一種高效解磷復(fù)合菌劑的篩選與應(yīng)用

苑偉偉+趙陽國+井永蘋+劉魯民

摘 要：通過平板透明圈和液體培養(yǎng)測定有效磷含量的方法初步篩選得到一株高效解磷真菌WL06，將該菌株與一株促生解淀粉芽孢桿菌WL21按照不同質(zhì)量比進行復(fù)配，根據(jù)解磷復(fù)合菌劑對盆栽油菜中土壤有效磷含量和油菜長勢的影響來篩選復(fù)合菌劑配方。盆栽試驗結(jié)果表明，解磷菌WL06與促生菌WL21質(zhì)量比為1∶2時解磷促生效果最好，與單一解磷菌相比，土壤有效磷含量提高66.50%，油菜鮮重提高30.76%。表明，解磷復(fù)合菌劑比單一解磷菌能夠更好地提高土壤中有效磷含量，從而促進作物對磷元素的吸收，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：解磷菌；復(fù)合菌劑；作物增長

中圖分類號：S154.39文獻標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）12-0086-05

Abstract Using plate and liquid culture methods to determine the available phosphorus content in liquid medium， an efficient phosphate-solubilizing fungus WL06 was screened. The fungus was mixed with a plant growth-promoting rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens WL21 in different mass ratios. Then the effects of different proportions of microbial inoculants on soil available phosphorus content and growth vigor of potted rape were investigated to screen the optimum formula. The results showed that they had the best phosphate-solubilizing and growth-promoting effects when the mass ratio of WL06 and WL21 was 1∶2. Under this formula， the soil available phosphorus content improved by 66.50% and the rape fresh weight increased by 30.76% than those of single phosphate-solubilizing fungus. This study indicated that the phosphorus-solubilizing compound inoculants had better effects on improving the soil available phosphorus than the single fungus， which would further promote the absorption of phosphorus by crop and increase crop yield and quality.

Keywords Phosphate-solubilizing bacteria； Compound microbial inoculants； Crop growth

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，解磷菌的研究一直是關(guān)注的熱點，特別是國家“一控兩減三基本”的政策中提出，爭取到2020年實現(xiàn)化肥和農(nóng)藥的零增長，這是生物肥料和生物農(nóng)藥發(fā)展的大好時機。研究表明，土壤中難溶磷占全磷含量的98%，其中難溶有機磷源占70%（植酸鈣占68%），難溶無機磷源占28%，僅有2%左右的磷源是以植物能夠直接吸收利用的可溶性磷鹽形式存在[1]。土壤有效磷含量很低而全磷含量較高，如據(jù)黃土高原7省區(qū)的調(diào)查，土壤全磷平均較有效磷高250倍；黃淮海平原黃潮土與風(fēng)沙土全磷較有效磷高130～500倍。農(nóng)業(yè)中通過施入大量磷肥獲得高產(chǎn)，但很大一部分磷肥施入土壤后很快被土壤固定成難溶性磷化合物[2]。影響土壤中磷有效性的因素很多，其中微生物對土壤磷的轉(zhuǎn)化和利用率影響最大，解磷微生物的篩選是近些年來研究的熱點。作物根際區(qū)域是一個復(fù)雜的環(huán)境，需要多種微生物與作物根際共同作用才能完成物質(zhì)的吸收和運輸過程。即使微生物將土壤中的難溶性磷解離出來變?yōu)橛行B(tài)磷，有效態(tài)磷也不一定能被作物很好地吸收利用，所以不能依靠單純的解磷微生物來提高作物對磷肥的利用率，需要一種包含解磷菌和促生菌在內(nèi)的復(fù)合微生物菌劑共同發(fā)揮作用，才能提高土壤中有效態(tài)磷的含量并促進作物根系的吸收利用。

本研究就是將高效解磷真菌與作物促生菌復(fù)配，制成復(fù)合微生物菌劑，在盆栽試驗中研究復(fù)合菌劑對土壤中有效磷含量及油菜生長狀況的影響，為解磷復(fù)合微生物菌劑的市場化應(yīng)用和推廣提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供篩選解磷功能菌株編號為WL01～WL20，促生菌株編號為WL21。所有菌株均由青島蔚藍生物研發(fā)中心微生態(tài)實驗室分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL。

