大白菜玻利瑪細(xì)胞質(zhì)雄性不育系92—09A的形態(tài)特征及相關(guān)基因的克隆與表達(dá)模式分析

王紅霞+李洪雷+郝建梅+丁謙+張一卉+王鳳德+鄧永林+王均邦+何啟偉+李景娟+高建偉

摘 要：玻利瑪細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Pol CMS）是目前很有利用價(jià)值的胞質(zhì)雄性不育源。在前期的研究中，我們利用柯桂蘭提供的大白菜Pol CMS不育源為母本，以大白菜骨干親本92-09為輪回親本，培育出大白菜Pol CMS不育系92-09A。本研究對(duì)大白菜Pol CMS不育系92-09A及其保持系92-09、恢復(fù)系早28的形態(tài)特征進(jìn)行觀察，并對(duì)相應(yīng)的不育基因Braraorf224及其恢復(fù)基因BraraPPR進(jìn)行了克隆及生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，大白菜Pol CMS不育系92-09A的花瓣、萼片和雌雄蕊都比保持系92-09小，不能形成有活力的成熟花粉粒；其保持系和雜種F1（不育系92-09A×恢復(fù)系早28）均可以產(chǎn)生有活力的花粉粒。大白菜Pol CMS不育基因Braraorf224及恢復(fù)基因BraraPPR與甘藍(lán)型油菜的Pol CMS不育基因及恢復(fù)基因同源性很高。qRT-PCR結(jié)果顯示，BraraPPR在恢復(fù)系早28和雜種F1中的表達(dá)量均明顯高于雄性不育系92-09A。本研究可為進(jìn)一步揭示大白菜Pol CMS雄性不育機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大白菜；Pol CMS；不育基因；恢復(fù)基因

中圖分類號(hào)：S634.1+Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）12-0006-10

Abstract Polima cytoplasmic male sterile （Pol CMS） is a very important CMS source in plant breeding. In the previous study， we used Pol CMS line KG-Pol of Chinese cabbage provided by Professor Ke Guilan as female parent and core line 92-09 as recurrent parent to breed Pol CMS line 92-09A of Chinese cabbage. Here， the morphological characteristics of Chinese cabbage Pol CMS line 92-09A， its parental maintainer line 92-09 and restorer line Zao 28 were investigated， and the Pol CMS gene Braraorf224 and its restorer gene BraraPPR were cloned and analyzed. The results showed that the petals， sepals， stamens and pistils of Chinese cabbage Pol CMS line 92-09A were all smaller than those of its maintainer line 92-09， and it could not form mature pollen with viability. While the maintainer line 92-09 and the F1 hybrid of Pol CMS line 92-09A×restorer line Zao 28 both had pollen grains with viability. Bioinformatics analysis indicated that the nucleic acids and amino acids of Chinese cabbage Pol CMS gene Braraorf224 and restorer gene BraraPPR were very close to those of Brassica napus.The results of qRT-PCR showed that the expression level of BraraPPR in restorer line Zao 28 and F1 hybrid were both higher than that in Pol CMS line 92-09A. The research would be helpful to understand the molecular mechanism of Pol CMS of Chinese cabbage in the future.

Keywords Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）； Polima cytoplasmic male sterile （Pol CMS）； Male-sterile gene； Restorer gene

大白菜起源于中國(guó)，是我國(guó)的特產(chǎn)蔬菜。山東是大白菜的重要起源地之一，有豐富的種質(zhì)資源，純系間雜交往往表現(xiàn)出極強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。大白菜雜種優(yōu)勢(shì)利用是靠一代雜種實(shí)現(xiàn)的。利用雄性不育系生產(chǎn)一代雜種是最理想的制種技術(shù)之一[1]。

大白菜雄性不育主要包括核基因雄性不育和核質(zhì)互作雄性不育。由于使用核不育系配制的商品種子實(shí)際上是三交種，所以核不育系在生產(chǎn)中應(yīng)用的難度較大。目前報(bào)道的大白菜核質(zhì)互作雄性不育源主要來(lái)自于甘藍(lán)型油菜玻利瑪（Polima）細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Pol CMS）和蘿卜Ogura細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Ogura CMS）材料。甘藍(lán)型油菜Polima雄性不育源的發(fā)現(xiàn)大大促進(jìn)了大白菜優(yōu)勢(shì)育種的發(fā)展[1，2]。

