不同免疫抑制劑對小鼠罹患侵襲性肺曲霉病的影響

陳玉寶 陳菲菲 鄒春芳 邵宏濤

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 (南京市第一醫(yī)院)呼吸科,南京 210006)

·論著·

不同免疫抑制劑對小鼠罹患侵襲性肺曲霉病的影響

陳玉寶 陳菲菲 鄒春芳 邵宏濤

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院 (南京市第一醫(yī)院)呼吸科,南京 210006)

目的 比較兩種免疫抑制狀態(tài)造成侵襲性曲霉感染 (IPA)后天然免疫反應(yīng)的異同。方法 清潔級雄性BALB/c小鼠，分別使用地塞米松 (A組)及環(huán)磷酰胺 (B組)預(yù)處理后氣道接種煙曲霉孢子建立IPA模型。觀察小鼠存活率，肺病理檢查，評估肺部及肺外臟器真菌負荷；支氣管肺泡灌洗液 (BALF)檢測促炎、抗炎細胞因子濃度。結(jié)果 A組小鼠平均生存期與B組比較有顯著差異。病理提示A組小鼠肺組織有大量炎癥細胞聚集；B組可見到典型的曲霉菌絲浸潤性生長。B組小鼠肺部煙曲霉CFU、煙曲霉18s rRNA較A組升高；B組肺外各臟器與A組比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異。檢測BALF中炎癥因子：A組TNF-α未檢測到，IL-10峰值在72 h出現(xiàn)，IL-1α自第一天起即升高，第3天達峰值；B組TNF-α及IL-10在24 h后均明顯升高，于48 h達峰值；IL-1α一直在低水平維持；B組與各組間比較，TNF-α、IL-1α及IL-10均有顯著差異。A、B兩組IL-1β表達在接種煙曲霉后均迅速升高，并一直在高水平維持，兩組間無差異。結(jié)論 不同預(yù)處理造成小鼠免疫抑制后建立IPA模型，激素組肺部出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)；環(huán)磷酰胺組可出現(xiàn)顯著的全身真菌播散。

侵襲性曲霉感染；動物模型；小鼠；免疫；致病機制

[Chin J Mycol，2017，12(3):135-139]

侵襲性肺曲霉菌病 (invasive pulmonary aspergillus,IPA)是一種嚴重危及生命的肺部感染，當(dāng)宿主免疫力低下或者吸入孢子數(shù)量超過氣道防御屏障清除能力時，曲霉孢子即可侵入機體導(dǎo)致侵襲感染。根據(jù)我國最新的侵襲性真菌病流行病學(xué)調(diào)查，曲霉感染占全部確診肺真菌感染病例的37.9%，是最常見的致病真菌[1]。在2010年第4屆真菌治療國際會議大會報道中提出[2]：40%IPA感染為非粒缺、非血液病患者。致死率較粒缺患者高 (90% vs 60%)。慢性阻塞性肺部疾病 (COPD)[3-4]長期使用激素及ICU患者[5]具有發(fā)生IPA的高風(fēng)險性。本病的臨床癥狀、體征和影像學(xué)缺乏特異性，并且難以獲得組織證據(jù)，故難以確診。該類患者即使經(jīng)過抗真菌治療其病死率仍高達80%～90%。因此，用動物模型分析IPA的發(fā)生發(fā)展可以為早期診治IPA提供實驗依據(jù)。

近年來針對曲霉感染的免疫研究發(fā)現(xiàn)：吞噬細胞 (中性粒細胞、單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞)[6-7]在抗真菌的保護性反應(yīng)中是必須的，如果此類細胞減少或功能缺陷，均將導(dǎo)致對曲霉的易感。雖然早期由中性粒細胞和巨噬細胞介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)足以控制部分真菌，但是對大多數(shù)致病菌而言，需要有樹突狀細胞、單核細胞等參與的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。宿主免疫抑制狀態(tài)不同會否造成不同的疾病過程及預(yù)后？本實驗擬通過化療藥物或激素預(yù)處理造成免疫抑制后建立小鼠IPA模型，以此探討不同免疫抑制狀態(tài)下肺部局部和全身反應(yīng)及機體的天然免疫反應(yīng)的異同。