無機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g， MnSO4·4H2O 0.03 g，Ca3（PO4）2 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2（瓊脂20 g），115℃滅菌30 min。

有機磷培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，植酸鈣5.0 g，蒸餾水1 000 mL， pH 7.2（瓊脂20 g），115℃滅菌30 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 固體平板初篩 將20株供試菌株接種于無機磷和有機磷固體平板培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，培養(yǎng)3～5天，測定菌落直徑（R）及溶磷圈直徑（D），根據(jù)溶磷圈直徑與菌落直徑的比值（D/R）初步確定溶磷能力較強的菌株，用于液體培養(yǎng)復(fù)篩。

1.3.2 液體培養(yǎng)復(fù)篩 取平板初篩中溶磷能力較強的菌株，接種于PDA平板培養(yǎng)基30℃活化培養(yǎng)3天，制備孢子懸浮液，等量接種于無機磷和有機磷液體培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min培養(yǎng)，每天取樣離心，上清液用鉬藍比色法測定有效磷含量，連續(xù)測定7天，通過有效磷含量進一步篩選解磷效果好的菌株，用于盆栽試驗。對照為不接種菌的空白培養(yǎng)基。

1.3.3 盆栽試驗 供試土壤為石灰性土壤，pH值8.0，有效磷含量10.43 mg/kg，全氮0.082%。供試作物為油菜。因油菜生長對磷素比較敏感所以選擇油菜為供試作物，品種為四季青幫油菜。

將復(fù)篩得到的兩株解磷真菌WL05和WL06添加到供試土壤中，每千克土壤添加菌劑為1.0 g和2.0 g，通過評價油菜盆栽試驗中土壤有效磷變化和油菜長勢篩選較好解磷菌株及施用量。試驗分別設(shè)4個處理（表1），每處理重復(fù)3次?？瞻讓φ諡椴惶砑泳鷦?。

作物種子先用0.4%次氯酸鈉表面滅菌，然后用滅菌蒸餾水清洗4次除去次氯酸鈉，55℃滅菌蒸餾水浸種，30℃溫箱培養(yǎng)過夜，后轉(zhuǎn)入滅菌紗布催芽。播種時，接種處理每盆用菌劑2.0 g 拌種，種子表面完全粘滿菌劑，剩余菌劑與種子下方0～5 cm土壤混合均勻，然后點種。對照為不接菌處理，使用等量滅菌菌劑拌種，方法同接種處理。每盆播發(fā)芽種子5粒，出苗后每盆留苗2株。

作物生長45天后收獲，采用游標(biāo)卡尺測量主根直徑，并對整株油菜稱重，評價油菜長勢；測定土壤中有效磷含量（碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法）[3]，比較解磷效果。

1.3.4 復(fù)合菌劑篩選 將盆栽試驗中復(fù)篩得到的較佳解磷菌株與促生菌株WL21，按照菌劑質(zhì)量比1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3做成復(fù)合微生物菌劑，編號分別為FH1、FH2、FH3、FH4。將4種復(fù)合菌劑進行油菜盆栽試驗，并將解磷菌劑單獨作為一個處理，不添加任何菌劑的土壤為空白對照。根據(jù)土壤有效磷的變化和油菜長勢的差異評價解磷促生復(fù)合菌劑與單一解磷菌劑的功能性差異。盆栽供試土壤、作物與操作同1.3.3。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進行處理，利用SPSS 16.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 固體平板培養(yǎng)初篩結(jié)果

通過解磷透明圈觀察，20株供試菌中有8株產(chǎn)生透明圈，4株D/R大于1（表2），其中菌株WL06在無機磷和有機磷培養(yǎng)基上產(chǎn)生的透明圈直徑與菌落直徑的比值分別為2.0和1.8，顯著高于WL05和WL10（P<0.05），WL01 D/R 最小，顯著低于其它菌株（P<0.05）。

