丁苯酞注射液對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及半胱氨酸蛋白酶-3表達(dá)的影響

庫(kù)亞萍 周盛年

(山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250012)

丁苯酞注射液對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及半胱氨酸蛋白酶-3表達(dá)的影響

庫(kù)亞萍1周盛年

(山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250012)

目的 探討丁苯酞(NBP)注射液對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注(IR)損傷的保護(hù)作用及半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3表達(dá)的影響。方法 清潔級(jí)健康SD大鼠60只，按照隨機(jī)數(shù)字表法分成假手術(shù)組(Sham組)、IR組以及NBP組各20只，另將NBP組根據(jù)NBP的用藥劑量分成小劑量組(20 mg/kg)6只、中劑量組(40 mg/kg)7只、大劑量組(80 mg/kg)7只。采用Zea-longa線栓法制作大鼠局灶性IR模型，對(duì)比各組大鼠的腦梗死體積及凋亡細(xì)胞數(shù)，各組大鼠的caspase-3表達(dá)以及NBP組大鼠經(jīng)不同劑量NBP處理后的caspase-3表達(dá)。結(jié)果 NBP組和IR組腦梗死體積及凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯高于Sham組，NBP組明顯低于IR組(P<0.05)。NBP組和IR組皮質(zhì)和海馬的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯多于Sham組，NBP組明顯少于IR組(P<0.05)。中劑量及大劑量組皮質(zhì)和海馬的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯少于小劑量組，大劑量組明顯少于中劑量組(P<0.05)。結(jié)論 NBP對(duì)于大鼠局灶性IR損傷具有較好的保護(hù)作用，還可有效降低caspase-3的表達(dá)，值得臨床重視。

丁苯酞注射液；局灶性腦缺血再灌注損傷；半胱氨酸蛋白酶-3

凋亡是造成腦缺血再灌注(IR)損傷的一個(gè)重要原因，細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制在于腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧現(xiàn)象之后，其細(xì)胞能量代謝作用出現(xiàn)障礙，進(jìn)而生成凋亡刺激因子，并介導(dǎo)相關(guān)蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)〔1〕。有研究提示半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3類型抑制劑可以作為IR損傷的一項(xiàng)新型治療藥物〔2〕。臨床通常將丁苯酞(NBP)作為腦保護(hù)劑用于治療IR損傷，發(fā)現(xiàn)其療效較滿意，該藥物對(duì)腦的保護(hù)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本文擬分析NBP注射液對(duì)大鼠局灶性IR損傷的保護(hù)作用及caspase-3表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇在我院實(shí)驗(yàn)室所飼養(yǎng)的清潔級(jí)健康SD雄性8 w齡大鼠60只，體質(zhì)量200～260 g，平均(235.68±15.23)g。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(Sham組)、IR組及NBP組各20只，另將NBP組根據(jù)NBP的用藥劑量分成小劑量組(20 mg/kg)6只，中劑量組(40 mg/kg)7只，大劑量組(80 mg/kg)7只。試劑與儀器：一抗：兔抗caspase-3多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司，批號(hào)：ab2302)。二抗及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；TTC試劑購(gòu)于美國(guó)的Sigma公司；TUNEL試劑盒購(gòu)于德國(guó)的羅氏公司；石蠟切片機(jī)和光學(xué)顯微鏡購(gòu)于日本的Olympus公司；熒光定量PCR儀選擇德國(guó)生產(chǎn)的Rotor-Gene 3000型。

1.2 方法

1.2.1 制作動(dòng)物模型 IR組及NBP(石藥集團(tuán)恩必普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)：050302)組的大鼠予以10%的水合氯醛行腹腔注射，待其麻醉之后按Zea-longa線栓法〔3〕的步驟制作大鼠右側(cè)腦部中動(dòng)脈的局灶性IR模型。而Sham組只分離大鼠的右側(cè)頸總、頸外及頸內(nèi)動(dòng)脈，無(wú)需插入線栓。IR組及NBP組在缺血2 h后移除線栓而后再灌注約24 h。NBP組中的高、中、低劑量亞組在缺血2 h并拔線之后立刻予以80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg的NBP注射液行1次腹腔注射，IR組和Sham組可注射等量的生理鹽水，上述步驟的實(shí)驗(yàn)過(guò)程均需滿足動(dòng)物倫理學(xué)的規(guī)范。

1.2.2 腦梗死體積的檢測(cè) 每組大鼠麻醉后斷頭取腦，并在-20℃的冰箱內(nèi)速凍約15 min，而后行2 mm厚冠狀位切片共5片，放置在2%的(TTC)溶液內(nèi)，于37℃的恒溫箱孵育約30 min，利用4%的多聚甲醛進(jìn)行固定，最后用數(shù)碼相機(jī)拍照并通過(guò)圖像分析軟件對(duì)腦梗死體積的百分比進(jìn)行計(jì)算。其中腦梗死體積的百分比=右側(cè)腦梗死的面積×切片的厚度/右側(cè)腦組織的總體積×100%。

