中國(guó)地鼠線粒體基因組與微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的研究

宋國(guó)華，陳朝陽(yáng)，劉田福，龐文彪，高繼萍，張銳虎，劉茂林，樊林花

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原030001)

專題研究

中國(guó)地鼠線粒體基因組與微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記的研究

宋國(guó)華，陳朝陽(yáng)，劉田福，龐文彪，高繼萍，張銳虎，劉茂林，樊林花

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原030001)

中國(guó)地鼠在生物醫(yī)學(xué)研究中占有重要的地位，但中國(guó)地鼠的分子遺傳標(biāo)記研究尚少。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)等方法分析了中國(guó)地鼠的線粒體基因組的堿基組成、基因組結(jié)構(gòu)、基因進(jìn)化等特征，為中國(guó)地鼠應(yīng)用于人類疾病動(dòng)物模型提供基因組數(shù)據(jù)。建立了中國(guó)地鼠近交系遺傳質(zhì)量控制體系，為中國(guó)地鼠種質(zhì)資源科學(xué)評(píng)估、合理開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

中國(guó)地鼠；線粒體基因組；分子進(jìn)化；微衛(wèi)星；遺傳檢測(cè)

1 研究背景

中國(guó)地鼠作為源于我國(guó)的特色實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源，在生命科學(xué)研究中占有重要地位。它的染色體大、數(shù)量少(2n=22)，易于辨認(rèn)，是研究染色體畸變的良好材料，也可進(jìn)行輻射遺傳、細(xì)胞遺傳等研究；它有一對(duì)易于翻出的頰囊，是微循環(huán)研究和腫瘤移植的理想部位；通過(guò)近親交配而具有的遺傳性糖尿病傾向，更是理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[1]。上世紀(jì)八十年代初，山西醫(yī)科大學(xué)薄家璐教授等從北京郊區(qū)捕捉野生地鼠，在國(guó)內(nèi)首次培育出中國(guó)地鼠近交群體[2]。

在生命科學(xué)研究中使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不但應(yīng)有嚴(yán)格的微生物控制，還應(yīng)有明確、穩(wěn)定的遺傳背景數(shù)據(jù)供研究者參考使用。在嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，有關(guān)大小鼠的各種生物學(xué)性狀和基因組學(xué)研究非常深入和廣泛，但中國(guó)地鼠的遺傳性狀、基因組等基礎(chǔ)資料報(bào)道很少。過(guò)去關(guān)于中國(guó)地鼠的研究主要集中在染色體核型、RAPD遺傳標(biāo)記、繁育等方面，其線粒體基因組、分子進(jìn)化、微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記尚屬空白[3]，這些工作的缺失，嚴(yán)重制約了近交系中國(guó)地鼠在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。提供可供參考使用的中國(guó)地鼠的基因組數(shù)據(jù)，建立可靠的遺傳質(zhì)量檢測(cè)方法，顯得非常迫切和必要。

線粒體基因組是核外遺傳系統(tǒng)，具有小型性、多態(tài)性和自主性等特點(diǎn)。目前研究表明許多疾病與線粒體基因組的蛋白編碼基因變異有關(guān)，已深入研究到生物的發(fā)育、衰老、腫瘤、代謝、疾病、遺傳以及進(jìn)化等領(lǐng)域[4,5]。中國(guó)地鼠在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有許多重要事件和它有密切關(guān)系，因此開(kāi)展其線粒體基因組結(jié)構(gòu)和功能的研究，對(duì)于深入了解中國(guó)地鼠發(fā)育過(guò)程中核內(nèi)基因與核外基因遺傳信息的相互作用、基因表達(dá)與調(diào)控的分子機(jī)理及其與母性遺傳性狀相關(guān)的遺傳研究具有重要意義[4，6]。對(duì)中國(guó)地鼠和其近緣種的線粒體DNA比較研究，將為中國(guó)地鼠的起源、種系演化以及特定遺傳結(jié)構(gòu)的形成原因提供重要證據(jù)，與哺乳類動(dòng)物線粒體DNA的系統(tǒng)分析還將對(duì)哺乳類動(dòng)物的系統(tǒng)演化提供一定證據(jù)[7-9]。

常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳檢測(cè)方法有形態(tài)學(xué)方法、免疫學(xué)方法、生物化學(xué)標(biāo)記方法等，隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，分子遺傳標(biāo)記技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳檢測(cè)中得以廣泛應(yīng)用，其中包括限制性酶切片段多態(tài)性標(biāo)記(RFLPs)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 標(biāo)記(RAPD)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(AFLP)、微衛(wèi)星DNA標(biāo)記(Microsatellite DNA)、單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記(SNPs)等[10]。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記多態(tài)性豐富，均勻分布于哺乳動(dòng)物基因組，檢測(cè)技術(shù)成熟，穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，可比性強(qiáng)，已成為目前動(dòng)物遺傳多樣性評(píng)估和遺傳監(jiān)測(cè)研究的首選標(biāo)記[11-13]。

因此本課題以中國(guó)地鼠為研究材料，對(duì)其線粒體全基因組序列進(jìn)行研究，從分子水平確定其在嚙齒類動(dòng)物中的進(jìn)化地位。同時(shí)建立中國(guó)地鼠微衛(wèi)星遺傳檢測(cè)體系，為種質(zhì)資源保護(hù)、群體變異和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等提供研究手段。

