藍(lán)莓煤污病病原菌鑒定及防治藥劑篩選

岳清華+董克鋒+高勇+廖甜甜+胡博+姜惠鐵

摘 要：采用單孢分離法分離病原菌，并通過癥狀觀察、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、回接方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，引起藍(lán)莓煤污病的優(yōu)勢(shì)病原菌有3種，即尖孢枝孢（Cladosporium oxysporum）、枝細(xì)枝孢（Cladosporium ramotenellum）、交鏈格孢（Alternaria alternate）。為篩選防治藍(lán)莓煤污病的有效藥劑，選擇7種殺菌劑進(jìn)行田間藥效試驗(yàn)，其中10%多抗霉素、500 g/L異菌脲對(duì)藍(lán)莓煤污病防治效果較好，施藥4周后相對(duì)防效分別達(dá)到78.56%、64.09%。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓；煤污?。徊≡b定；藥效

中圖分類號(hào)：S436.63文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）12-0121-03

Abstract The pathogens of sooty mould in blueberry were isolated with single spore separation， and were conformed through symptom observation， morphological and molecular biological identification and back inoculation. The results showed that the dominant pathogens were Cladosporium oxysporum， Cladosporium ramotenellum and Alternaria alternate. To screen effective agents to control the sooty mould in blueberry， seven fungicides were selected for field efficacy trials. Among which， 10% polyoxin and 500 g/L iprodione had good effects against blueberry sooty mould， and the relative control effects reached 78.56% and 64.09% respectively after application for 4 weeks.

Keywords Blueberry； Sooty mould； Pathogenic identification； Fungicide effect

藍(lán)莓，學(xué)名越橘，杜鵑花科越橘屬（Vaccinium spp.）植物，小漿果樹種[1]。藍(lán)莓果實(shí)含有大量對(duì)人體健康有益的物質(zhì)，常食對(duì)人的眼睛有良好的保健作用，還可以清除體內(nèi)自由基，增強(qiáng)毛細(xì)血管柔韌性、預(yù)防血栓形成、抵抗泌尿系統(tǒng)感染、抑制癌細(xì)胞增殖等[2]。

藍(lán)莓煤污病近幾年在膠南地區(qū)藍(lán)莓園經(jīng)常發(fā)生，初期癥狀為葉片、枝條上有黑色霉點(diǎn)，后在枝條、葉片上形成深暗綠色點(diǎn)狀霉層，嚴(yán)重時(shí)可連結(jié)成片，直至翌年春天。該病影響植株光合作用，樹勢(shì)衰弱。本研究對(duì)藍(lán)莓煤污病的病原菌進(jìn)行了鑒定，并選擇了7種高效低毒殺菌劑進(jìn)行田間試驗(yàn)，為藍(lán)莓煤污病的有效防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病害癥狀觀察與病原菌鑒定

于山東省膠南地區(qū)藍(lán)莓生產(chǎn)基地，觀察藍(lán)莓煤污病癥狀。選擇癥狀明顯的藍(lán)莓煤污病葉片，挑取煤污霉層，無菌水稀釋后采用單孢分離法[3]分離病原菌。分離后在PDA培養(yǎng)基上純培養(yǎng)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定。分子生物學(xué)鑒定交由第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)上海生工生物有限公司進(jìn)行鑒定并出具報(bào)告。

用分離到的病原菌孢子懸浮液做接種物，濃度為1×107個(gè)孢子/mL，選擇高20 cm的藍(lán)莓缽苗進(jìn)行接種試驗(yàn)。接種前先將10%濃度的蜂蜜水噴灑于藍(lán)莓葉片上，后噴灑孢子懸浮液。以清水作為對(duì)照。噴灑完成后，恒溫28℃、濕度95%以上培養(yǎng)觀察。

1.2 藥劑選擇與施藥方法

選擇樣地內(nèi)樹體大小一致、煤污黑斑程度基本相近的樹作為試驗(yàn)對(duì)象。選擇7種藥劑（見表1）進(jìn)行試驗(yàn)，濃度為藥劑推薦濃度。設(shè)清水對(duì)照。每處理3棵藍(lán)莓樹，重復(fù)3次。藥劑噴施時(shí)以葉面噴施均勻、藥劑不下滴為準(zhǔn)。

1.3 病害調(diào)查方法

噴藥2、4周后，每棵樹選擇東南西北4個(gè)方向各5個(gè)枝條，掛牌。統(tǒng)計(jì)枝條上的總?cè)~片數(shù)、不同病級(jí)葉片數(shù)，計(jì)算病葉率、病情指數(shù)和相對(duì)防效。

病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無黑斑；1級(jí)：黑斑面積占葉片面積的25%及以下；2級(jí)：黑斑面積占葉片面積的26%～50%；3級(jí)：黑斑面積占葉片面積的51%～75%；4級(jí)：黑斑面積占葉片面積的76%及以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 癥狀觀察

藍(lán)莓葉片正面、枝條上附著暗綠色霉層，初期點(diǎn)狀分布，后逐漸擴(kuò)大至全葉及枝條，霉層厚而疏松（如圖1），影響植株的光合作用。該病春季主要發(fā)生于冬暖棚，棚內(nèi)通風(fēng)不良濕度增大，誘導(dǎo)該病發(fā)生，夏末雨季高溫潮濕易誘發(fā)大田煤污病。

