紫杉醇對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠CD28、CTLA-4表達(dá)及BAFF的影響

張淑江，李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

研究報(bào)告

紫杉醇對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠CD28、CTLA-4表達(dá)及BAFF的影響

張淑江，李作孝*

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 瀘州 646000)

目的 探討紫杉醇對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmunencephalomyelitis，EAE)大鼠腦組織中CD28、CTLA-4表達(dá)及脾組織上清液中B細(xì)胞刺激因子(BAFF)含量及其意義。方法 按隨機(jī)數(shù)字法將50只Wistar大鼠分為5組：紫杉醇(PTX)小、中、大3個(gè)劑量組(PTX劑量分別為1 mg/kg，2 mg/kg，4 mg/kg)、正常對(duì)照組，EAE對(duì)照組,每組10只。用豚鼠脊髓制成GPSCH并與CFA等體積混合制成免疫抗原，注入大鼠雙足側(cè)足墊(2 mL/kg)進(jìn)行EAE造模，自造模后，PTX各劑量組腹腔注射紫杉醇，連續(xù)10 d。正常對(duì)照組及EAE對(duì)照組均給予腹腔注射0.9%NaCl 2 mL。采用腦組織學(xué)評(píng)分評(píng)估實(shí)驗(yàn)大鼠腦組織炎癥浸潤(rùn)情況，取大鼠腦組織采用流式細(xì)胞儀測(cè)定腦組織CD28、CTLA-4含量，取脾組織并制成上清液，采用ELISA測(cè)定脾組織中BAFF含量。結(jié)果 PTX各劑量組腦組織評(píng)分均低于EAE對(duì)照組，各組間差異有顯著性(P< 0.01)；PTX各劑量組大鼠腦組織中CD28表達(dá)均低于EAE對(duì)照組，各組間差異有顯著性(P< 0.01)；CTLA-4表達(dá)均高于EAE對(duì)照組，各組間差異有顯著性(P< 0.01)；脾組織上清液中BAFF含量均低于EAE對(duì)照組，各組間差異有顯著性(P< 0.01)。結(jié)論 PTX可降低EAE大鼠神經(jīng)功能障礙評(píng)分，其機(jī)制可能涉及調(diào)節(jié)大鼠腦組織中CD28、CTLA-4的表達(dá)及脾組織上清液中BAFF含量，從而發(fā)揮對(duì)EAE的防治作用。

紫杉醇；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；CD28；CTLA-4；B細(xì)胞刺激因子

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎是多發(fā)性硬化(multipie sclerosis，MS)的理想動(dòng)物模型，臨床上使用的藥物對(duì)MS都療效欠佳，且不能發(fā)揮防治作用，故探討新的治療藥物顯得尤其必要，紫杉醇(Paclitaxel，PTX)在臨床上用于各種惡性腫瘤的化療，且價(jià)格低廉。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞含量及相關(guān)細(xì)胞因子含量有關(guān)，而MS屬于自身免疫性疾病，免疫系統(tǒng)功能的紊亂在此病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]，國(guó)外已有數(shù)位學(xué)者將PTX用于EAE大鼠的研究。比如Frequin等[2]研究發(fā)現(xiàn)PTX通過其抗炎及免疫調(diào)節(jié)功能對(duì)EAE大鼠發(fā)揮著防治作用，其可降低EAE大鼠的發(fā)病率，延長(zhǎng)EAE大鼠發(fā)病的潛伏期，縮短EAE大鼠疾病的進(jìn)展期，改善EAE大鼠臨床癥狀，降低神經(jīng)功能障礙評(píng)分。本試驗(yàn)采用wistar大鼠建立EAE模型，應(yīng)用不同劑量的PTX進(jìn)行干預(yù)，觀察PTX對(duì)大鼠發(fā)病情況腦組織病理改變的影響，并測(cè)定腦組織中CD28、CTLA-4表達(dá)水平及脾組織上清液中B細(xì)胞刺激因子含量(B lymphocyte stimulator, BAFF)，從而探討其對(duì)EAE及MS的防治作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性Wistar大鼠50只,6周齡，體重(210～230) g，成年8周齡雌性豚鼠5只，體重(350～400)g,所有動(dòng)物均為清潔級(jí)，均購(gòu)自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(川)2013-026]，實(shí)驗(yàn)均在西南醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室完成[SYXK(川)2013-185]。將Wistar大鼠及豚鼠分開飼養(yǎng)(普通環(huán)境)，保持飼養(yǎng)條件恒溫、恒濕，定時(shí)定量給予飼料、水，并定期更換墊料，保持生存環(huán)境清潔，1周后觀察大鼠及豚鼠活動(dòng)情況，死亡及活動(dòng)度差的大鼠予以剔除，并及時(shí)補(bǔ)足同等數(shù)量大鼠及豚鼠。