1972年，傅廷棟等[3]發(fā)現(xiàn)油菜Pol CMS雄性不育株，隨后利用Pol CMS實(shí)現(xiàn)了三系配套，培育出優(yōu)良油菜品種華雜2號(hào)、湘雜8號(hào)及華雜3號(hào)。此后，Pol CMS被傳至歐美等國(guó)，培育出多個(gè)油菜雜交種。1985-1994 年， 中、加、澳、印等國(guó)共注冊(cè)（審定）22 個(gè)油菜雜交種， 17個(gè)注明不育系來(lái)源中， 13個(gè)利用玻利瑪雄性不育材料。Pol CMS成為目前很有利用價(jià)值的胞質(zhì)雄性不育源[4]。Polima不育性的利用受到了其它植物育種學(xué)家的重視。任成偉等（1992）[5]將油菜Pol CMS 不育材料與小白菜進(jìn)行種間雜交和回交， 獲得小白菜不育系；向長(zhǎng)萍等（2000）[6]用紅菜薹大股子作轉(zhuǎn)育親本， 轉(zhuǎn)育Polima雄性不育系， 經(jīng)4 年6 代選擇， 育成原始不育系。在大白菜育種方面，柯桂蘭等（1992）[7]選育出大白菜Pol CMS不育系，其它大白菜育種工作者也相繼選育出多個(gè)Pol CMS不育親本材料[8]。

1994年，我們利用柯桂蘭提供的Pol CMS雄性不育源，選育出大白菜Pol CMS不育系92-09A。本研究擬通過(guò)大白菜Pol CMS不育系92-09A的選育、形態(tài)特征觀察，并對(duì)其相應(yīng)的不育基因、恢復(fù)基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)、表達(dá)模式分析，為進(jìn)一步揭示大白菜Pol CMS雄性不育機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料選育與培養(yǎng)

1.1.1 大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A的選育 以柯桂蘭饋贈(zèng)的雄性不育KG-Pol植株為母本，以大白菜骨干親本純系92-09為輪回親本，連續(xù)回交6代，選育獲得大白菜Pol CMS雄性不育純系92-09A。92-09即為92-09A的保持系。不育系92-09A與早28產(chǎn)生的一代雜交種（“魯白13號(hào)”，又稱“西白1號(hào)”）花粉可育，早28即為92-09A的恢復(fù)系。

1.1.2 材料培養(yǎng) 取92-09A、保持系、恢復(fù)系及92-09A×早28 F1種子，萌發(fā)后4℃低溫春化4周，于3月15日前后移栽至山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所實(shí)驗(yàn)田內(nèi)，保證其正常開花，于盛花期分別取花和花蕾進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、花粉活力鑒定及RNA提取。

1.2 花器官形態(tài)觀察及花粉活力鑒定

采用Nikon Eclipse TE2000-S顯微鏡對(duì)雄性不育系92-09A、保持系92-09及92-09A×早28 F1的花器官形態(tài)進(jìn)行觀察，采用亞歷山大染液對(duì)花粉活力進(jìn)行鑒定，方法參考Alexander（1969）[9]。

1.3 基因克隆、生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析

1.3.1 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 取當(dāng)天和第二天花瓣展開的Pol CMS不育系92-09A、恢復(fù)系早28及92-09A×早28 F1的花和花蕾分別提取總RNA。采用TRNzol-A+試劑盒（天根）進(jìn)行RNA提取，方法參考說(shuō)明書。反轉(zhuǎn)錄按照TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）產(chǎn)品說(shuō)明書操作。

1.3.2 大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224的克隆 以大白菜Pol CMS不育系92-09A總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用引物（正向引物：5′-ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTT-3′；反向引物5′-TCATCGAAATAGATCGAGGATTT-3′）對(duì)Pol CMS雄性不育基因Braraorf224進(jìn)行全序列PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：2×高保真PCR Mix 10 μL，上游引物（10 mmol/L）0.5 μL，下游引物（10 mmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，36個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