1 材料與方法

實驗動物 清潔級健康雄性BALB/c小鼠120只，6～8周齡，平均體重 (20±2) g。分籠飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)中心動物所潔凈、溫控的動物實驗室，實驗室定期消毒，通風(fēng)良好，室溫保持在20～25℃，采用全飼料營養(yǎng)。小鼠可以正常攝食、飲水。所有動物都是按規(guī)定要求使用，通過南京醫(yī)科大學(xué)動物倫理審查，實驗動物許可證號SYXK (蘇)2009-0015。

實驗材料 煙曲霉 (A.fumigatus)AF293菌株由中科院微生物所贈送。環(huán)磷酰胺 (cyclophosphamide，CY)、地塞米松及戊巴比妥鈉，均購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。

煙曲霉孢子懸液制備 將煙曲霉菌株接種于沙堡弱培養(yǎng)基，于霉菌培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)5 d。以含0.02%吐溫80的無菌生理鹽水收獲孢子并定量。

實驗動物分組及免疫缺陷/抑制預(yù)處理 隨機分為4組：A組，激素組 (地塞米松+AF)：于d-1～-3、d0、d2、d4腹腔內(nèi)注射地塞米松，50 mg/kg。B組，化療組 (環(huán)磷酰胺+AF)：d-1、d0、d1連續(xù)3天腹腔注射環(huán)磷酰胺，250 mg/kg。C組，對照組 (生理鹽水)：d-1、d0、d1天腹腔內(nèi)注入生理鹽水。D組，對照組 (生理鹽水+AF)。

煙曲霉感染模型的建立 通過氣管插管，A、B組氣管內(nèi)滴入煙曲霉的方式建立感染模型。C組滴入生理鹽水作為對照，D組滴入煙曲霉對照。以2%戊巴比妥鈉 (30 mg/kg)麻醉小鼠后經(jīng)口氣管插管，每只氣管內(nèi)滴入1×107孢子。小鼠麻醉清醒后自由活動、飲水。為預(yù)防細菌感染，接種當(dāng)日予慶大霉素6 mg/kg肌注1次，接種后直至實驗結(jié)束予環(huán)丙沙星660 mg/L置于水中飲用。每組均隨機抽取8只小鼠行感染后死亡率觀察。未死亡小鼠于第7天脫頸處死。其余小鼠觀察感染后1周內(nèi)死亡情況。分別于接種后第1、2、3天隨機處死小鼠，每組至少5只。

支氣管肺泡灌洗液 (BALF)獲取 操作步驟參照前實驗[8]，取上清液100 μL做細胞分類，余凍存于-80℃冰箱待用。

觀察指標 小鼠感染后一般情況，包括體重、死亡、活動。

組織病理 為觀察不同預(yù)處理后曲霉肺部情況，接種后第3天處死小鼠，左下肺浸入4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，脫蠟，HE及PAM染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理改變。

真菌負荷計量 (1)菌落計數(shù)。第3天處死小鼠，無菌條件下取新鮮右上肺、腎臟、肝臟、脾臟并勻漿化，電子天平稱重后按1 g濕組織：10 mL含0.1%吐溫80磷酸鹽緩沖液比例稀釋，取10 μL、100 μL稀釋液分別接種于兩塊沙堡弱培養(yǎng)基平板上，置于真菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后讀取平板菌落數(shù)，組織的真菌負荷以log10 CFU/g組織表示。(2)煙曲霉18s rRNA測定。第3天處死小鼠，右下肺、腎臟、肝臟、脾臟組織提取RNA，采用Real-time PCR測量煙曲霉18s rRNA (GenBank accession number AB008401)，用標準曲線定量煙曲霉孢子。引物設(shè)計見表1。操作步驟按試劑盒說明書進行。

炎癥因子檢測 分別于第1、2、3天處死小鼠，獲取BALF標本凍存，采用市售ELISA試劑盒做TNF-α、IL-10、IL-1α、IL-1β檢測。

統(tǒng)計分析 感染后以實驗小鼠存活率為縱軸，時間為橫軸繪制生存-時間曲線。采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有計數(shù)資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組計量資料間的比較采用one-way ANOVA分析，壽命表法分析生存時間，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 存活率

觀察7 d，A組小鼠接種后第2天開始出現(xiàn)死亡，第5天死亡率最高，有2只小鼠存活超過1周。B組小鼠接種后8 h即死亡1只，其余均于4 d內(nèi)死亡；A組小鼠平均生存期5.33 d，與B組2.5 d比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.022)(見圖1)。C、D組小鼠均存活。

