小型豬慢性心肌缺血模型的建立與無(wú)創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)的應(yīng)用

陳民利，潘永明，陳 亮，徐孝平，王德軍，楊玉偉，陳方明，蔡月琴，徐劍欽，朱科燕

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053)

專(zhuān)題研究

小型豬慢性心肌缺血模型的建立與無(wú)創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)的應(yīng)用

陳民利，潘永明，陳 亮，徐孝平，王德軍，楊玉偉，陳方明，蔡月琴，徐劍欽，朱科燕

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所，杭州 310053)

為建立小型豬慢性心肌缺血模型和應(yīng)用無(wú)創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)的評(píng)價(jià)方法，本研究采用維生素D3和異丙腎上腺素復(fù)合高脂飲食的方法建立了小型豬慢性心肌缺血模型；并利用無(wú)創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)對(duì)小型豬慢性心肌缺血模型的癥狀進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)價(jià)，同時(shí)對(duì)五指山小型豬、巴馬小型豬和西藏小型豬的運(yùn)輸應(yīng)激和高脂誘導(dǎo)發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的危險(xiǎn)因素進(jìn)行評(píng)估。建立了巴馬小型豬慢性心肌缺血模型與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范，明確了無(wú)創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)可用于心肌缺血模型的癥狀檢測(cè)和評(píng)價(jià)，界定了小型豬運(yùn)輸應(yīng)激后需4周以上的適應(yīng)恢復(fù)期。并發(fā)現(xiàn)了高脂環(huán)境下五指山小型豬、巴馬小型豬和西藏小型豬發(fā)生高血脂、高血壓、高胰島素血癥等AS危險(xiǎn)因素的不同特征，這為小型豬在心血管疾病研究中的選擇和應(yīng)用提供參考。

小型豬；慢性心肌缺血；無(wú)創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)；動(dòng)脈粥樣硬化；心率變異性；適應(yīng)恢復(fù)期

1 研究背景

心血管疾病是嚴(yán)重危害人民健康的常見(jiàn)病、多發(fā)病之一。冠狀動(dòng)脈性心臟病又稱(chēng)缺血性心臟病，簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病，是一種嚴(yán)重的心血管系統(tǒng)疾病，已成為死亡的主要原因之一。隨著我國(guó)的改革開(kāi)放，經(jīng)濟(jì)迅猛發(fā)展，人們的生活水平、方式、節(jié)奏、社會(huì)和心理壓力都發(fā)生了改變，缺血性心臟病的發(fā)病率與病死率逐年增加，危險(xiǎn)因素水平仍在不斷增高，主要表現(xiàn)在人口老齡化加劇、人群血清總膽固醇水平增高、高血壓患病率在增加、吸煙仍很普遍，預(yù)示了我國(guó)人群冠心病發(fā)病危險(xiǎn)的巨大的“冰山底座”[1]。因此，對(duì)缺血性心臟病的治療一直是人們所關(guān)注的熱點(diǎn)之一。特別是冠心病心絞痛的發(fā)病機(jī)制受到世人的矚目，找出對(duì)缺血性心臟病行之有效的防治手段己是需要迫切解決的問(wèn)題。

1.1 心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ偷慕⑹茄芯吭摷膊〔±頇C(jī)制和治療藥物療效評(píng)價(jià)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

幾十年來(lái)，藥理學(xué)工作者在探索心肌缺血損傷機(jī)理及研究藥理作用的同時(shí)，建立了不同水平的動(dòng)物模型，如在體、離體及細(xì)胞水平心肌缺血模型。在體動(dòng)物心肌缺血模型有藥物造模和手術(shù)造模兩大類(lèi)[2-4]，但目前建立的心肌缺血模型多為冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法、藥物注射方法等，均是借助物理、化學(xué)方法使血管急性阻塞造成心肌急性缺血，與心肌缺血臨床發(fā)病機(jī)制有很大差異。并存在選擇模型局限、單一及不盡完善等問(wèn)題，如存在方法學(xué)問(wèn)題、動(dòng)物種屬問(wèn)題、干擾因素問(wèn)題、模型的穩(wěn)定性和可靠性問(wèn)題，模型的評(píng)價(jià)和觀察指標(biāo)的檢測(cè)問(wèn)題。如現(xiàn)有的手術(shù)造模大多需要復(fù)雜的開(kāi)胸手術(shù)，對(duì)動(dòng)物損傷大，制備心肌缺血模型的方法有些為慢性機(jī)械壓迫冠狀動(dòng)脈方法，也需要復(fù)雜的開(kāi)胸手術(shù)，對(duì)動(dòng)物亦有一定的影響，干擾生理和病理功能。其中采用較多的是在豬冠狀動(dòng)脈左旋支或降支上采用Ameriod縮窄環(huán)進(jìn)行縮窄冠狀動(dòng)脈造成心肌缺血，但該技術(shù)方法與慢性心肌缺血模型形成的病理機(jī)制不是很理想[5]，其縮窄環(huán)不可逆轉(zhuǎn)，對(duì)新藥研究評(píng)價(jià)中藥物有效性評(píng)價(jià)帶來(lái)一定的差異，因此，迫切尋找一種理想的與臨床疾病發(fā)生符合程度高的動(dòng)物模型[6]。本項(xiàng)目利用豬在心血管形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和AS易感性方面與人類(lèi)最為接近的特點(diǎn)[7]，結(jié)合心肌缺血模型的藥物注射方法，用高脂飲食的方法，造成豬慢性心肌缺血，并用異丙腎上腺素注射加強(qiáng)心肌缺血的敏感性，可模擬臨床上突發(fā)性冠心病的誘發(fā)，建立與臨床發(fā)生相似、穩(wěn)定性和重復(fù)性好的小型豬慢性心肌缺血模型。

