一個豬場高致病性PRRSV的分離鑒定

任素芳+郭立輝+李為棟+張召坤+李興光+崔寶玉+吳家強+張玉玉

摘 要：本研究對一個豬場高致病性PRRSV疑似病例進行了病理剖檢、PRRSV N蛋白基因RT-PCR擴增以及序列測定和分析。結(jié)果表明，N2號分離株N蛋白核苷酸序列與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）的一致性均為99.1%，N3/N4號與高致病性毒株的一致性均為98.9%，由此判定該豬場病豬感染毒株為高致病性PRRSV。該研究結(jié)果可為養(yǎng)豬生產(chǎn)中高致病性PRRSV感染的判斷提供借鑒。

關鍵詞：病理解剖；PRRS；高致病性PRRSV；RT-PCR；序列測定

中圖分類號：S858.285.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）12-0129-04

Abstract The suspected cases of highly pathogenic PRRSV from a pig farm were conducted autopsy， the gene sequence of N-protein of PRRSV was amplified by RT-PCR， and then its sequence was determined and analyzed. The identity of the nucleotide sequence of N-protein was 99.1% between the isolate N2 and the highly pathogenic strains （JXA1， HuN4， SX-1 and TJM）， and that of isolate N3/N4 was 98.9% with the highly pathogenic strains. The results showed that the infected virus was highly pathogenic PRRSV in the pig farm. This research provided a reference for the diagnosis of highly pathogenic PRRSV infection in swine production.

Keywords Pathological anatomy； PRRS； Highly pathogenic PRRSV； RT-PCR； Sequencing

豬繁殖與呼吸障礙綜合征（PRRS）俗稱豬藍耳病，由動脈炎病毒科豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）引起，是一種急性病毒性傳染病[1，2]。高致病性PRRSV是我國現(xiàn)階段豬藍耳病流行的主導毒株，對豬呼吸系統(tǒng)、繁殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)均有強的致病力，有很多豬場因為感染該病遭到毀滅性打擊[3-8]。2016年6月份，某自繁自養(yǎng)的豬場發(fā)生疫情，該豬場的哺乳仔豬陸續(xù)發(fā)病，出現(xiàn)眼瞼水腫、發(fā)熱、食欲減退、皮膚發(fā)紅、呼吸急促等現(xiàn)象，有的可見咳嗽、腹瀉、震顫等癥狀，發(fā)病率達到80%，死亡率達到50%以上，使用黃芪多糖、抗生素等治療效果均不明顯。

為了對該豬場病情進行確診，以便對癥治療，本研究對疑似病例進行病理解剖、RT-PCR擴增及序列測定和分析，以期對PRRSV毒株做出準確判斷， 為及時采取有效的控制措施、提高豬的成活率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

對4例病死豬進行解剖，觀察病理變化。分別采集各病豬的腎、脾、肺、淋巴結(jié)組織各少許，-20℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 材料和試劑

PRRSV陽性對照由本實驗室保存；RT-PCR一步法試劑盒、DL2000 DNA Marker、凝膠回收試劑盒等購自大連寶生物工程有限公司；PTC-2000型PCR儀購自美國MJ Research公司。

1.3 引物設計與合成

根據(jù)PRRSV N蛋白基因序列設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列為正向引物F：5′-ATGCCAAATAACAACGG-3′；反向引物R：5′-TGCTGAGGGTGATGCTGT-3′。引物的擴增片段大小為369 bp。

1.4 樣品處理與RNA提取

樣品RNA的提取參照文獻[9]，試驗操作均在冰盒上完成，所用槍頭、離心管均為RNase-free。取約2 g病料加入適量滅菌的PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.4）進行研磨，研磨后反復凍融3次，4℃、5 000 r/min離心2 min；取250 μL上清加入750 μL Trizol和200 μL氯仿，振蕩混勻，-20℃靜置5 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；取500 μL上清加入等量的異丙醇，顛倒數(shù)次，-20℃靜置20 min，4℃、12 000 r/min離心15 min收集沉淀；75%酒精洗滌沉淀后，20 μL滅菌水溶解沉淀即為樣品RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-PCR擴增

RT-PCR擴增采用一步法。反應體系為25 μL，其中：2× 1 Step Buffer 12.5 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL，上游引物F 1 μL，下游引物R 1 μL，RNA模板3 μL，RNase-free ddH2O 6.5 μL。反應程序為：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min，95℃預變性1 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，重復30個循環(huán)； 72℃延伸10 min；4℃保存。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 目的基因序列測定與分析

RT-PCR擴增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定。測序結(jié)果與GenBank發(fā)表的JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株、NADC30株、SD1株、VR2332株的N蛋白基因序列進行比對，使用DNASTAR軟件繪制進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理變化

剖檢該豬場4例病死豬，發(fā)現(xiàn)有如下病理變化：淋巴結(jié)褐色腫大、有的出血，脾臟有梗死點，肺臟呈紅褐花斑狀且間質(zhì)增寬，腎臟紫紅色且表面有零星的出血點，喉頭及氣管充血且含有少量液體泡沫。初步診斷該豬場感染了豬藍耳病病毒。

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

采集的4例病料提取RNA后，進行RT-PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，3例病料均有一條369 bp的特異DNA片段，與目的片段大小一致（圖1），說明所檢病料有3例為PRRSV陽性（表1），且2號和4號病料為強陽性。

2.3 序列測定及分析

2.3.1 序列同源性比對 RT-PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，序列命名為20160805_D17_N2_.seq、 20160805_D18-N3N4-.seq。將測定結(jié)果與GenBank發(fā)表的JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株、NADC30株、SD1株、VR2332株的N蛋白基因序列進行比對，如圖2所示。

同源性分析結(jié)果如圖3所示，N2號分離株N蛋白核苷酸序列與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）的一致性均為99.1%；與經(jīng)典毒株（VR2332株、SD1株）的一致性均為 93.3%；與北美強毒株NADC30株的一致性為90.1%。N3/N4（N3、N4號混合）號與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）的一致性均為98.9%；與經(jīng)典毒株（VR2332株、SD1株）的一致性均為93.3%；與北美強毒株NADC30株的一致性為90.2%。

2.3.2 進化樹分析 結(jié)果如圖4所示，20160805_D17-N2- .seq、 20160805_D18-N3N4- .seq與高致病性毒株N蛋白基因序列JXA1（EF112445）.seq等處于同一分支，與其余毒株的N蛋白基因序列關系較遠。說明所檢病料為高致病性PRRSV陽性。

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法是無菌采取病豬的血清或腹水或取肺、扁桃體和脾等組織數(shù)小塊， 應用豬原代肺泡巨噬細胞培養(yǎng)物或MARC-145或HS2H細胞進行培養(yǎng)，然后再進行鑒定，這種方法費時費力，不適于疾病的快速診斷[10]。本研究通過病理剖檢、PRRSV N蛋白基因RT-PCR擴增以及序列測定和分析，證明某豬場PRRSV分離株與高致病性毒株（JXA1株、HuN4株、SX-1株、TJM株）遺傳距離比較近，確定該豬場病死豬為高致病性PRRSV感染。

采用臨床剖檢和實驗室檢測相結(jié)合的手段快速鑒別診斷豬的藍耳病毒株，為指導養(yǎng)殖場采取相應的緊急防治措施提供了依據(jù)，從而減少豬場的經(jīng)濟損失。

參 考 文 獻：

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