1.2 主要試劑和藥物

紫杉醇注射液(哈藥集團(tuán)生物工程有限公司，5 mL/支),CFA(美國(guó)Chondrex公司);BCG凍干粉：每支60 mg (上海生物制品研究所),PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD28和CD152抗體及相應(yīng)熒光素標(biāo)記的小鼠IgG1抗體(美國(guó)Caltag實(shí)驗(yàn)室), BAFF酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，PBS緩沖液(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)；淋巴細(xì)胞分離液，稱量瓶、顯微鏡、一次性流式管、顯微鏡、流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton-Dickinson公司)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抗原制作及動(dòng)物模型建立

參照Hoehlig K等[3]制作EAE模型的方法進(jìn)行造模，用豚鼠脊髓制成GPSCH并與CFA等體積混合制成免疫抗原，注入大鼠雙足側(cè)足墊(2 mL/kg)進(jìn)行EAE造模；正常對(duì)照組大鼠于相同部位注射等量CFA，所有動(dòng)物均在同等條件下飼養(yǎng)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組及干預(yù)處理

將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組：PTX小、中、大劑量組,正常對(duì)照組,EAE對(duì)照組,PTX小、中、大劑量組腹腔注射PTX劑量分別為1 mg/kg，2 mg/kg，4 mg/kg，連續(xù)10 d。正常對(duì)照組及EAE對(duì)照組均給予腹腔注射0.9% NS 2 mL，所有動(dòng)物均在同等條件下飼養(yǎng)，均在1月后抽取血清，處死并取腦組織。

1.3.3 腦組織學(xué)評(píng)分

腦組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[4]：0分，無(wú)炎癥改變；1分，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞限于血管周和腦脊膜周圍；2分，炎性細(xì)胞腦實(shí)質(zhì)內(nèi)輕度浸潤(rùn)，1～20個(gè)/片；3分，炎性細(xì)胞腦實(shí)質(zhì)內(nèi)中等程度浸潤(rùn)，21～100個(gè)/片；4分，腦實(shí)質(zhì)內(nèi)浸潤(rùn)的炎細(xì)胞達(dá)100個(gè)/片以上。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)后取均值，每只大鼠取2張切片作計(jì)數(shù)，將2張切片計(jì)數(shù)后的平均值作為該只大鼠的評(píng)分結(jié)果。

1.3.4 腦組織CD28、CTLA-4測(cè)定

用PBS緩沖液去除大鼠的延髓組織血跡，使用研磨器將延髓組織制成勻漿，以3000 r/min離心15 min后取上清液，采用流式細(xì)胞儀測(cè)定腦組織CD28、CTLA-4含量。

1.3.5 脾組織上清液BAFF含量測(cè)定

無(wú)菌取出脾臟后，剪碎脾組織，并用玻璃注射器針芯進(jìn)行研磨，后用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行沖洗，經(jīng)銅網(wǎng)進(jìn)行過濾以除去結(jié)締組織被膜，然后將脾細(xì)胞懸液收集于無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，取與脾細(xì)胞懸液等體積的淋巴細(xì)胞分離液加入至離心管，將脾細(xì)胞懸液慢加入至淋巴細(xì)胞分離液上；室溫300 g離心20 min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)入至新的離心管中，加入緩沖液，300 g離心10 min，棄上清后，再洗滌一次；棄上清，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞率大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。采用ELISA法測(cè)定BAFF含量,具體操作步驟按試劑盒說明操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 模型大鼠的表現(xiàn)及相關(guān)評(píng)分

EAE大鼠造模成功表現(xiàn)：早期表現(xiàn)為活動(dòng)及進(jìn)食量減少、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、體重下降，后期出現(xiàn)抬尾無(wú)力、后肢無(wú)力，嚴(yán)重者表現(xiàn)為尾巴及四肢癱瘓拖地，后肢雙足跖面向上，抬頭無(wú)力。