1.2 疾病動(dòng)物模型病理癥狀的檢測(cè)手段和評(píng)價(jià)技術(shù)是模型得到應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)。

動(dòng)物心肌缺血模型的檢測(cè)手段大多為心電圖、心功能、生化檢測(cè)、心肌組織病理檢查，主要用于急性實(shí)驗(yàn)研究，其檢測(cè)手段極為局限，且必須在麻醉、束縛下進(jìn)行，只能短時(shí)間檢測(cè)，既受麻醉、操作和手術(shù)的影響，又受時(shí)間的局限性，而心肌組織病理檢查在動(dòng)物處死后進(jìn)行，動(dòng)物不能存活使藥物治療的觀察受到限制，無(wú)法進(jìn)一步觀察疾病癥狀的發(fā)展過(guò)程，使用量大、動(dòng)物個(gè)體差異大、實(shí)驗(yàn)的可靠性低。因此迫切需要尋找能在清醒狀態(tài)下的有效的檢測(cè)手段。動(dòng)態(tài)心電圖檢測(cè)和心率變異性分析(HRV)是臨床心血管領(lǐng)域中非創(chuàng)傷性檢查的重要診斷手段之一，HRV為評(píng)估心臟自主神經(jīng)活動(dòng)的客觀指標(biāo)，可評(píng)價(jià)和預(yù)測(cè)冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變范圍和嚴(yán)重程度及冠脈痙攣嚴(yán)重性[8]。根據(jù)臨床進(jìn)行動(dòng)態(tài)心電圖檢測(cè)和心率變異性分析的診斷手段，國(guó)際上廣泛應(yīng)用利用遙測(cè)技術(shù)進(jìn)行動(dòng)物在清醒狀態(tài)下的檢測(cè)，以減少對(duì)動(dòng)物的反復(fù)麻醉、捆綁、導(dǎo)線連接等操作，減少由于實(shí)驗(yàn)操作而引起血壓、心率和體溫等生理參數(shù)的變化，保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性[9-11]；使用遙測(cè)技術(shù)可連續(xù)記錄動(dòng)物的生理信號(hào)，觀察藥物的起效和毒性發(fā)生的時(shí)間，確保動(dòng)物的生理病理機(jī)制和藥物評(píng)價(jià)結(jié)果；同時(shí)，不用處死動(dòng)物，避免了動(dòng)物福利受損問(wèn)題，達(dá)到“減少、代替、優(yōu)化”的“3R”原則；QT延長(zhǎng)對(duì)心肌缺血疾病中具有重要的病理意義，是預(yù)測(cè)心肌缺血的重要指標(biāo)，使用遙測(cè)技術(shù)可在動(dòng)物清醒狀態(tài)下連續(xù)監(jiān)測(cè)分析QT的變化，可有效評(píng)價(jià)藥物對(duì)心肌缺血疾病的有效性[12，13]。本項(xiàng)目利用無(wú)創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行清醒狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)心電圖檢測(cè)和心率變異性分析，并以血清酶、心肌代謝和血液流變等血液生化指標(biāo)進(jìn)行輔助評(píng)價(jià)，建立豬慢性心肌缺血模型的動(dòng)態(tài)檢測(cè)和評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范。