1.2.3 凋亡細(xì)胞數(shù)的檢測(cè) 利用TUNEL法進(jìn)行檢測(cè)，麻醉后將大鼠開胸并暴露心臟，自心尖插進(jìn)粗針頭，而后剪開右心耳使其開放靜脈血，利用生理鹽水迅速進(jìn)行心臟灌流，待右心耳有清液流出之后利用4%的多聚甲醛行灌流固定，之后快速斷頭取腦，利用4%的多聚甲醛給予24 h固定。在視交叉后約2 mm位置切取3 mm冠狀位腦部組織塊，進(jìn)行常規(guī)包埋，而后切取4 μm厚的腦片。將石蠟切片脫蠟至水，用3%的過(guò)氧化氫溶液封閉約10 min，在復(fù)合消化酶液及37℃的條件下消化約20 min，再滴入TUNEL混合液，放于37℃下1 h靜置。滴入過(guò)氧化物酶(POD)轉(zhuǎn)化液，在37℃下反應(yīng)約40 min，經(jīng)DAB顯色和蘇木精復(fù)染后以中性樹膠封片。其中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞的判定：細(xì)胞核有固縮濃染，且呈深棕色，相關(guān)細(xì)胞體積變小，形狀不規(guī)則。將每張切片放在高倍顯微鏡下選擇5個(gè)視野，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后取平均值。

1.2.4 caspase-3表達(dá)的檢測(cè) 制備石蠟切片后實(shí)施caspase-3的免疫組化染色，利用SP法進(jìn)行檢測(cè)。一抗是兔抗caspase-3的多克隆抗體(產(chǎn)自英國(guó)的Abcam公司)，二抗及DAB顯色劑產(chǎn)自福州的邁新生物公司。在染色后位于細(xì)胞質(zhì)(核)內(nèi)的棕黃色顆粒即為caspase-3陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞，將每張切片放置在400倍的顯微鏡下，分別在右側(cè)大腦半球的缺血半暗帶區(qū)的皮質(zhì)及海馬區(qū)隨機(jī)選擇10個(gè)視野，對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，而后去平均值。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)比各組大鼠的腦梗死體積及凋亡細(xì)胞數(shù)，各組大鼠的caspase-3表達(dá)及NBP組大鼠經(jīng)不同劑量NBP處理后的caspase-3表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腦梗死體積及凋亡細(xì)胞數(shù)比較 NBP組和IR組的腦梗死體積〔(30.48±10.11)%、(40.17±12.89)%〕及凋亡細(xì)胞數(shù)〔(29.26±2.38)個(gè)/HP，(46.69±2.95)個(gè)/HP〕均明顯高于Sham組(P<0.05)，NBP組均明顯低于IR組(P<0.05)。

2.2 各組大鼠caspase-3表達(dá)對(duì)比 NBP組和IR組皮質(zhì)(7.55±2.51，11.78±4.02)和海馬(31.18±5.82，42.73±9.20)的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯多于Sham組(1.53±1.15，3.56±1.53)(P<0.05)，NBP組均明顯少于IR組(P<0.05)。

2.3 經(jīng)不同劑量NBP處理后的caspase-3表達(dá) 中劑量及大劑量組皮質(zhì)(7.69±1.15，4.38±2.46)和海馬(30.65±2.33，28.20±1.68)的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均明顯少于小劑量組(9.48±1.12，33.49±1.39)，大劑量組明顯少于中劑量組(P<0.05)。

3 討 論

通過(guò)不斷開展有關(guān)缺血性腦血管類疾病發(fā)病機(jī)制以及治療方法方面的研究，該病臨床治療方面進(jìn)展較快，認(rèn)為需針對(duì)腦部受損血管以及細(xì)胞兩方面機(jī)制進(jìn)行聯(lián)合治療，其中溶栓治療就是對(duì)于血管損傷的一項(xiàng)針對(duì)性療法〔4〕。而IR損傷為缺血性腦血管類疾病的一項(xiàng)重要病理生理性階段，IR損傷發(fā)病原因十分復(fù)雜，其會(huì)以氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等形式對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成損傷甚至死亡，發(fā)病機(jī)制主要分為自由基受損和細(xì)胞凋亡以及鈣超載等多種學(xué)說(shuō)。經(jīng)過(guò)多項(xiàng)腦缺血式動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)形態(tài)學(xué)、生化以及基因?qū)W等多個(gè)維度進(jìn)行證實(shí)，在IR損傷過(guò)程中的各重要階段均伴有細(xì)胞凋亡現(xiàn)象〔5〕。因此，對(duì)IR損傷進(jìn)行有效抑制是缺血性腦血管類疾病臨床治療的關(guān)鍵，同時(shí)，保護(hù)腦部神經(jīng)系統(tǒng)，防止細(xì)胞凋亡是該類治療的重點(diǎn)所在。