2.2 一般情況

接種煙曲霉孢子后B組小鼠4 h后即出現(xiàn)發(fā)熱、納差、活動減少、呼吸急促；第1天起出現(xiàn)偏盲，肢體偏癱等腦部播散癥狀；第2天起出現(xiàn)少尿，呼吸困難加重，口唇出現(xiàn)紫紺，肺部聽診出現(xiàn)大量干濕性羅音；A組小鼠自第2天起出現(xiàn)呼吸急促、納差等反應(yīng)并持續(xù)存在，但直至處死均未出現(xiàn)偏盲、少尿等肺外臟器播散癥狀。

2.3 肺組織病理

對死亡小鼠解剖取肺臟，C組、D組小鼠肺呈粉紅色，無組織腫脹及出血；感染組小鼠肺組織呈暗紅色，可見明顯出血壞死灶，B組小鼠大部分可見肺表面膿腫。A組小鼠肺組織病理切片第1天起肺部可見大量中性粒細胞浸潤，灶狀組織壞死；B組小鼠可見明顯的壞死性出血性炎癥，局灶性血管栓塞等病理改變，第3天起可見到典型的曲霉菌絲，即45°角帶隔菌絲。對照組 (C組、D組)小鼠肺組織內(nèi)無菌絲生長，未見肺實質(zhì)壞死、炎癥細胞浸潤，肺泡內(nèi)未見紅細胞聚集現(xiàn)象 (見圖2)。

2.4 BALF細胞分類

A組小鼠接種曲霉后第1天起B(yǎng)ALF中性粒細胞明顯增高并維持在高值，無動態(tài)改變，平均5.71×106±1.6×105/L，B組接種第1天中性粒細胞為4.18×105±9.65×104/L，后迅速下降，第2、3天測定中性粒細胞近乎0，各時間點兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001)；A、B組巨噬細胞第1天無明顯差異 (2.59×105±0.97×105/L VS 2.28×105±1.05×105/L)，A組巨噬細胞自第2天起逐步升高，平均3.33×105±1.12×105/L，B組稍有升高，2.43×105±6.61×104/L，兩組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異 (P=1.05)(見圖3)。

2.5 真菌負荷檢測

A組小鼠肺部曲霉CFU在d1升高 (62±13.34 LgCFU/g)，后隨時間下降，與B組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.001)，與C組及D組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.019,0.224)。B組小鼠接種后d1肺部曲霉CFU即升高，d2、d3逐漸升高，d3達峰值 (444.67±64.9 LgCFU/g)；B組與C組、D組在各個時間點均有明顯差異。自第2天起，B組腎臟、肝臟、脾臟曲霉CFU均明顯增高，A組僅脾臟中d3曲霉CFU稍增高，腎臟、肝臟中均未測出曲霉CFU，各臟器兩組間比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.001)(見圖4)。C組各組織曲霉CFU均未測出，D組肺組織曲霉CFU d1天稍增高，d2、d3均未測出，其余組織曲霉CFU均未測出，兩組間比較無差異。B組肺組織煙曲霉18s rRNA測定持續(xù)增高，腎臟、肝臟、脾臟18s rRNA均明顯增高，與A、C、D組比較，各時間點均有統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.001)(見圖5)。A組在d1增高，后逐漸下降，與C組及D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)。

2.6 炎癥因子檢測

感染煙曲霉后分別于第24、48、96 h獲取BALF行炎癥因子檢測。結(jié)果顯示A組TNF-α未檢測到，可能與激素抑制NF-κB通路有關(guān)；IL-10峰值在72 h出現(xiàn) (86±15 pg/mL)。B組TNF-α及IL-10在24 h后均明顯升高，于48 h達峰值，分別為 (3 120±393，434±97 pg/mL)；D組TNF-α 48 h時升高，但迅速降至閾值以下，而IL-10未測出，C組與D組有類似表現(xiàn)，但TNF-α峰值明顯低于D組。B組與各組間比較，TNF-α及IL-10差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01),而A組與C、D組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異 (見圖6)。IL-1α在激素組的BALF中自實驗第一天起即升高，后逐漸升高，第3天達峰值；而在環(huán)磷酰胺組第一天升高后未再出現(xiàn)進一步變化，一直在低水平維持，兩者間比較有統(tǒng)計學(xué)差異 (P<0.001)，C、D組均無IL-1α表達。IL-1β趨勢與IL-1α不同，A、B兩組在接種煙曲霉后均迅速升高，并一直在高水平維持，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P=0.926)，D組IL-1β稍有升高。實驗組與對照組間均有顯著差異。