2 研究目的

針對(duì)以往豬慢性心肌缺血模型制作的不足，本研究首先以高脂血癥導(dǎo)致AS、引起冠狀動(dòng)脈梗阻或狹窄的機(jī)理，采用高脂飲食的方法，造成豬慢性心肌缺血，并用異丙腎上腺素注射加強(qiáng)心肌缺血的敏感性，模擬臨床上突發(fā)性冠心病的誘發(fā)，建立小型豬慢性心肌缺血模型。該研究模型避免了手術(shù)損傷，與臨床發(fā)生相似，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，影響因素少，比較適合于冠心病的防治研究和新藥藥效學(xué)的評(píng)價(jià)研究。同時(shí)應(yīng)用無(wú)創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)進(jìn)行心肌缺血模型的癥狀檢測(cè)和評(píng)價(jià)，在清醒狀態(tài)下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)的動(dòng)態(tài)心電圖檢測(cè)和心率變異性分析，在一定程度上能反映出模型動(dòng)物病理改變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，并結(jié)合心肌酶、血脂、自由基、心肌能量代謝、血液凝聚性及電解質(zhì)指標(biāo)等血液生化指標(biāo)進(jìn)行輔助評(píng)價(jià)研究，為小型豬慢性心肌缺血模型的評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范的建立提供依據(jù)。

考慮到國(guó)內(nèi)一些小型豬在心血管疾病應(yīng)用中可能存在特殊性，本研究有目的地選擇了五指山小型豬、巴馬小型豬、西藏小型豬，探討了這3種小型豬發(fā)生高血脂、高血壓、高胰島素血癥等AS危險(xiǎn)因素的不同特征。并利用無(wú)創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)結(jié)合血液生化指標(biāo)評(píng)估這3種小型豬的運(yùn)輸應(yīng)激反應(yīng)情況，界定小型豬的運(yùn)輸應(yīng)激后的適應(yīng)恢復(fù)期，為小型豬在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的實(shí)際應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

3 創(chuàng)新點(diǎn)

以維生素D3和異丙腎上腺素復(fù)合高脂飲食誘導(dǎo)，率先建立了非外科手術(shù)方式的巴馬小型豬慢性心肌缺血模型，并建立了小型豬慢性心肌缺血模型的評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范，確定了無(wú)創(chuàng)遙測(cè)技術(shù)可用于心肌缺血模型的癥狀檢測(cè)和評(píng)價(jià)，而心肌酶、心肌能量代謝及電解質(zhì)等血液生化指標(biāo)可作為輔助評(píng)價(jià)手段。同時(shí)，界定出了小型豬在運(yùn)輸應(yīng)激后應(yīng)至少維持4周以上的適應(yīng)恢復(fù)期，并發(fā)現(xiàn)了五指山小型豬、巴馬小型豬、西藏小型豬的AS模型特點(diǎn)及其發(fā)生AS危險(xiǎn)因素的不同特征。

4 討論

本項(xiàng)目建立的小型豬慢性心肌缺血模型，既模擬了人類(lèi)在高脂環(huán)境下AS的形成過(guò)程，符合人類(lèi)慢性心肌缺血的過(guò)程，具有血液粘滯、脂質(zhì)代謝、心肌酶代謝異常和AS的特點(diǎn)，又模擬了臨床上應(yīng)激引起的突發(fā)性冠心病事件，其病癥、病程特點(diǎn)與人類(lèi)發(fā)生AS和冠心病突發(fā)事件引起缺血性心肌病類(lèi)似，且避免了手術(shù)造模的損傷，模型穩(wěn)定性和重復(fù)性好，影響因素少，是比較理想的、適合于冠心病的防治研究和新藥藥效學(xué)的評(píng)價(jià)研究的小型豬慢性心肌缺血模型。

本項(xiàng)目結(jié)合無(wú)創(chuàng)生理遙測(cè)技術(shù)和HRV分析手段，以血清酶、心肌代謝和血液流變等為輔助評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立了豬慢性心肌缺血模型的動(dòng)態(tài)檢測(cè)和評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范。利用遙測(cè)技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)多種指標(biāo)的優(yōu)勢(shì)，可減少了不同試驗(yàn)次數(shù)，并可使各項(xiàng)指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性增強(qiáng)。該模型可進(jìn)行較長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)動(dòng)態(tài)觀察的特點(diǎn)，使得試驗(yàn)結(jié)果更完整，并具有系統(tǒng)性。在一定程度上能反映出模型動(dòng)物病理改變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，反映出藥物治療的作用環(huán)節(jié)和作用特點(diǎn)。

本項(xiàng)目還對(duì)五指山小型豬、巴馬小型豬和西藏小型豬的運(yùn)輸應(yīng)激進(jìn)行了評(píng)估，界定出了小型豬在運(yùn)輸應(yīng)激后應(yīng)至少維持4周以上的適應(yīng)恢復(fù)期，為小型豬的實(shí)際應(yīng)用和動(dòng)物福利評(píng)估提供參考和技術(shù)方法。并探討了五指山小型豬、巴馬小型豬、西藏小型豬的發(fā)生AS的危險(xiǎn)因素的不同特征，為這3種小型豬在心血管疾病研究中的選擇和應(yīng)用提供了參考，也為我國(guó)各品種小型豬在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了研究思路和技術(shù)方法。

[1] 張海澄, 郭繼鴻.冠心病流行病學(xué)與一級(jí)預(yù)防[J]. 中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志, 2002, 22 (8):449-451.