2.2 液體培養(yǎng)復(fù)篩結(jié)果

圖1可見，固體培養(yǎng)初篩得到的4株菌有效磷含量在無機磷液體培養(yǎng)條件下逐漸增加，均在第4天達到最高，之后基本保持穩(wěn)定。其中WL06有效磷含量最高，達683.19 mg/L，其次為WL05，達466.87 mg/L，WL10和WL01僅為90.27 mg/L和84.75 mg/L。因此，WL06在難溶性無機磷液體培養(yǎng)中解磷效果最好，其次是WL05。

4株菌有效磷含量在有機磷液體培養(yǎng)條件下逐漸增加（圖2），其中WL06在第6天達最高，為 186.55 mg/L，其次為WL05，在第7天最高，為98.68 mg/L，二者最高有效磷含量明顯高于WL10的59.76 mg/L和WL01的49.47 mg/L。從有效磷含量達到最高值的時間和含量綜合比較，可以看出WL06在難溶性有機磷液體培養(yǎng)中解磷效果最好，其次是WL05。

2.3 單菌油菜盆栽試驗效果評價

圖3可見，不同菌株及其不同用量對油菜土壤解磷能力不同，T1、T2處理為菌株WL05添加量分別為1.0 g/kg土和2.0 g/kg土，土壤有效磷含量分別達到12.72 mg/kg和16.89 mg/kg；T3、T4處理為菌株WL06添加量分別為1.0 g/kg土和2.0 g/kg土，土壤有效磷含量分別達到17.12 mg/kg和20.30 mg/kg。T4處理土壤有效磷含量顯著高于T2、T3處理，T2、T3處理顯著高于T1、CK處理。由此可見，菌株WL06添加量2.0 g/kg土的處理T4最好。

由表3中盆栽油菜鮮重、主根直徑可以看出，不同菌株不同用量對油菜長勢影響明顯。菌株WL05添加量為1.0 g/kg土和2.0 g/kg土兩個處理T1、T2的鮮重比對照分別增加7.17%和14.56%，主根直徑分別增長4.51%和12.03%。菌株WL06添加量為1.0 g/kg土和2.0 g/kg土兩個處理T3、T4的鮮重比對照分別增加15.48%和22.76%；主根直徑分別增長13.16%和37.22%。其中菌株WL06添加量為2.0g/kg土的處理T4最好，油菜的鮮重和主根直徑均顯著高于其它處理，具有顯著的促生和增產(chǎn)效果。

2.4 復(fù)合菌劑油菜盆栽試驗效果評價

解磷復(fù)合菌配方FH1、FH2、FH3、FH4各處理土壤有效磷含量分別為25.45、35.47、42.59、36.87 mg/kg（圖4），單一解磷菌WL06處理土壤的有效磷含量為21.30 mg/kg，由此可見，復(fù)合菌劑處理的土壤有效磷含量都比單一解磷菌劑處理高，其中配方FH3土壤有效磷含量最高，顯著高于其他處理，其次為配方FH2和FH4處理，F(xiàn)H1處理最低，與單一解磷菌WL06差異不顯著。

由表4中數(shù)據(jù)可以得出解磷復(fù)合菌配方FH1、FH2、FH3、FH4各處理盆栽油菜的鮮物重增長率分別達到25.70%、31.02%、55.77%、40.02%，單一解磷菌WL06的油菜鮮物重增長率為19.12%；主根直徑增長率分別達到16.67%、17.89%、28.05%、20.73%，單一解磷菌WL06的油菜主根直徑增長率為14.23%。其中配方FH3處理鮮物重和主根直徑增長率均為最高，并且與單一解磷菌差異顯著。各處理盆栽油菜的長勢見圖5，F(xiàn)H3處理根系圖見圖6。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，解磷真菌的解磷效果往往好于解磷細(xì)菌。Kucey等[4]從草原土中分離的解磷真菌大多為青霉和曲霉，并證明雖然解磷真菌種類不多，但其解磷能力通常比細(xì)菌強。PDA平板上培養(yǎng)7天，細(xì)菌解磷能力為0.08～2.65 mg，而大部分真菌解磷能力一般是細(xì)菌的5倍，最高可達12.8 mg。林啟美等[5]也發(fā)現(xiàn)真菌解磷能力比細(xì)菌強，溶解磷礦粉能力較強的細(xì)菌溶磷能力為26.92～43.34 mg/kg，而大多數(shù)真菌則為59.64～145.36 mg/kg。王富民等[6]和范丙全等[7]對青霉菌（Penicillium bilaii）、曲霉菌（Aspergillus niger）解磷功能做了深入研究，發(fā)現(xiàn)第1茬接種青霉菌與單施磷肥的玉米和花生的生物量沒有差異，但明顯提高了花生和玉米的吸磷量，第2茬接種青霉菌顯著增加玉米、花生的生物量和吸磷量。蔡磊等[8]通過對14株細(xì)菌解磷能力篩選得到的最好解磷細(xì)菌液體培養(yǎng)的最高解磷量為19.10 μg/mL。本試驗中解磷真菌菌株WL06在液體培養(yǎng)中解無機磷能力達到683.19 mg/L，解有機磷能力達到186.55 mg/L，解磷能力較強。