EAE對(duì)照組評(píng)分最高，PTX各劑量組評(píng)分均較EAE對(duì)照組評(píng)分下降，差異有顯著性(P < 0.05)，且EAE大鼠腦組織病理學(xué)評(píng)分隨PTX劑量增加而依次降低，各劑量組間差異有顯著性(P < 0.05)。(見表1)

2.2 腦組織中CD28、CTLA-4含量變化

EAE對(duì)照組CD28含量較正常對(duì)照組高，CTLA-4含量較正常對(duì)照組低，差異有顯著性(P < 0.01)，PTX各劑量組腦組織CD28含量皆較EAE對(duì)照組降低，差異有顯著性(P < 0.01)；腦組織CD28含量隨PTX劑量增加而明顯降低，各組間差異有顯著性(P < 0.01)。PTX各劑量組腦組織CTLA-4含量均較EAE對(duì)照組升高，差異有顯著性(P < 0.01)；腦組織CTLA-4含量隨PTX劑量增加而明顯增加，PTX大、小劑量組差異有顯著性(P< 0.01)，PTX大與中劑量組、中與小劑量組差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。(見表2)

Tab.1 The scores of pathological chages in the brain of all the groups

組別Groups腦組織學(xué)評(píng)分Braintissuescore正常對(duì)照組Normalgroup0EAE對(duì)照組Modelgroup2.67±0.52PTX小劑量組Smalldosegroup1.61±0.24aPTX中劑量組Middledosegroup1.44±0.22abPTX大劑量組Highdosegroup1.23±0.31abc

注：與EAE對(duì)照組相比，aP< 0.05；與PTX小劑量組相比，bP< 0.05；與PTX中劑量組相比，cP< 0.05。

Note.The doses of small,middle,high group were 1 mg/kg,2 mg/kg,4 mg/kg;Compared with model group,aP< 0.05;compared with small dose group,bP< 0.05;compared with middle dose group,cP< 0.05.

Tab.2 The levels of CD28 and CTLA-4 in the brain of all the groups

組別GroupsCD28CTLA-4正常對(duì)照組Normalgroup15.3±3.779.7±2.16EAE對(duì)照組Modelgroup41.2±4.09a3.6±1.32aPTX小劑量組Smalldosegroup33.9±4.49ab4.3±1.42abPTX中劑量組Middledosegroup26.4±4.14abc5.8±1.81abPTX大劑量組Highdosegroup20.7±4.21abcd6.4±1.68abc

注：與正常對(duì)照組相比，aP< 0.01；與EAE對(duì)照組相比，b1P< 0.05、b2P< 0.01；與PTX小劑量組相比，cP< 0.01；與PTX中劑量組相比，dP< 0.01。

Note. Compared with normal group,aP< 0.01;compared with model group,b1P< 0.05、b2P< 0.01;compared with small dose group,cP< 0.01;compared with middle dose group,dP< 0.01.

2.3 各實(shí)驗(yàn)組大鼠脾組織上清液BAFF含量測(cè)定結(jié)果

與正常對(duì)照組相比，EAE對(duì)照組及PTX各劑量組脾組織上清液中BAFF含量均增加(P< 0.01)。與EAE對(duì)照組比較，PTX各劑量組脾組織上清液中BAFF含量均減少(P< 0.01或P< 0.05)。隨著PTX劑量的增加，BAFF含量依次減少，各組間差異有顯著性(P< 0.01)。(見表3)

Tab.3ThelevelsofBAFFinthesplenictissuefluidofallthegroups

組別GroupsBAFF/pg/mL正常對(duì)照組Normalgroup50.2±6.42EAE對(duì)照組Modelgroup110.3±10.29aPTX小劑量組Smalldosegroup101.5±6.49ab1PTX中劑量組Middledosegroup87.1±7.88ab2cPTX大劑量組Highdosegroup62.7±6.11ab2cd

注：與正常對(duì)照組相比，aP< 0.01；與EAE對(duì)照組相比，b1P< 0.05、b2P< 0.01；與PTX小劑量組相比，cP< 0.01；與PTX中劑量組相比，dP< 0.01。

Note.Compared with normal group,aP< 0.01;compared with model group,b1P< 0.05、b2P< 0.01;compared with small dose group,cP< 0.01;compared with middle dose group,dP< 0.01.