本研究符合趙秀芹等〔6〕的報(bào)道結(jié)果，提示有IR損傷的大鼠腦梗死體積和凋亡細(xì)胞數(shù)均更多，而經(jīng)過(guò)NBP處理后均明顯減少。筆者認(rèn)為原因主要可能與NBP的腦保護(hù)作用有關(guān)。NBP注射液的活性成分為NBP，是從芹菜籽內(nèi)所提取發(fā)現(xiàn)，通過(guò)人工合成而得的消旋類化合物，其結(jié)構(gòu)與天然芹菜籽內(nèi)的左旋芹菜甲素一致。臨床研究發(fā)現(xiàn)，NBP對(duì)缺血性腦卒中起到修復(fù)中樞損傷效果，有助于改善患者受損神經(jīng)，通常將其用于治療因急性缺血性腦卒中而發(fā)生的神經(jīng)功能受損〔7〕。同時(shí)，多項(xiàng)動(dòng)物藥效學(xué)相關(guān)研究均證實(shí)，NBP能夠?qū)θ毖阅X卒中造成的腦損傷多項(xiàng)病理階段起到有效阻斷作用，并可以抑制腦缺血，減小大鼠發(fā)生缺血性腦梗死總面積，降低腦水腫程度，且對(duì)腦能量代謝以及腦血血區(qū)域內(nèi)的微循環(huán)和血流動(dòng)力學(xué)情況產(chǎn)生改善作用〔8〕。此外，該藥物還可以起到保護(hù)腦神經(jīng)，防止其因IR而受損的效果。其對(duì)IR受損腦神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)及修復(fù)，主要是以對(duì)細(xì)胞凋亡通路進(jìn)行干擾的方式來(lái)完成。通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡類調(diào)控基因正常表達(dá)，來(lái)獲得抑制神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡作用的效果。同時(shí)，本文符合王鵬等〔9〕的報(bào)道結(jié)果，提示caspase-3參與到了大鼠的IR損傷過(guò)程中，且caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)越少，則IR損傷的病情越輕。原因主要與caspase-3的凋亡調(diào)控路徑有關(guān)。細(xì)胞凋亡在IR損傷多個(gè)環(huán)節(jié)均有參與，并且是腦神經(jīng)功能受損的根本原因。因此，抑制腦神經(jīng)細(xì)胞大量凋亡是治療IR損傷的關(guān)鍵。其凋亡根本分子機(jī)制為，腦神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生缺血以及缺氧，進(jìn)而出現(xiàn)能量代謝障礙，生成多種凋亡刺激類因子，例如自由基以及一氧化氮等。在上述刺激因子共同作用之下，和凋亡有關(guān)的基因會(huì)介導(dǎo)發(fā)生蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)。目前已經(jīng)證實(shí)，caspase依賴途徑為非常關(guān)鍵的一種凋亡路徑，其中caspase-3為該級(jí)聯(lián)中最重要的一種凋亡蛋白酶〔10〕。同時(shí)，caspase-3除了為細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)一項(xiàng)必經(jīng)之路外，還是凋亡的一個(gè)關(guān)鍵酶以及執(zhí)行者。因此，caspase-3在整個(gè)IR損傷中發(fā)生神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況的關(guān)鍵，臨床使用caspase-3相關(guān)抑制劑治療，可作為新的治療方向。

本文還提示隨著NBP用藥劑量的增大，大鼠caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的表達(dá)也明顯減少。原因主要是因?yàn)镹BP的應(yīng)用明顯改善了大鼠的腦損傷，進(jìn)而抑制了caspase-3的陽(yáng)性表達(dá)。事實(shí)上，大鼠在發(fā)生IR損傷之后，NBP可有效抑制其梗死灶附近缺血半暗帶區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元中caspase-3的表達(dá)，進(jìn)而阻止神經(jīng)元發(fā)生凋亡，獲得保護(hù)神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的效果；與Nong等〔11〕的報(bào)道相似。

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〔2016-12-28修回〕

(編輯 袁左鳴)

周盛年(1958-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科、腦血管病的研究。

庫(kù)亞萍(1983-)，女，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)病學(xué)、腦血管病研究。

R743

A

1005-9202(2017)05-1087-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.05.021

1 臨沂市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科