有些酚類物質分解，受各種因素影響，如果實成分、儲存溫度、光照、含氧量以及陳釀時間等，不同品種的獼猴桃酒陳釀期間總酚含量的下降程度有一定差異[11-12]。

2.2 陳釀期間獼猴桃酒酚類物質的變化

2.2.1 獼猴桃酒中酚酸

將11種酚酸標品，調整至合適濃度，在1.3.3色譜條件下進樣，根據保留時間定性。11種酚酸標準品的色譜圖見圖2。由圖2可知，11種酚酸標準品在40 min內得到了很好的分離，各波峰沒有交叉現象。

2.2.2 陳釀期間華優(yōu)獼猴桃酒酚類物質動態(tài)變化規(guī)律

以華優(yōu)獼猴桃酒為原料，分析陳釀期間其酚酸類物質動態(tài)變化規(guī)律，結果見圖3。

圖2 11種酚酸標準品色譜圖Fig.2 Chromatography of 11 phenolic acids standards of different mobile phases

圖3 陳釀期間獼猴桃酒酚類物質的變化Fig.3 Change of phenolic profiles of kiwi wine during aging

釀造完成后，獼猴桃酒中非類黃酮（原兒茶素、沒食子酸、鞣花酸、咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸和綠原酸）、黃烷-3-醇（兒茶素、表兒茶素）和黃酮醇（根皮苷、金絲桃苷）的含量分別為44.85、53.39、2.28 mg/L。隨著陳釀時間的延長，獼猴桃酒中酚類物質的含量緩慢增加；中期含量有所下降，陳釀后期基本維持恒定。果酒中，黃酮醇與花青素參與色素的共沉著反應，因而對果酒色澤的穩(wěn)定具有十分重要的作用[13]。酚類物質的穩(wěn)定很大程度上與其分子結構相關。陳釀期間，酚類物質發(fā)生聚合及縮合反應產生其他多酚及酚酸物質，反應機制復雜。研究表明，酚類物質在多級反應中被氧化[23]。

2.2.2.1 兒茶素及表兒茶素的變化

陳釀期間研究了2種最常見的黃烷-3-醇單體：兒茶素和表兒茶素。獼猴桃新酒中表兒茶素的含量顯著高于兒茶素，分別為34.74、18.27 mg/L。陳釀30 d后，獼猴桃酒中兒茶素和表兒茶素的含量分別達到34.72、42.39 mg/L，此后黃烷-3-醇的含量明顯下降，這與酒體中發(fā)生氧化反應及聚合反應生成二聚體等物質有關[13]。在陳釀期間中，黃烷-3-醇與果酒感官性能密切相關，主要起穩(wěn)定色澤的作用。陳釀期間，表兒茶素的含量減少了9.21%，最終含量為31.75 mg/L，明顯高于紅葡萄酒[14]。

2.2.2.2 原兒茶酸的變化

獼猴桃新酒中原兒茶酸的含量為20.37 mg/L顯著高于西拉（11.76 mg/L）、梅洛（8.76 mg/L）和黑皮諾葡萄酒（6.23 mg/L）[15]。陳釀期間，獼猴桃酒中原兒茶酸的含在陳釀前期有微量減少，后期基本維持恒定。

2.2.2.3 咖啡酸的變化

華優(yōu)獼猴桃新酒中咖啡酸的含量較高（10.20mg/L），高于典型的起泡葡萄酒[16]，但與Syrah酒中咖啡酸的含量相似[17]。陳釀前期，咖啡酸的含量緩慢增加，主要歸因于酒石酸酯（如咖啡酰酒石酸及其甲酯類化合物）以及其他化合物的水解[18]，使得咖啡酸的含量增加；中期含量有所下降，陳釀后期基本維持恒定，這與獼猴桃酒中的酚類物質之間發(fā)生氧化或降解反應有關。此外，羥基肉桂酸衍生物的減少與酒體中酚類物質聚合生成棕色大分子也有關[19]。研究表明，陳釀初期，咖啡酸與蛋白質生成可溶性分子，隨著聚合度不斷增加，該復合物變成不溶性的，進而導致酒體渾濁[20]。

2.2.2.4 沒食子酸的變化

沒食子酸作為一種單寧單體，主要來源于果實以及可水解濃縮單寧如沒食子酸酯等的水解[21]。陳釀前，獼猴桃酒中沒食子酸的含量為7.55 mg/L，明顯低于梅洛紅葡萄酒和西拉葡萄酒[22]。陳釀期間，華優(yōu)獼猴桃酒中沒食子酸的含量的變化趨勢與兒茶素相似。陳釀30 d后，獼猴桃酒中沒食子酸的含量增加到12.62 mg/L，可能是因為陳釀期間獼猴桃酒中的酵母發(fā)生自溶釋放出的酶，導致單寧聚合物的水解[16]，使得沒食子酸的含量增加。陳釀60 d后，獼猴桃酒中沒食子酸的含量基本維持穩(wěn)定呈緩慢減少的趨勢。