圖1 小鼠生存率曲線 圖2 小鼠肺曲霉菌感染病理：A.激素組 (地塞米松+AF);B.化療組 (環(huán)磷酰胺+AF);C.對照組 (生理鹽水);D.對照組 (生理鹽水+AF);C,D.HE染色 (×200);A,B,C-d3,D-d3.六銨銀染色 (×200) 圖3 BALF細胞分類 圖4 感染后各組織曲霉CFU測定 圖5 感染后各組織煙曲霉18s RNA測定 圖6 感染后BALF中炎癥因子濃度

Fig.1 Survival curves of mice Fig.2 Pathological examination of mice:C and D.Micrographs of hematoxylin and eosin stain of lung tissues (×200);A,B,C-d3,D-d3.Micrographs of Gomori sliver staining of lung tissues (×200) Fig.3 Cytological claasification in BALF Fig.4 Pulmonary fungal burdens of mice in tissues Fig.5 Detection ofAsp18s rRNA in tissues Fig.6 Expression of cytokines in BALF of mice

3 討 論

正常機體吸入煙曲霉孢子后可引起一個輕度、短暫的炎癥反應(yīng)從而清除孢子，并不會引起肺部損害。肺泡巨噬細胞、肺單核細胞、氣道上皮細胞是抵抗曲霉菌感染的第一道防線，其后中性粒細胞和CCR2+炎癥細胞招募至氣道發(fā)揮抗真菌的作用。IL-1基因的多態(tài)性在人類對IPA易感或抵抗中起著重要作用[9]。IL-1基因編碼IL-1α、β能提高免疫反應(yīng)，兩者成熟過程并不相同。曲霉感染后IL-1β的產(chǎn)生與MLRP3炎癥子激活有關(guān)，而后者缺乏增加小鼠念珠菌播散。Caffrey[10]在模式小鼠的曲霉感染模型中發(fā)現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液中IL-1β在12 h內(nèi)明顯升高，而肺組織IL-1α表達在48 h內(nèi)持續(xù)增高。同時有研究[11]發(fā)現(xiàn)IL-1α較IL-1β對白細胞的招募更為關(guān)鍵。我們的實驗發(fā)現(xiàn)IL-1α在激素組和環(huán)磷酰胺組的表達趨勢不同，激素組更為顯著，而兩組IL-1β的表達則無明顯差異。這與一個全身性念珠菌感染模型[12]中得到的結(jié)論類似。這可能與環(huán)磷酰胺造成粒細胞缺乏，無法有效招募中性粒細胞有關(guān)；而激素抗炎反應(yīng)主要是抑制NF-κB通路，IL-1β僅對巨噬細胞的抗真菌活性有關(guān)。

我們的實驗顯示，環(huán)磷酰胺預(yù)處理后除可引起肺部嚴重的曲霉侵襲外還可導(dǎo)致曲霉的全身播散，與國內(nèi)外臨床觀察及動物實驗結(jié)果一致，這可能與環(huán)磷酰胺引起的粒細胞減少使機體不能有效清除菌絲有關(guān)[13]。而在激素組肺部病理表現(xiàn)為中性粒細胞的聚集，出血壞死而無明顯菌絲形成，且肺外臟器的真菌負荷小，這與Graybill等[14]的研究結(jié)果類似。他們報道用粒細胞集落刺激因子治療使用激素的小鼠是有害的，可以導(dǎo)致白細胞升高，肺部出現(xiàn)大的膿腫。同時認為大量中粒遷移至感染部位反而造成曲霉肺部炎癥的擴大。這與中性粒細胞活化后大量釋放氧自由基、抑菌肽，加重局部炎癥反應(yīng)有關(guān)[15-17]。一些免疫抑制細胞因子如IL-10、IL-4均能通過抑制吞噬細胞的抗真菌活性而導(dǎo)致對曲霉的易感。本實驗發(fā)現(xiàn)使用環(huán)磷酰胺后BALF中TNF-α及IL-10均明顯升高，而激素預(yù)處理后，僅表現(xiàn)為IL-10輕度升高，這與前期的研究結(jié)果類似[18]，表明在機體抗曲霉中TNF-α有保護性作用而IL-10的過度升高與IPA的致病有關(guān)。在環(huán)磷酰胺組雖然有高TNF-α，但因粒缺，TNF-α招募粒細胞的作用并不能表現(xiàn)出來而導(dǎo)致死亡率增高。