[2] Hoffmann U, Millea R, Enzweiler C,etal. Acute myocardial infarction: Contrast enhanced multi-detector row CT in a porcine model [J]. Radiology, 2004, 231 (3): 697-701.

[3] 呂雄文,陳衛(wèi)東,金涌,等.卡托普利和低劑量阿司匹林相互作用對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血及肝微粒體酶活性的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2004, 20 (1): 104-109.

[4] 季曉平,張運(yùn),葛志明,等.慢性心肌冬眠動(dòng)物模型的建立[J].山東醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 39 (6):517-519.

[5] Radke PW, Heinlgreen A, Frass OM,etal. Evaluation of the Porcine Ameroid Constrictor Model of Chronic Myocardial Ischemia for Therapeutic Angiogenesis Studies[J]. Endothelium, 2006, 13(1):25-33.

[6] 祝曙光, 熊利華, 謝鴻發(fā),等.小型豬慢性缺血性心臟病模型的建立[J]. 中國(guó)臨床康復(fù), 2006,10(20):46-48.

[7] Spetzger U, Reul J, Weis J,etal. Microsurgically produced bifurcation aneurysms in a rabbit model for endovascular coil embolization[J]. J Neurosurg, 1996, 85(3):488-495.

[8] 許宜冠，周勝華，沈向前，等．冠心病患者冠狀動(dòng)脈病變與心率變異性的關(guān)系[J]．臨床心電學(xué)雜志，2005,14(2):92-95．

[9] Chiueh CC, Kopin IJ. Hyperresponsivity of spontaneously hypertensive rat to indirect measurement of blood pressure [J]. Am J Physiol, 1978, 234(6):690-695.[10] Clement JG, Mills P. Brockway B. Use of telemetry to record body temperature and activity in mice [J]. J Pharm Meth, 1989, 21(2):129-140.

[11] Livezey GT, Miller JM, Vogel WH. Plasma norepinephrine, epinephrine·and corticosterone stress responses to restraint in individual male and female rats and their correlations [J]. Neurosci Lett, 1985, 62(1):51-56.

[12] Yang HT, Ogilvie RW, Terjung RL. Exercise training enhances basic fibroblast growth factor-induced collateral blood flow [J]. Am J Physiol, 1998, 274(6 Pt 2):2053-2061.

[13] Dan M. Roden, 李輝. 藥物導(dǎo)致的QT間期延長(zhǎng)[J].中國(guó)心血管雜志, 2008,13(1):74-75.

Establishment of chronic myocardial ischemia model in minipigs and application of noninvasive telemetry technique

CHEN Min-li, PAN Yong-ming, CHEN Liang, XU Xiao-ping, WANG De-jun, YANG Yu-wei, CHEN Fang-ming, CAI Yue-qin, XU Jian-qin, ZHU Ke-yan

(Laboratory Animal Research Center/ Comparative Medical Research Institute, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

In order to establish the minipig model of chronic myocardial ischemia and apply non-invasive telemetry technique, the minipig model of chronic myocardial ischemia was made induced by Vitamin D3, isoproterenol and combined with high fat diet, and the non-invasive telemetry technique was used to detect and evaluate the symptoms of minipig model of chronic myocardial ischemia. Moreover, the effects of transport stress and the risk factors of atherosclerosis (AS) induced by high fat diet among Wuzhishan minipigs, Bama minipigs and Tibetan minipigs were also evaluated. Our study has successful established the Bama minipig model of chronic myocardial ischemia and the technical specification for evaluation,. The non-invasive telemetry technique can be used to detect and evaluate the symptoms of chronic myocardial ischemia model, and defines minipigs at least need to keep for more than 4 weeks after transport stress to adaptive recovery period. In addition, the different characteristics of AS risk factors such as hyperlipidemia, hypertension and hyperinsulinemia were observed in Wuzhishan minipigs, Bama minipigs and Tibetan minipigs in high fat environment, and this provides a reference for the selection and application of minipigs in the research of cardiovascular diseases.

Minipig; Chronic myocardial ischemia; Non-invasive telemetry technique; Atherosclerosis; Heart rate variability; Adaptive recovery period

省部共建科研基金(WKJ2009-2-032)；浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(XTD201301)。

陳民利(1963-)，女，教授，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: cmli991@aliyun.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0016-03

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.006

2016-11-14