2.3 陳釀期間獼猴桃酒抗氧化活性的變化

陳釀期間獼猴桃酒抗氧化活性的變化見圖4。

圖4 陳釀期間獼猴桃酒體外抗氧化能力的變化Fig.4 Change of antioxidant activities of kiwi wine during aging

采用不同的方法測定獼猴桃酒的抗氧化活性能夠判定酒樣中的自由基清除機制（HAT機制：基于氫原子轉移和SET機制：基于電子轉移）[24-26]。

獼猴桃果實及其果酒中的營養(yǎng)成分十分復雜，因此其抗氧化活性取決于果實及果酒中含有的酚類化合物的種類及含量、溶解氧以及氧化還原電位[18]。如圖4所示，陳釀期間獼猴桃酒的還原能力、ABTS+·清除能力以及羥基自由基清除能力都有一定程度的減少，與總酚含量的變化趨勢相似。在陳釀前期，獼猴桃酒的體外抗氧化能力基本維持恒定，從90 d開始，獼猴桃酒的體外抗氧化能力明顯降低。陳釀180 d后，獼猴桃酒的體外抗氧化能力降低了40.99%（羥基自由基清除力）、42.51%（ABTS+·清除能力）、15.63%（還原能力）；而DPPH·清除能力變化較小。前期有研究表明，陳釀期間，果酒多酚成分不斷減少，氧化還原能力不斷減弱[27]。2.4 獼猴桃酒酚類物質與抗氧化能力之間的關系

獼猴桃酒酚類物質與抗氧化能力之間的相關性分析見表1。

表1 獼猴桃酒酚類物質與抗氧化能力之間的相關性分析Table 1 Correlation analysis between antioxidant activities and phenolic profile of kiwi wine

研究表明，果酒中的酚類物質可顯著提高其體外抗氧化能力。酚類物質的抗氧化能力，尤其是黃酮類化合物，主要取決于其酚羥基的數量和酚羥基氧與苯環(huán)之間的電子對共振[15，27]。

為研究陳釀期間獼猴桃酒酚類物質與抗氧化能力之間的關系，本文進行了相關性分析（P＜0.05，P＜0.01），獼猴桃酒酚類物質與抗氧化能力之間的相關性分析結果見表1。由表1可知，不同的酚類物質與相同抗氧化指標之間的相關性程度不同，同一酚類物質與不同的抗氧化指標之間的相關性程度不同，這與前人的研究結果一致[16]。ABTS+·清除能力與原兒茶酸、根皮苷之間均存在顯著的正相關，還原能力與原兒茶酸、鞣花酸、根皮苷之間均存在顯著的相關性，DPPH·清除率與鞣花酸之間顯著相關，羥基自由基清除率與阿魏酸之間顯著相關。而DPPH·清除率與沒食子酸、原兒茶酸之間，還原能力與對香豆酸之間存在較弱的正相關性。

分析發(fā)現，表兒茶素、咖啡酸和金絲桃苷與抗氧化能力之間并不存在相關性關系，這表明獼猴桃酒的體外抗氧化能力主要取決于其他酚類物質。

3 結論

本文研究了獼猴桃酒陳釀期間的酚類物質變化。隨著陳釀時間的延長，獼猴桃酒的總酚含量、體外抗氧化能力和酚類物質含量均明顯降低，且獼猴桃酒酚類物質與抗氧化能力之間呈顯著的正相關關系。陳釀期間，獼猴桃酒的體外抗氧化能力存在動態(tài)變化，這可能是由于獼猴桃酒的體外抗氧化能力不僅與某一特定的化合物有關，而是與多種酚類物質有關。陳釀時間的長短對獼猴桃酒的品質有著至關重要的影響，但從保健角度來看，飲用獼猴桃新酒更有利于人體健康。

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Effect of Aging Process on Phenolic Compounds and Antioxidant Activity of Kiwi Wine

HUANG Jia，CHENG Zheng-gen，FAN Ming-tao*
（College of Food Science and Engineering，Northwest A&F University，Yangling 712100，Shaanxi，China）

In order to study in vivo antioxidant activity of kiwi wine during aging and its association with the phenolic compounds，the change of total phenolic content，phenolic compounds and in vivo antioxidant activity of kiwi wine were analyzed.A total of 11 phenolic compounds were identified and quantified，and among them catechin and epicatechin were the major compounds.The results showed that phenol compounds and in vivo antioxidant activity of kiwi wine were significantly reduced as the time extension．ABTS+·scavenging ability were highly correlated with protocatechuic acid and phlorizin，and reducing power were highly correlated with protocatechuic acid and ellagic acid （P＜0.01），and hydroxyl radical scavenging ability were highly correlated with chlorogenic acid and ferulic acid.However，DPPH·scavenging ability were weekly correlated with protocatechuic acid and gallic acid.The correlation between total phenolic compounds and antioxidant activity suggested a predominant role of polyphenolics in the antioxidant capacity.

kiwi wine；aging；phenolic compounds；antioxidant activity

2016-04-01

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.007

黃佳（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品化學與食品發(fā)酵。

*通信作者：樊明濤（1963—），男，博士生導師，教授，研究方向：食品生物技術。