1.3.3 大白菜Pol CMS 雄性不育系恢復(fù)基因BraraPPR的克隆及表達(dá)模式分析 以恢復(fù)系早28總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用引物（正向引物：5′- ACACGAAATTATCACCAA-3′；反向引物5′- CTGAAACTTTAAGACGGA -3′）對(duì)Pol CMS 雄性不育系的恢復(fù)基因BraraPPR進(jìn)行全序列PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：2×高保真PCR Mix（天根） 10 μL，上游引物（10 mmol/L）0.5 μL，下游引物（10 mmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 3 min； 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 3 min，36個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

Real-time PCR使用TaKaRa公司的SYBR green PCR master mix，儀器為IQ5 Real-Time PCR system （BIO-RAD， Hercules，CA，USA），八聯(lián)管為AXYGEN公司生產(chǎn)，內(nèi)參基因?yàn)锳ctin2。擴(kuò)增Actin2的正向引物為5′-AGGAAGGATCTGTACGGTAAC-3′，反向引物為5′-TTCTGTGAACGATTCCTGGAC-3′。擴(kuò)增BraraPPR的正向引物為5′-CCCCACAGAGGTTTAGTCCC-3′，反向引物為5′-TCACCAACCCTTCCTACCTTACA-3′。熒光定量PCR反應(yīng)采用兩步法進(jìn)行： 95℃ 2 min； 95℃ 15 s，60℃ 30 s， 45 個(gè)循環(huán)，并在反應(yīng)結(jié)束后制作熔解曲線，檢測(cè)是否有引物二聚體生成。

1.3.4 生物信息學(xué)分析 利用克隆得到的基因序列在GenBank中進(jìn)行BLAST檢索，查找Pol CMS雄性不育基因Braraorf224及恢復(fù)基因BraraPPR在其它物種中的同源序列。利用DNAMAN 6.0軟件對(duì)來(lái)自不同物種的Pol CMS雄性不育基因及恢復(fù)基因的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 大白菜Pol CMS 雄性不育系92-09A的選育及其形態(tài)特征

2.1.1 大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A及保持系 自1972年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，Pol CMS雄性不育源已被廣泛應(yīng)用于甘藍(lán)型油菜三系配套生產(chǎn)制種工作中[2]。1992年，柯桂蘭等將甘藍(lán)型油菜Pol CMS雄性不育源應(yīng)用于大白菜育種中，育成了以Pol CMS為不育源的大白菜核質(zhì)互作雄性不育系[7]。1994年，我們以柯桂蘭饋贈(zèng)的大白菜Pol CMS雄性不育KG-Pol植株為母本，以大白菜骨干親本純系92-09為輪回親本進(jìn)行連續(xù)回交，歷經(jīng)6年，選育獲得了大白菜Pol CMS雄性不育純系92-09A。大白菜骨干親本92-09即為Pol CMS雄性不育系92-09A的保持系。保持系92-09是以亞蔬中心的夏陽(yáng)為基礎(chǔ)材料經(jīng)多代自交選育的穩(wěn)定大白菜自交不親和系。

利用親本92-09與另一個(gè)骨干親本早28配置組合，獲得了大白菜雜交新品種“魯白13號(hào)”（又稱“西白1號(hào)”）。由于親本92-09是Pol CMS雄性不育系92-09A的保持系，所以我們利用不育系92-09A×早28大面積生產(chǎn)“魯白13號(hào)”一代雜種。一代雜交種（92-09A×早28）長(zhǎng)出的植株，花粉可育，因此大白菜親本早28即為Pol CMS雄性不育系92-09A的恢復(fù)系。

大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A、保持系92-09外葉深綠、無(wú)毛，葉柄綠色，球葉疊抱，葉球綠色，早熟，耐高溫高濕?！棒敯?3號(hào)”是山東省審定的第一個(gè)夏白菜品種，該品種外葉綠色、無(wú)毛，葉柄淺綠，球葉扣抱，葉球淺綠色，耐高溫高濕，山東地區(qū)6月起壟播種，45～50天成熟，品質(zhì)優(yōu)，口感好，成熟后及時(shí)收獲[10]。