本實驗發(fā)現(xiàn)2只地塞米松預(yù)處理后的小鼠脾臟中第3天曲霉CFU稍增高，而煙曲霉18s RNA的檢查為陰性，考慮與檢查方法有關(guān)。據(jù)報道[19]，在臟器中絲狀真菌常成堆生長，與在培養(yǎng)基中的單個集落單位無法區(qū)分，故CFU測定不能準確反應(yīng)感染絲狀真菌如煙曲霉的數(shù)量。因此檢測煙曲霉18s RNA更能反應(yīng)臟器真菌負荷，減少假陽性。此外，我們的實驗還發(fā)現(xiàn)D組肺組織CFU第1天稍增高，這可能與造模方式系經(jīng)氣道接種有關(guān)。

我們的實驗尚存在一定缺陷。在未來的研究中擬通過評估T細胞亞群、巨噬細胞分型來進一步分析曲霉感染后免疫狀態(tài)與嚴重度的相關(guān)性；通過亞組分析來判斷增大激素劑量或延長使用時間對肺部感染和播散的影響，以更好的為臨床診治IPA提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本實驗結(jié)果顯示IPA的發(fā)生、發(fā)展與不同的免疫狀態(tài)密切相關(guān)，機體的天然免疫能力在抗曲霉中起著重要的作用。

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[本文編輯] 王 飛

Comparison of two immunosuppressive agents on the infection and inflammation of experimental invasive pulmonary aspergillosis mice models

CHEN Yu-bao,CHEN Fei-fei,ZOU Chun-fang,SHAO Hong-tao

(DepartmentofRespiratoryMedicine,NanjingFirstHospital,NanjingMedicalUniversity,Nanjing210006,China)

Objective To establish an experimental immunosuppressed mice model of invasive pulmonary aspergillosis (IPA),to evaluated various parameters of the innate immune response during the progression of IPA.Methods Immunosuppressed mice

the intratracheal administration ofA.fumigatusconidia after two immunosuppressive treatments:a corticosteroid (group A) and a cyclophosphamidum agent (group B).We compared host responses 24 h,48 h and 72 h after infection in terms of survival,lung tissue histopathological analysis,fungal burden,pulmonary production of pro- and anti-inflammatory cytokines.Results The group A showed longer survival than group B did (5.33 vs 2.5 d,P<0.05).Group A showed severe bleeding and congestive,and lung tissue granuloma formation;while group B showed visibleA.fumigatushyphae,tissue necrosis 48 h after infection.Through CFUs andA.fumigatus18sRNA detections,fugal burdens were significantly lower in lungs of corticosteroid-treated mice than those of cyclophosphamidum-treated mice.This difference was also observed in livers and kidneys,indicating that the level of fungal dissemination was higher in group B than that of group A.In group B mice,the IL-10 concentration increased by 48 h after infection and peaked at 72 h (86+15 pg/mL).No TNF-α production was detected.In group A mice,both TNF-α and IL-10 were detected at very high concentrations at 48 h (3 120±393，434±97 pg/mL).IL-1α expression increased 24 h after infection in group A mice and continually increased within the 3 days.But in group B,IL-1α concentrations maintained with low level.In both group A and B,the expressions of IL-1β increased dramatically after infection.Conclusion Establishing the IPA animal models of the mice by corticosteroid and chemotherapy-treated,We found that IPA pathogenesis was difference between the two groups:the inflammation response of lung was severe in corticosteroid-treated mice than those in chemotherapy-treated mice,while chemotherapy-treated mice showing an adverse host response.

invasive pulmonary aspergillosis；animal model；mice；immunology；pathology

國家自然科學(xué)基金 (81200004)，南京市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展重點項目 (ZKX13014)

陳玉寶，女 (漢族)，碩士，主治醫(yī)師.E-mail:interloper9@163.com

邵宏濤,E-mail:shaohongtao111@126.com

R 519.8

A

1673-3827(2017)12-0135-05

2016-12-08