2 研究目的

中國(guó)地鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其遺傳背景和遺傳概貌需要清楚明確，目前還沒(méi)有進(jìn)行系統(tǒng)化和規(guī)范化研究。本研究參照近緣物種的線粒體基因組，設(shè)計(jì)特異引物，應(yīng)用降落PCR技術(shù)和生物信息學(xué)方法獲得中國(guó)地鼠線粒體全基因組序列，分析其37個(gè)基因的結(jié)構(gòu)和特征；從分子水平對(duì)嚙齒類動(dòng)物的分類及親緣關(guān)系進(jìn)行研究，對(duì)使用中國(guó)地鼠開(kāi)辟新的動(dòng)物疾病模型途徑和研究多種疾病發(fā)病機(jī)制具有重要價(jià)值。針對(duì)遺傳質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)，采用構(gòu)建文庫(kù)的方法獲得中國(guó)地鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)并開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星引物，并對(duì)SYB1近交群體進(jìn)行檢測(cè)，建立中國(guó)地鼠近交系遺傳質(zhì)量控制體系，為中國(guó)地鼠這一獨(dú)特的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種質(zhì)資源科學(xué)評(píng)估、妥善保存和合理開(kāi)發(fā)利用提供了新型的遺傳標(biāo)記。

3 創(chuàng)新點(diǎn)

本項(xiàng)目系統(tǒng)研究了中國(guó)地鼠線粒體全基因組和微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記，首次測(cè)定中國(guó)地鼠線粒體全基因組序列，建立了一套中國(guó)地鼠線粒體基因組及相應(yīng)序列的測(cè)定方法，比較分析了中國(guó)地鼠與金黃地鼠、大鼠、小鼠、田鼠的線粒體的基因組結(jié)構(gòu)，闡明其基因組成、基因排列和基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)與金黃地鼠的序列同源性較高，結(jié)構(gòu)相似。利用GenBank中的線粒體序列，分析其序列差異，構(gòu)建分子系統(tǒng)關(guān)系，探討中國(guó)地鼠、金黃地鼠、田鼠、小鼠、大鼠的進(jìn)化關(guān)系。成功構(gòu)建了中國(guó)地鼠基因組微衛(wèi)星富集文庫(kù)，篩選出一套多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標(biāo)記；并對(duì)SYB1近交系中國(guó)地鼠進(jìn)行檢測(cè)，為中國(guó)地鼠遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳監(jiān)測(cè)研究奠定了基礎(chǔ)。

4 討論

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)線粒體基因組的13個(gè)蛋白編碼基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因和1個(gè)D-loop區(qū)進(jìn)行基因定位，分析37個(gè)基因結(jié)構(gòu)和特征；利用GenBank所得到的線粒體序列，分析中國(guó)地鼠、金黃地鼠、田鼠、小鼠、大鼠的序列差異，構(gòu)建分子系統(tǒng)關(guān)系，從比較醫(yī)學(xué)角度為中國(guó)地鼠在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。本研究建立的微衛(wèi)星遺傳檢測(cè)方法與形態(tài)學(xué)檢測(cè)法、生化標(biāo)記檢測(cè)法、免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)法等傳統(tǒng)的遺傳檢測(cè)方法相比，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確、更可靠。尤其針對(duì)近交系動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，如果用一定數(shù)量的微衛(wèi)星引物進(jìn)行擴(kuò)增，基因型均表現(xiàn)相同，說(shuō)明基因位點(diǎn)純合，達(dá)到近交系的要求；如果基因型表現(xiàn)不同，說(shuō)明在繁育過(guò)程中可能發(fā)生了遺傳變異或遺傳污染[14,15]。

因此，應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記方法更適用于近交系動(dòng)物的遺傳檢測(cè)，可以進(jìn)行純合位點(diǎn)的判定，還能分析基因位點(diǎn)的變異情況。本研究獲得的中國(guó)地鼠線粒體微衛(wèi)星遺傳質(zhì)量控制體系不僅豐富和完善了我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，還為中國(guó)地鼠的繁育與開(kāi)發(fā)利用等提供了技術(shù)支撐。

[1] 劉田福.中國(guó)地鼠山醫(yī)群體近交系的培育[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理，2003，20(增刊)：22-24．

[2] 秦川.醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008，94．

[3] 宋國(guó)華，林強(qiáng)，岳文斌，等．中國(guó)地鼠線粒體基因組序列分析與分子進(jìn)化[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2012，20(1)：70-74．

[4] 宋國(guó)華，陳朝陽(yáng)，龐文彪，等．五種嚙齒類動(dòng)物mtDNA蛋白編碼基因序列變化的比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2013，21(2)：70-74．

[5] 陳剛，杜衛(wèi)東，曹慧敏．線粒體DNA 突變與相關(guān)人類疾病[J]．遺傳，2007，29(11)：1299-1308．

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Study of mitochondrial genomes and molecular genetic marker of microsatellite in chinese hamster

SONG Guo-hua，CHEN Zhao-yang，LIU Tian-fu，PANG Wen-biao， Gao Ji-ping，ZHANG Rui-hu，LIU Mao-lin，F(xiàn)AN Lin-hua

(Shanxi Medical University，Laboratory Animal Center，Shanxi Key Laboratory of Experimental Animal Science and Human Disease Animal Model，Taiyuan 030001，China)

Chinese hamster is an important laboratory animal in medical and biological researches，but the molecular genetic markers research was rarely reported．In our study the base composition，gene structure，genetic evolution and other characteristics of mitochondrial genome of Chinese hamster were analyzed using the methods of bioinformatics and comparative genomics，genetic quality detection system of Chinese hamster were also established．These results would supply genome data for animal models of human diseases，and lay the foundation for scientific evaluation and reasonable utilization．

Chinese hamster；Mitochondrial genome；Phylogenetic relationship；microsatellite；Genetic monitoring

山西省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專項(xiàng)資金(2005k01,2009k02)。

宋國(guó)華(1973-)，女，教授，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳標(biāo)記與疾病動(dòng)物模型。E-mail:ghsongg@hotmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 05-0004-03

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.05.002

2016-10-29