2.1.2 大白菜Pol CMS雄性不育系的花器結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 圖1是大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A、保持系92-09及雜種F1（92-09A×早28）花器結(jié)構(gòu)、花粉粒形態(tài)的部分圖片。大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A的花蕾較保持系92-09小， 但外觀看比較飽滿，無(wú)干扁的癥狀。遇低溫及生長(zhǎng)弱等不利環(huán)境條件時(shí)，會(huì)出現(xiàn)敗蕾現(xiàn)象，但是到后期這一現(xiàn)象通過(guò)規(guī)范管理可有效地消除。花器大小方面， 不育系92-09A植株的花瓣、萼片、雌雄蕊都比保持系92-09?。▓D1A～D）。且保持系92-09的花藥飽滿，花粉充足，具有明顯的散粉現(xiàn)象（圖1A、C）；不育系92-09A雄蕊短小瘦弱，花絲短縮，緊箍在雌蕊基部，花藥錐形，內(nèi)無(wú)花粉（圖1B、D）。保持系92-09、雜種F1（92-09A×早28）可以產(chǎn)生圓形飽滿的花粉粒（圖1F、G）；而不育系92-09A不能形成圓形飽滿有活力的成熟花粉粒（圖1E）。不育系92-09A除花藥不育、花器略微瘦小外，其它器官如子房、蜜腺等功能正常，這為利用胞質(zhì)雄性不育系從事大規(guī)模制種提供了可能。

2.2 大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224的克隆及序列分析

2.2.1 大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224的克隆 以大白菜Pol CMS不育系92-09A花、花蕾總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，對(duì)大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得669 bp的條帶。測(cè)序后通過(guò)序列比對(duì)，初步認(rèn)定該基因是甘藍(lán)型油菜Pol CMS雄性不育基因Branorf224 （Accession No. EU254235）的同源基因，命名為Braraorf224。Braraorf224基因編碼222個(gè)氨基酸，編碼區(qū)內(nèi)不含有內(nèi)含子（圖2）。

2.2.2 大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224的生物信息學(xué)分析 通過(guò)在GenBank中的BLAST檢索，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)甘藍(lán)型油菜Pol CMS雄性不育基因，編碼蛋白長(zhǎng)度分別為222個(gè)氨基酸（Accession No. YP_717120）、224個(gè)氨基酸（Accession No. EU254235），分別命名為Bran22、Bran24。在青菜、芥菜中也發(fā)現(xiàn)了Pol CMS雄性不育基因，分別為青菜Brach （Accession No. AAT42256）、芥菜BraJ （Accession No. AAO48983）。擬南芥中的Pol CMS雄性不育基因蛋白為At（Accession No. NP_085529）。對(duì)來(lái)自不同物種的Pol CMS雄性不育基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224（Brara）編碼的氨基酸序列與甘藍(lán)型油菜Bran22的一致性為100%，與甘藍(lán)型油菜Bran24的一致性為78%，與芥菜BraJ的一致性為73%，與青菜Brach的一致性為72%。但是，Brara與擬南芥At的一致性僅為46%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于上述蕓薹屬物種（圖3）。從進(jìn)化樹的結(jié)果來(lái)看，大白菜Brara 與油菜Bran22的親緣關(guān)系最為接近，與擬南芥At親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（圖4）。

2.3 大白菜Pol CMS 雄性不育系恢復(fù)基因BraraPPR的克隆及表達(dá)分析

2.3.1 大白菜Pol CMS 雄性不育系恢復(fù)基因BraraPPR的克隆 以大白菜Pol CMS 雄性不育恢復(fù)系早28花、花蕾總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，對(duì)恢復(fù)基因BraraPPR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得2 444 bp的條帶，經(jīng)測(cè)序?yàn)楦仕{(lán)型油菜Pol CMS恢復(fù)基因BrnPPR1 （Accession No. XM_013841641）的同源基因，命名為BraraPPR。BraraPPR基因編碼區(qū)長(zhǎng)1 953 bp，編碼650個(gè)氨基酸，編碼區(qū)內(nèi)不含有內(nèi)含子（圖5）。