在油菜盆栽試驗中，郝晶等[9]研究表明，不同解磷菌群能增加作物地上鮮重7.0%～44.4%。邢芳芳等[10]研究中施用解磷菌后雞毛菜鮮重增加32.94%。賀國強等[11]研究表明，接種解磷復(fù)合菌劑可使小麥根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐富度指數(shù)提高。方華舟等[12]研究表明，復(fù)合菌劑處理稻田土壤，可使土壤有效磷含量增加32.17%。賀國強等[13]研究表明，解磷復(fù)合菌劑可使小麥最高增產(chǎn)14.49%。與之相比，本研究應(yīng)用復(fù)合菌劑后，油菜鮮重提高55.77%，表現(xiàn)出很好的應(yīng)用效果。

4 結(jié)論

本研究篩選得到一株解磷真菌，通過與一株促生菌以1∶2的質(zhì)量比復(fù)配制成的復(fù)合菌劑可使土壤中有效磷含量提高272.3%，油菜主根直徑提高28.05%，鮮重增長55.77%，比單一解磷菌具有更明顯的促生、增產(chǎn)效果，表現(xiàn)出很好的應(yīng)用前景。

參 考 文 獻：

[1] Trafdar J C， Gharu A. Mobilization of organic and poorly soluble phosphates by Chaetomium globosum[J]. Applied Soil Ecology， 2006， 32（3）： 273-283.

[2] 王莉晶.高效解磷菌的篩選及其對小麥生長的影響[D].大連：大連理工大學(xué)，2008.

[3] 鮑士旦.土壤農(nóng)化分析[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2000.

[4] Kucey R M N， Janzen H H， Leggett M E. Inorganic phosphate solubilizing microorganisms： microbially mediated increases in plant available phosphorus[M]. Academic Press Inc.， 1989：202-220.

[5] 林啟美，王華，趙小蓉，等.一些細(xì)菌和真菌的解磷能力及其機理初探[J].微生物學(xué)通報，2001，28（2）：26-30.

[6] 王富民，劉桂芝，張彥，等. 高效溶磷菌的分離、篩選及在土壤中溶磷有效性的研究[J].生物技術(shù)，1992，2（6）：34-37.

[7] 范丙全，金繼運，葛誠.溶磷草酸青霉菌篩選及其溶磷效果的初步研究[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（5）：525-530.

[8] 蔡磊，李文鵬，張克勤.高效解磷菌株的分離、篩選及其對小麥苗期生長的促進作用研究[J].土壤通報，2002，33（1）：44-46.

[9] 郝晶，洪堅平，劉冰，等.不同解磷菌群對豌豆生長和產(chǎn)量影響的研究[J].作物雜志，2006（1）：73-76.

[10]邢芳芳，徐文鳳，宋濤，等.一株高效溶磷真菌的溶磷特性及其促生效果研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2013，28（增刊）：357-360.

[11]賀國強，陳三鳳. 固氮、解磷復(fù)合菌劑對小麥根際土壤細(xì)菌群落的影響[J].中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，20（5）：81-88.

[12]方華舟，左雪枝. 稻田固氮解磷解鉀菌篩選及其復(fù)合菌劑對土壤培肥作用[J].中國土壤與肥料，2014（2）：82-87.

[13]賀國強，王磊，鄧志平，等. 固氮·解磷菌劑對小麥種子萌發(fā)及田間小麥產(chǎn)量的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（7）：3875-3876，3888.