2.2 病原菌鑒定

經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，引起藍(lán)莓煤污病的3種優(yōu)勢(shì)病原菌為尖孢枝孢（Cladosporium oxysporum）[4]、枝細(xì)枝孢（Cladosporium ramotenellum）[4]、交鏈格孢（Alternaria alternate）[5]。

尖孢枝孢：在PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d后，菌落直徑達(dá)35 mm，菌落正面為深橄欖綠色，菌落邊緣近深灰色，背面深灰黑色，氣生菌絲短而致密；分生孢子橢圓形、檸檬形或近球形，無色或淡褐色，光滑，0～2個(gè)隔膜，分生孢子大?。?～5.6）μm ×（1.8～3.6）μm。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，分離獲得菌株的ITS序列提交到GenBank比對(duì)，與登錄號(hào)為KT936546的菌株Cladosporium oxysporum同源性達(dá)100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果確認(rèn)該病菌為C.oxysporum。

枝細(xì)枝孢：在 PDA 培養(yǎng)基上28℃恒溫黑暗培養(yǎng) 7 d后，菌落直徑達(dá)65 mm，菌落平展，粉狀，近橄欖綠色，背面橄欖褐色，菌落有細(xì)微輪紋；分生孢子球形、近球形或卵形，單胞，（2.8～6.8）μm×（2.0～3.9） μm。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，分離獲得菌株的ITS序列提交到GenBank比對(duì)，與登錄號(hào)為KP701972的菌株Cladosporium ramotenellum同源性達(dá)100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果確認(rèn)該病菌為C.ramotenellum。

交鏈格孢：在PDA培養(yǎng)基上28℃恒溫黑暗培養(yǎng)3 d后，菌落直徑達(dá)50 mm，菌落致密，深墨綠色，中夾雜灰色菌絲，背面呈黑褐色，有輕微同心輪紋，；分生孢子倒棒形，褐色，常有喙，有縱隔膜1～2個(gè)，橫隔2～5個(gè)，橫隔處有縊縮現(xiàn)象，大小為（11.5～30.5）μm × （6. 8～12.9）μm。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，分離獲得菌株的ITS序列提交到GenBank比對(duì)，與登錄號(hào)為KU179665的菌株Alternaria alternate同源性達(dá)99%。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果確認(rèn)該病菌為A.alternate。

2.3 病原菌回接

將接種缽苗保濕培養(yǎng)3 d后，葉片上即可看見少許小點(diǎn)狀霉層長出，清水對(duì)照未發(fā)病，待典型病斑形成后，挑取少許霉層進(jìn)行顯微鏡觀察，經(jīng)驗(yàn)證與田間發(fā)病所觀察情況一致，進(jìn)一步證明3種優(yōu)勢(shì)菌為藍(lán)莓煤污病病原菌。

2.4 藥劑篩選

如表2所示，試驗(yàn)選擇的7種藥劑對(duì)藍(lán)莓煤污病的防治效果差異較大。其中10%多抗霉素防治效果最好，施藥4周后病情指數(shù)由施藥前的13.37下降到4.17，相對(duì)防效達(dá)78.56%，500 g/L異菌脲次之，施藥4周后病情指數(shù)由12.21下降到6.99，相對(duì)防效達(dá)64.09%，二者間差異不顯著。其余5種藥劑效果較差，相對(duì)防效均未超過50%，且五者間差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定，引起膠東半島藍(lán)莓煤污病的優(yōu)勢(shì)病原菌為尖孢枝孢（Cladosporium oxysporum）、枝細(xì)枝孢（Cladosporium ramotenellum）、交鏈格孢（Alternaria alternate）。枝孢霉是引起多種植物煤污病的主要種群，如黃瓜煤污病[6]、柑橘煤污病[7]、小麥煤污病[8]等。C.ramotenellum是一種海洋真菌[9]，目前還沒有引發(fā)病害的報(bào)道。C.oxysporum可以引起辣椒葉斑病[10]，A.alternate可引起多種植物病害，如梨黑斑病[11]、棗斑病[12]、楊葉枯病[13]、番茄黑斑病[14]等。

由藥劑防治試驗(yàn)可知，10%多抗霉素和500 g/L異菌脲對(duì)藍(lán)莓煤污病的防治效果優(yōu)于其它5種藥劑，施藥4周后病情指數(shù)下降較快，相對(duì)防效分別為78.56%和64.09%，可在防治藍(lán)莓煤污病時(shí)應(yīng)選擇10%多抗霉素與500 g/L異菌脲交替使用，以免病原菌產(chǎn)生抗藥性。

藍(lán)莓煤污病春季發(fā)生于冬暖大棚，此時(shí)如果棚內(nèi)爆發(fā)蚜蟲，蚜蟲分泌的蜜露會(huì)誘發(fā)并加重煤污病的發(fā)生，所以春季防治蚜蟲也是預(yù)防煤污病發(fā)生的一個(gè)重要因素，同時(shí)棚內(nèi)要開棚透風(fēng)，避免濕度過大。藍(lán)莓煤污病也少量發(fā)生在果實(shí)上，在萼洼處出現(xiàn)厚霉層，藍(lán)莓煤污病對(duì)藍(lán)莓果實(shí)采后儲(chǔ)存是否有影響，還要進(jìn)一步做儲(chǔ)藏試驗(yàn)驗(yàn)證。

參 考 文 獻(xiàn)：

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