2.3.2 大白菜Pol CMS 雄性不育系恢復(fù)基因BraraPPR的生物信息學(xué)分析 通過(guò)GenBank中的BLAST檢索，在甘藍(lán)型油菜、甘藍(lán)、亞麻薺、山葵、擬南芥中均發(fā)現(xiàn)有Pol CMS不育系恢復(fù)基因的同源基因，它們編碼的蛋白質(zhì)分別為油菜BrnPPR1（Accession No. XM_013841641）、油菜BrnPPR2 （Accession No. XM_013853446）以及甘藍(lán)BroPPR （Accession No. XM_013744538 ）、亞麻薺CsPPR （Accession No. XM_010460416 ）、山葵EsPPR （Accession No. XM_006417174）、擬南芥AtPPR（Accession No. NM_101102）。利用DNAMAN軟件對(duì)上述蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)大白菜BraraPPR的氨基酸序列與油菜BrnPPR1、甘藍(lán)BroPPR、油菜BrnPPR2、山葵EsPPR、亞麻薺CsPPR、擬南芥AtPPR的一致性分別為98%、77%、73%、73%、71%、70%（圖6）。從進(jìn)化樹的結(jié)果來(lái)看，大白菜BraraPPR與油菜BrnPPR1的親緣關(guān)系最為接近（圖7）。

2.3.3 大白菜Pol CMS 雄性不育系恢復(fù)基因BraraPPR的表達(dá)模式分析 利用不育系92-09A、恢復(fù)系早28及雜種F1（92-09A×早28）的花、花蕾提取總RNA，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，對(duì)Pol CMS 雄性不育系恢復(fù)基因BraraPPR進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)（圖8）。結(jié)果表明，恢復(fù)基因BraraPPR在雜種F1花器中的表達(dá)量最高，其次是恢復(fù)系，在不育系中的表達(dá)量最低；雜種F1、恢復(fù)系中的表達(dá)量分別是不育系的4.9倍和3.1倍。

3 討論與結(jié)論

3.1 Pol CMS雄性不育的轉(zhuǎn)育及其利用

大白菜與甘藍(lán)型油菜同屬十字花科蕓薹屬，可以雜交結(jié)實(shí)。人們可以利用有性雜交將甘藍(lán)型油菜Pol CMS雄性不育基因?qū)氪蟀撞酥?。目前大白菜中使用的Pol CMS均來(lái)自于甘藍(lán)型油菜。在本研究中，我們以柯桂蘭饋贈(zèng)的大白菜Pol CMS雄性不育KG-Pol植株為母本，通過(guò)多代回交轉(zhuǎn)育，獲得了大白菜Pol CMS雄性不育純系92-09A。92-09A的花瓣、萼片和雌雄蕊都比保持系92-09小，花藥錐形干癟，不能形成有活力的成熟花粉粒。通過(guò)對(duì)大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A的不育基因Braraorf224和恢復(fù)基因BraraPPR的序列分析，發(fā)現(xiàn)它們與甘藍(lán)型油菜Pol CMS雄性不育基因Bran22和恢復(fù)基因BrnPPR1的氨基酸序列一致性分別為100%、98%。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，Braraorf224與油菜Bran22親緣關(guān)系最近， BraraPPR與油菜BrnPPR1親緣關(guān)系最近。說(shuō)明我們獲得的大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A的不育基因及其恢復(fù)基因來(lái)自于甘藍(lán)型油菜。