3 討論

CD28或CTLA-4/B7協(xié)同刺激分子在EAE中起重要的作用。CD28及CTLA-4(又稱CDl52)均是參與T細(xì)胞識(shí)別抗原與活化的重要CD分子，CD28與CTLA-4在T細(xì)胞上表達(dá)的多少與免疫反應(yīng)密切相關(guān)。研究已證實(shí)，給予EAE大鼠CD28抗體治療可以特異性地阻斷Th介導(dǎo)的B細(xì)胞分泌免疫球蛋白(Ig)過程[5,6]，特別是EAE大鼠發(fā)病開始時(shí)，從而阻斷疾病的進(jìn)展。CTLA-4可產(chǎn)生負(fù)向調(diào)節(jié)信號(hào)和抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程，涉及的主要機(jī)制為抑制TCR和CD28介導(dǎo)IL-2產(chǎn)生[7]，導(dǎo)致免疫反應(yīng)的終止。CTLA-4與CD28具有相反的免疫作用，給予抗CTLA-4抗體可加重EAE大鼠發(fā)病癥狀或?qū)е缕鋸?fù)發(fā)[8]。CTLA-4還可阻止緩解復(fù)發(fā)型的EAE的進(jìn)程。以上研究均表明CD28或CTLA-4/B7協(xié)同刺激分子在EAE中發(fā)揮重要的作用。

BAFF是1998年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子家族的新成員，主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞合成、中性粒細(xì)胞產(chǎn)生。已有研究證實(shí)，在有些MS病人T細(xì)胞或者單核細(xì)胞分泌的BAFF含量增加[8]。對(duì)BAFF受體缺乏的大鼠及未缺乏大鼠同時(shí)給予抗原建立EAE模型，BAFF受體缺乏的大鼠臨床癥狀提前，且較未缺乏的大鼠臨床癥狀重、神經(jīng)功能障礙評(píng)分更高，發(fā)病潛伏期較對(duì)照組短，腦脊髓的炎癥范圍更大，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)BAFF含量較對(duì)照組增加，中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞更多，而外周的促炎性細(xì)胞因子的數(shù)量增多。在狨猴的EAE模型實(shí)驗(yàn)中，不管是在造模前還是造模后使用抗BAFF的抗體均有助于減少外周血、脾組織淋巴器官中CD20+B細(xì)胞數(shù)量、抑制Ig的產(chǎn)生,還能抑制T細(xì)胞活化，減少CD4+T細(xì)胞數(shù)量。在造模前使用抗BAFF的抗體能顯著降低EAE的發(fā)病率。使用抗BAFF抗體的狨猴癥狀出現(xiàn)時(shí)間較未使用抗BAFF抗體的EAE對(duì)照組遲，神經(jīng)功能障礙評(píng)分、脊髓炎癥浸潤(rùn)程度及髓鞘脫失程度較對(duì)照組低，進(jìn)展較對(duì)照組慢。使用抗BAFF的抗體的狨猴外周血單個(gè)核細(xì)胞、脾組織及外周淋巴結(jié)IL-17含量較對(duì)照組低，而IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-6含量減少，TGF-β含量增加，對(duì)EAE狨猴繼續(xù)使用抗BAFF的抗體還能使已經(jīng)出現(xiàn)的癥狀具有改善作用[9,10]。

PTX因其良好的抗腫瘤作用廣泛應(yīng)用于臨床，新近的研究表明，PTX除了具有抗腫瘤作用外還具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用，新近的研究表明PTX能調(diào)節(jié)腫瘤宿主體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells，Treg)的數(shù)量，具有免疫調(diào)節(jié)作用。在PTX治療乳腺癌的研究中就發(fā)現(xiàn)，PTX能下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞間粘附分子-1的表達(dá)，而ICAM-1具有保護(hù)血腦屏障受損、減少巨噬細(xì)胞進(jìn)入血腦屏障的作用[11,12]，其還能刺激T淋巴細(xì)胞活化的能力、使IL-2、INF-等細(xì)胞因子分泌減少，而IL-2、INF-已被證實(shí)，是具有加重EAE病情的細(xì)胞因子[13]。PTX還可使CD3+T細(xì)胞的殺傷活性降低，發(fā)揮其免疫抑制作用。