在大白菜Pol CMS雄性不育轉(zhuǎn)育過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)不育株經(jīng)常出現(xiàn)嵌合型、低溫敏感型、高溫敏感型不育。實(shí)踐中常見同一株上可育/敗育并存，低溫表現(xiàn)不育， 溫度升高后又轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎桓邷叵虏挥?在通過(guò)低溫影響后， 又變?yōu)榭捎Ｐ璐罅亢Y選保持系， 才能育成穩(wěn)定不育系。這與已有的報(bào)道結(jié)果相同[11，12]。因此，克服上述Pol CMS 雄性不育系的缺點(diǎn)是利用Pol CMS 雄性不育生產(chǎn)一代大白菜雜交種首先要面對(duì)的重要育種問題。為此，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分子育種研究室與山東登海種業(yè)股份有限公司西由種子分公司聯(lián)合攻關(guān)，力爭(zhēng)解決這一難題。目前，這方面的研究進(jìn)展順利，已獲得了對(duì)高、低溫不敏感的大白菜Pol CMS不育系。

雖然人們選育出了許多大白菜Pol CMS雄性不育系，但是真正利用Pol CMS雄性不育系大面積生產(chǎn)一代雜交種的例子尚不多見。造成這種情況的原因，除前面提到的Pol CMS的花粉敗育易受溫度影響不穩(wěn)定外，還存在另外一個(gè)重要原因，就是目前人們主要利用大白菜的自交不親和性和自交系內(nèi)的遲配性來(lái)生產(chǎn)一代雜交種[2]。該方法制種可以獲得正反交兩個(gè)方面的一代雜交種子，產(chǎn)量高，是不育系制種法種子產(chǎn)量的1.3倍以上，同時(shí)純度也可保持在95%以上。根據(jù)以上分析，我們認(rèn)為綜合利用大白菜Pol CMS雄性不育系、自交不親合系、自交系（系內(nèi)遲配性）選擇適宜的親本類型生產(chǎn)一代雜交種將是未來(lái)大白菜制種的發(fā)展方向。

3.2 大白菜Pol CMS雄性不育機(jī)理

隨著人們對(duì)大白菜、油菜、蘿卜等十字花科蔬菜線粒體、葉綠體基因組測(cè)序的完成[13-15]，對(duì)各種雄性不育機(jī)理的研究也不斷深入。到目前為止，人們對(duì)Pol CMS雄性不育機(jī)理研究結(jié)果主要有：（1）Pol CMS細(xì)胞質(zhì)雄性不育直接與線粒體基因組（mtDNA）的差異、重排及其表達(dá)產(chǎn)物相關(guān)聯(lián)，而與葉綠體基因組無(wú)關(guān)。mtDNA重排會(huì)導(dǎo)致新的嵌合基因產(chǎn)生或下游基因的表達(dá)模式和功能的改變，從而導(dǎo)致不育[16，17]。（2）Pol CMS雄性不育與線粒體中orf224/apt6轉(zhuǎn)錄結(jié)果有關(guān)。orf224/apt6有不同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄受恢復(fù)基因的影響[1， 18]。（3）蛋白質(zhì)水平的作用與Pol CMS雄性不育有關(guān)，其中有能量蛋白假說(shuō)和毒性蛋白假說(shuō)[1，19]。上述研究結(jié)果僅能解釋部分現(xiàn)象，要全面揭示Pol CMS不育機(jī)理還有更多的工作要做。比如，Pol CMS線粒體基因組全基因功能的研究及其與雄性不育性狀的關(guān)聯(lián)作用，Pol CMS線粒體基因突變及其基因工程技術(shù)研究等。

在本研究中，從大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A中克隆得到的Braraorf224與甘藍(lán)型油菜的雄性不育基因Bran22的氨基酸序列一致性為100%，說(shuō)明大白菜Pol CMS雄性不育可能是由Braraorf224引起的。92-09A與早28雜交，獲得的F1代雜交株是可育的，說(shuō)明早28中攜帶有Pol CMS雄性不育的恢復(fù)基因。我們對(duì)恢復(fù)基因BraraPPR進(jìn)行了克隆，并對(duì)其表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明，BraraPPR在恢復(fù)系早28及恢復(fù)系與雄性不育系雜交種F1中的表達(dá)量明顯高于雄性不育系92-09A，說(shuō)明大白菜Pol CMS雄性不育育性的恢復(fù)可能與BraraPPR有關(guān)，其分子機(jī)理仍需進(jìn)一步深入研究。

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