因此我們認(rèn)為PTX可能通過誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡及抑制淋巴細(xì)胞分裂使免疫活性細(xì)胞處于高凋亡低增值狀態(tài)，從而抑制機(jī)體的免疫功能。以上研究證實(shí)，PTX具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用,而MS的主要發(fā)病機(jī)制就是免疫功能紊亂導(dǎo)致的，PTX通過其免疫調(diào)節(jié)作用可能對(duì)治療MS有效。基于以上假設(shè)，并查閱了相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，國(guó)外已有研究者將PTX用于EAE大鼠模型，發(fā)現(xiàn)PTX通過其抗炎及免疫調(diào)節(jié)功能對(duì)EAE大鼠發(fā)揮著防治作用，而且PTX還能抑制骨髓未成熟B細(xì)胞向外周淋巴器官遷移，減輕MS患者的炎癥反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦證實(shí)，PTX對(duì)CD28、CTLA-4、BAFF均具有調(diào)節(jié)作用，與EAE對(duì)照組比較，PTX各劑量組能降低腦組織內(nèi)CD28、脾組織上清液中BAFF含量，升高腦組織中CTLA-4含量，結(jié)合大鼠腦組織學(xué)評(píng)分結(jié)果，可推斷PTX可能對(duì)EAE具有防治作用。

但本實(shí)驗(yàn)仍具有不足之處，本實(shí)驗(yàn)研究在EAE大鼠疾病高峰期即處死發(fā)病大鼠測(cè)定以上細(xì)胞因子，故無(wú)法動(dòng)態(tài)觀察CD28、CTLA-4、BAFF等細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)改變；因經(jīng)費(fèi)原因只測(cè)定了CD28、CTLA-4、BAFF含量，未檢測(cè)更多免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子含量，未能很好的闡述紫杉醇對(duì)EAE大鼠免疫網(wǎng)絡(luò)的影響，且仍有實(shí)驗(yàn)涉及動(dòng)物數(shù)量較少等局限性存在，仍需后續(xù)的研究完善有關(guān)機(jī)制的闡述。

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The effects of paclitaxel on the levels of CD28,CTLA-4 and BAFF in experimental autoimmune encephalomyelitis

ZHANG Shu-jiang,LI Zuo-xiao*

(Department of Neurology,Affiliated Hospital of southwest Medical university,Luzhou 646000,China)

Objective To discuss the effects of Paclitaxel(PTX) on levels of CD28 and CTLA-4,B lymphocyte stimulator(BAFF) in experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE).Methods The 50 rats were divided into 5 groups by the random number table, 10 rats in each group,the doses of small group,Middle group, High group were 1 mg/kg，2 mg/kg，4 mg/kg by intraperitoneal injection for 10 consecutive days, the normal group and model group were injected 0.9% NS 2 mL,Using brain tissue score to estimate the neurological dysfunctions of rats.Using flow cytometry to detect the levels of CD28 and CTLA-4，using enzyme-linked immunosorbent (ELISA) to detect the levels of BAFF.Results The brain tissue score in PTX experimental groups were lower than model group,the comparative differences between groups were statistically significant(P< 0.01);The levels of CD28 in PTX groups were lower than EAE group，the comparative differences between groups were statistically significant(P< 0.01). The levels of CTLA-4 in PTX groups were higher than EAE group,the comparative differences between groups were statistically significant(P< 0.01);the content of BAFF in all PTX groups were lower than EAE control group.Conclusions PTX could decrease the brain tissue score,the mechanism may adjust the express of CD28、CTLA-4 in brain and the expression of BAFF.PTX may have preventive and therapeutic effects on EAE rats.

Paclitaxel;Exexperimental autoimmune encephalomyelitis;CD28;CTLA-4;B lymphocyte stimulator

瀘州市科技創(chuàng)新苗子項(xiàng)目(2016-R-70 20/24)；西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院院級(jí)課題。

張淑江(1989-)，女，醫(yī)師，碩士生，研究方向：神經(jīng)免疫。E-mail:939749262@qq.com

李作孝(1964-)，男，主任醫(yī)師，碩士生，研究方向：神經(jīng)免疫。E-mail:lzx3235@sina.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0071-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.016

2016-06-27